Summary
Bu makalede doku lipidomik ve transkriptomik için modüler bir protokol ve inflamasyon ve nöronal aktivitenin altında kalan lipitleri, membran lipitlerini, aşağı akış habercilerini ve lipid fonksiyonu altında bulunan mRNA kodlayıcı enzimleri/reseptörleri hedefleyen nörolojik hastalık fare modellerinde plazma lipidomikleri sunulmaktadır. Örnekleme, numune işleme, ekstraksiyon ve nicelik prosedürleri özetlenmiştir.
Abstract
Lipitler, nörolojik hastalıklara elverişli beyin hakaretleri veya uyaranlar için birincil arayüz görevi görür ve hastalıkların başlangıcını ve ilerlemesini altı çizebilecek çeşitli sinyal veya ligand işlevine sahip lipitlerin sentezi için bir rezervuardır. Genellikle presemptomatik düzeyde değişen lipitler, ortaya çıkan bir ilaç hedefi ve biyobelirteç kaynağıdır. Birçok nörolojik hastalık, kısmen spesifik lipid sinyal sistemleri tarafından modüle edilen yaygın ayırt edici özellikler olarak nöroinflamatikasyon, nörodejenerasyon ve nöronal uyarılabilirlik sergiler. Çeşitli lipitlerin sentezinin birbirine bağımlılığı ve birbiriyle olan ilgisi, nörolojik bağlamların ortak yönlerini ve özgüllüklerini türetmek ve hastalığın başlangıç ve ilerlemesinin mekanistik yönlerinin çözülmesini hızlandırmak için çok yıllı, multienzim ve multireceptor bir analize neden olur. Lipid rollerinin farklı beyin bölgelerine abone olmak, nörolojik bir hastalıkla ilişkili lipid moleküler fenotip ve morfolojinin belirlenmesini ilerletir.
Burada sunulan, belirli bir nörolojik hastalık ve/veya durumla ilgili ayrı beyin bölgelerinden çıkarılan, işlevselliğinin altında bulunan enzimlerin ve mediatörlerin mRNA'sı ile birlikte membran lipitlerinin ve aşağı akış lipit sinyallerinin analizi için uygun modüler bir protokoldür. Doğru karşılaştırmalı lipidomik profilleme sağlamak için, iş akışları ve çalışma kriterleri aşağıdakiler için optimize edilmiş ve standartlaştırılmıştır: i) ilgi alanlarının beyin örneklemesi ve diseksiyonu, ii) birden fazla lipit sinyalinin ve membran lipitlerinin birlikte çıkarılması, iii) çift lipid/mRNA ekstraksiyonu, iv) sıvı kromatografisi çoklu reaksiyon izleme (LC/MRM) ve v) standart mRNA profilleme ile niceleme. Bu iş akışı, fonksiyonel olarak ayrı beyin alt bölgelerinin örneklemesi (yani beyin delme yoluyla) ile elde edilen düşük doku miktarları için elverişlidir, böylece doku heterojenliği ve/ veya hayvan değişkenliği nedeniyle multimoleküler analizde önyargıyı önler. Nörolojik hastalıkların periferik sonuçlarını ortaya çıkarmak ve nörolojik hastalık durumlarının çevirisel moleküler okumalarını oluşturmak, periferik organ örneklemesi, işleme ve bunların sonraki lipidomik analizlerinin yanı sıra plazma lipidomikleri de takip edilir ve açıklanır. Protokol akut epilepsi fare modelinde gösterilmiştir.
Introduction
Lipitlerin işlevindeki son gelişmeler ve nörolojik hastalıkların başlangıcında ve ilerlemesinde rolleri, yeni terapötik hedeflerin ve hastalık mekanizmasının yeni araştırma ve geliştirme mekanlarını açmaktadır1. Kitle spektrometresi görüntüleme ve gelişmiş kütle spektrometresi profilleme gibi modern moleküler görüntüleme teknikleri ile vurgulanan farklı beyin bölgelerindeki lipid bileşimindeki belgelenmiş farklılıklar, lipid araştırması paradigmasını tüm beyinden fonksiyonel olarak farklı ve ayrık beyin bölgelerine kaydırır. Lipid bileşiminin farklı beyin bölgelerinde farklılık göstermesi, fonksiyonel olarak farklı beyin bölgelerinde bir beyin hakaretine veya uyaranlarına yanıt olarak hem membran lipid duyarlılığının hem de aşağı akış lipid sinyalinin yeni kavramsallaştırılmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, lipid protokolleri, daha yüksek uzamsal çözünürlük tespiti ve nicelleştirme için düşük doku miktarlarının zorluğunu ele almak için yeni gelişmeler ve eş zamanlı olarak hücre zarlarının ve sinyal yollarının birden fazla lipit bileşeninin analizini gerektirir. Ayrıca, seviyelerinin ve işlevlerinin düzenlenmesinde rol oynayan enzimlerin, lipid ligandlarının ve reseptörlerin belirlenmesi, nörolojik bir hastalıkta etkilenen sinyal yollarını aydınlatmak ve patofizyolojik bağlamda yeni mekanistik araştırmalara rehberlik etmek için çok önemlidir.
Artan beyin mekansal çözünürlüğüne ek olarak, yeni nörolipidomik yaklaşımların geliştirilmesine meydan okuyan iki büyük zorluk vardır. İlk olarak, lipid sinyal molekülleri tipik olarak membran constitutive lipits ile karşılaştırıldığında çok düşük bolluğa sahip. İkincisi, lipidom yüksek yapısal heterojenlik sergiler, tek bir analitik yaklaşım kullanarak incelenerek zor. Bu nedenle, ekstraksiyon ve analitik yöntemler farklı lipit kategorilerine göre uyarlanır ve genellikle farklı doku örneklerinde gerçekleştirilir.2. Av tüfeği lipidomik yöntemleri3 membran lipitlerin geniş bir profilini hızla ortaya çıkarmak için mükemmel araçlardır, hedeflenen keşif ve nicelik kütle spektrometrik yöntemlerinin sağladığı artan duyarlılık ve seçicilik, aşağıdakiler de dahil olmak üzere düşük bol sinyal lipitlerinin araştırılması için sermayelendirilir: i) enflamatuar lipitler ve ii) endocannabinoidler (eBB'ler), amino asit bağlantılı lipitler gibi nöronal aktivitenin modülasyonunda yer alan lipitler, ve saire.4,5. Nörolojik hastalık modellerinin beyin bölgelerinde meydana gelen hem hücre zarındaki hem de sinyalizasyon seviyesindeki lipit değişikliklerini kapsamak için, tipik olarak lipid ekstraksiyonu ve analizi, farklı hayvan partilerinden veya farklı yarımkürelerden elde edilen veya daha büyük bir doku bölgesini birden fazla parçaya ayırarak farklı doku örneklerinde gerçekleştirilir. Enzim reseptörlerinin mRNA seviyeleri de ilgi çekici olduğunda, incelemeleri tipik olarak farklı bir doku örneğinin tedarikini gerektirir. Örneğin, membran lipitleri, endojen kannabinoidler ve mRNA'nın araştırılması üç farklı doku örneği gerektirir (örneğin, iki lipid ekstraksiyon yöntemi için iki örnek-membran lipitleri ve sinyal lipitleri- ve sonraki iki lipid analiz yöntemi- ve mRNA analizi için bir örnek). İnflamatuvar lipitlerin ve endojen kannabinoidlerin araştırılması sırasıyla iki farklı doku örneği, ekstraksiyon yöntemleri ve analiz yöntemleri gerektirir. Başka bir örnek, mRNA'nın ve bir beyin yumruğu veya lazer mikrodiseksiyon örneğindeki herhangi bir lipit kategorisinin araştırılmasıdır, bu da sonuç olarak beyin (alt) bölgesi başına iki farklı hayvanın iki örnek temin etmesini gerektirir. Biyolojik değişkenlik ve/veya doku heterojenliğinden kaynaklanan bu gibi durumlarda sonuçların değişkenliğinin ve/veya zayıf tekrarlanabilirliğinin önemli ölçüde sıklıkla ortaya çıkar. Özellikle beyindeki yüksek uzamsal çözünürlükte meydana gelen bu pratik multimoleküler analiz sınırlamaları tarafından yönlendirilen üç modüllü bir nörolipidomik protokol, şunları kapsayacak şekilde tasarlanmıştır: 1) enflamatuar lipitlerin (örneğin, eikosanoidler (eiCs)) ve eB'ler gibi nöronal aktivitenin modülasyonunda rol oynayan lipitlerin LC/MRM tarafından birlikte çıkarılması ve birlikte analiz2; 2) fosfolipidlerin (PL'ler) ve eB'lerin sonraki multiscan LC /MRM ve öncül/nötr kayıp tarama analizi ile birlikte çıkarılması2; ve 3) membran (fosfo)lipitler ve eB'lerin yanı sıra mRNA'nın çift ekstraksiyonu, sonraki LC / MRM ve qPCR veya RNA dizileme analizi ile6. Nörolojik bir hastalıkta ele alınacak biyolojik soruya ve ilgi çekici beyin bölgesine bağlı olarak, birinci ve ikinci protokolün veya birinci ve üçüncü protokolün bir kombinasyonu, yaklaşık 4 mg ağırlığındaki dokular için aynı doku örneğine uygulanabilir. Birinci ve üçüncü protokoller 2 mg civarındaki dokular için bağımsız olarak uygulanabilir. İkinci protokol 0,5 mg kadar hafif dokular için uygulanabilir. Seçilen nörolipidomik protokol modülünden bağımsız olarak, doku örneklemesi ve ön analitik işleme, beyin izolasyonu ve bölge diseksiyonu ve hayvan modelinden ödün vermek için prosedür protokolün üç modülü için de standartlaştırılmış ve aynıdır. Nörolojik hastalıkları araştırmamızda, hastalığın patolojik sonuçlarıyla ilgili periferik organlar da her zaman bu modüler protokoller kullanılarak toplanır ve analiz edilir. Ek olarak, plazma lipidomik için düzenli olarak kan örneklenerek, prospektif çeviri uygulamalarına yönelik nörolojik hastalıkların okuma aracı olarak hizmet edilir. Burada sunulan modüler lipidomik protokolü çok yönlüdür: daha büyük doku miktarlarına ölçeklendirilebilir ve hemen hemen her doku tipi ve hastalığı için kolayca uygulanabilir. Modüler protokolün uygulanması için (Şekil 1) nörolojik hastalıklarda, travmatik beyin hasarı, Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı veya epilepsi gibi nörolojik bozuklukların standartlaştırılmış kemirgen başlangıç ve ilerleme modeli uygundur.
Bu protokoller, insan temporal lob epilepsisine (TLE)8,9,10,11 benzerliği nedeniyle klinik öncesi çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir model olan epilepsinin kainik asit (KA) kaynaklı fare modelinde epilepsinin akut fazında doku lipidomu ve/veya transkriptom değişiklikleri üzerinde çalışmak için kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Bu protokoller kullanılarak, Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 gibi ilaçların terapötik potansiyeli aynı epilepsi fare modelinde değerlendirildi. Çalışmada, beyin ve periferde yüksek ve düşük mekansal çözünürlükte, maksimal akut nöbet yoğunluklarının zaman noktasında (60 dk posteizür indüksiyonunda) ve PEA ile subkronik ve akut tedavide dört farklı zaman noktasında (20, 60, 120 ve 180 dk) lipid ve mRNA değişiklikleri belirlendi. Tedavi edilmemiş KA enjekte edilmiş farelerin plazma, beyin ve periferik organları, akut ve subkronik olarak BEZELYE ile tedavi edilen farelerin yanı sıra araç ve BEZELYE aracı kontrol fareleri her zaman 12,13 noktasında toplanmış ve bu moleküler analiz ile araştırılmıştır. Moleküler veriler, akut epilepsi evresinin ilerlemesini ve PEA'nın hafifletme potansiyelini çözmek için nöbet skorlamasıyla elde edilen davranışsal fenotiplerin yanı sıra nörodejeneratif süreçler hakkında immünhistokinetri türetilmiş verilerle ilişkiliydi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Avrupa Topluluğu Konseyi'nin 22 Eylül 2010 (2010/63EU) direktifine uygundur ve Almanya'nın Rheinland-Palatinate eyaletinin yerel hayvan komitesi tarafından onaylanmıştır (dosya referansı: 23 177-07/G16-1-075).
1. Akut ve profilaktik olarak tedavi edilen KA kaynaklı epilepsinin hayvan modeli
- Nöbet indüksiyonu, tedavisi ve davranışsal puanlama gerçekleştirin.
- Fareleri (grup başına minimum n = 6 fare) tek kafeslerde ayırır.
- Nöbet-indüksiyon enjeksiyon çözeltisini ve ilgili aracı hazırlayın (bkz. Tablo 1), ayrıca tedavi enjeksiyon çözeltisi ve ilgili araç (bkz. Tablo 2).
- Farelere grup kimliklerine göre anestezi olmadan intraperitoneal (yani) (10 mL/kg fare vücut kütlesi) enjekte edin: hastalık, tedavi veya tedavi edilen araç (örneğin, KA, BEZELYE ile tedavi edilen KA ve iki araç grubu). Bkz. Şekil 2, Tablo 1 ve Tablo 2.
- Davranışı aşağıdaki standart nöbet yoğunluğu ölçeğine göre izleyin ve puanlandırın: 0 = yanıt yok; 1 = hareketsizlik ve bakış; 2 = ön ayak ve/veya kuyruk uzatma, sert duruş; 3 = tekrarlayan hareketler, kafa sallama; 4 = yetiştirme ve düşme; 5 = sürekli yetiştirme ve düşme; 6 = şiddetli klonik tonik nöbetler; 7 = ölüm14,15 (Şekil 3).
- Lipidomik ve transkriptomik analiz için fedakârlık prosedürü uygulayın.
- Dört zaman noktasında (örneğin, sırasıyla 20, 60, 120 ve 180 dk ka veya araç enjeksiyonu sonrası), aşağıdaki grupların her birinden altı fare kurban edin: PEA tedavi edilen, BEZELYE tedavisi görmeyen epileptik araç 1 ve araç 2, IACUC onaylı protokolleri izleyerek.
- Her zaman noktasına ulaşıldıktan on saniye sonra, fareleri bir cam bölmede izoflurane batırılmış bir doku kullanarak uyuşturun. Cam hazneyi yavaşça devirirken hareket edememe ile belirtilen sağ refleksin kaybı ile anesteziyi onaylayın. Cerrahi makas kullanarak farelerin kafasını kopar ve plazma, beyin ve periferik organları toplayın (bkz. adımlar 2.2.2−2.2.4).
DİkKAT: İşlemlerden ödün vermek için etik düzenlemeler yerel hayvan komiteleri arasında farklılık gösterir. Yerel hayvan komitesi tarafından yayınlanan yönetmelikleri kontrol ettiği ve takip ettiğinden emin olun.
- İmmünohistokmetri analizi için fedakârlık prosedürünü izleyin.
- İmmünohistokimyasal boyama13 için, davranışsal olarak aşağıdaki grupların her birinden üç fare puan: BEZELYE tedavisi, BEZELYE tedavi edilmemiş epilepsi ve araç grupları, tüm zaman kursu boyunca (180 dk).
- 5 gün sonra fareleri kurban edin ve perfuse edin. Fareleri derinlemesine uyuşturun (fare grupları için 1.3.1 adımına bakın) i.p. pentobarbital (100 mg/kg) ve buprenorfin (0.1 mg/kg) enjekte ederim. Derin anesteziyi, tonlar arasındaki refleks kaybı ile onaylayın.
- Fareyi bir polistiren plakaya sabitlayın ve ince makas ve standart tostiki kullanarak toraksı hemen açın. Kelebeği sol kalp ventrikülüne ayarlayın ve ince makas kullanarak sağ kulakçık kesin.
- Pompanın hızını ve basıncını 2−3 mL/dk hız ile sabit bir peristaltik akışa ayarlayın. ~5 dakika boyunca buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfuse. Gerekirse kelebeği değiştirin.
NOT: Uygun perfüzyon ile iç organlar (dalak hariç) 1−2 dakika içinde beyazlatmaya başlar. - Perfüzyonu ~5 dakika boyunca buz gibi %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisine geçirin. 2.2.2 adımında açıklandığı gibi tüm beyinleri izole edin ve 4 °C'de% 4 PFA çözeltisinde 24 saat boyunca sabitlenin.
- Beyinleri 4 °C'de 48 saat boyunca% 30 sakkaroz çözeltisinde kuluçkaya yatırın. Kalan sakkarotu kuru bir kağıt mendille çıkarın ve beyinleri metal bir plakada (-80 °C) dondurun. Boyama işlemleri için beyinleri -80 °C'de saklayın13.
2. Lipidomik/transkriptomik analiz için örnekleme prosedürleri
- Örneklemeye hazırlanın.
- 4 °C'ye plazma örneklemesi için ön soğutma EDTA tüpleri. Santrifüj ve girdap aparatını 4 °C'ye çıkarın. Alüminyum folyo ile kaplı metal plakayı (donmuş beyni ve/veya diğer ilgi dokularını tutturmak için) kuru buzun üzerinde (-80 °C) ön soğutma. Plazma aliquots, dondurulmuş doku ve beyin toplama için kuru buz (-80 °C) üzerinde etiketli 2 mL ve 5 mL tüpleri ön soğutma. EIC'ler gibi ışığa duyarlı molekülleri korumak için kehribar tüpler kullanın.
- Doku örnekleme ve izolasyon ekipmanlarını (cerrahi makas, düz keskin ince makas, düz pürüzsüz standart forseps, ayna kaplamalı ince forseps, kavisli forseps ve spatula, polistiren köpük plaka ve sabitleme için iğneler) bir dezenfektanla (örn. %70 etanol) temizleyin.
- Örnekleme protokolleri
- Örnekleme sırasını belirleyin.
- Önceden pişirilmiş 1 mL EDTA tüplerinde kafa kesmeden hemen sonra kan toplayın (bkz. adım 2.2.3).
- Tüm beyni çıkarın ve çıkarıldıktan hemen sonra dondurun. Bu adım 1−2 dakika sürecektir. Daha fazla işlem için donmuş beyinleri -80 °C'de saklayın (bkz. adım 2.2.2).
- Beyin çıkarılmasından 5 dakika sonra ilgilendirici çevre organlarını (örneğin akciğer, kalp, karaciğer) çıkarın ve daha fazla işlem için -80 °C'de dondurup saklayın (bkz. adım 2.2.4).
- Diseksiyon veya delme işlemleri için beyni çıkarın. Bu işlem 1−2 dk/beyin sürer.
- Kafa kesmeden sonra (bkz. adım 1.2), ince makas kullanarak ciltte bir orta çizgi kesisi yapmaya başlayın. Deriyi gözlerin üzerine çevirerek kafatasını serbest bir şekilde serbest bırakmaya devam edin. Kafatasının tepesine ulaşın ve intraparietal kemik seviyesinden başlayarak küçük bir kaudal kesi yapın. Beyni kesmekten kaçının.
- Beyin çıkarma işlemini kolaylaştırmak için kafatasının en ön kısmını gözlerin arasında sıkıca kesin. Kavisli dar desenli mansiyonlar kullanarak parietal kemiğin bir tarafını eğin ve ayrılın. Diğer taraf için son adımı tekrarlayın.
- Beyin menenjitlerini çıkarın. Beynin ön kısmının (yani koku ampulü) altına bir spatula kaydırın ve beyni hafifçe yukarı doğru eğin. Optik ve diğer kraniyal sinirleri kırmak için spatulayı daha aşağı kaydırın.
- Beyni kafatasından kaldırın ve tüm beyni hemen önceden soğmuş (-80 °C) metal bir plaka üzerinde dondurun ve ventral tarafı metal plakaya bakacak şekilde (sırt yukarı).
- Beyin bölgelerinin diseksiyonuna veya delme prosedürüne kadar beyinlerin tamamen donmasına ve önceden soğulmuş 5 mL tüplere aktarılmasına izin verin ve -80 °C'de saklayın (bkz. adımlar 3.1. ve 3.2).
- Plazma örneklemesi gerçekleştirin.
- Spike, 10 μL taze hazırlanmış indometasin seyreltme ile EDTA tüplerini 10 μM hedef konsantrasyonuna önceden havalandırdı.
- Vücudun önceden soğumuş EDTA tüplerine maksimum 1 mL kan hacmine hafifçe sıkarak kafasının kesilmesinden hemen sonra gövde kanını toplayın.
NOT: Uygun tansiyon durumunda sıkma gerekmez. Kan hacmi 1 mL'den azsa, uygun kan akışını sağlamak için izofluran inkübasyon süresini azaltın. - Hemen 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da kan tüplerini santrifüj edin.
- Elde edilen üst plazma fazını çıkarın ve çok yıllı analiz amacıyla aliquot önceden soğmuş 2 mL tüplerdeki plazma hacimlerini aşağıdaki gibi tanımladı: eBC/eiCs analizi için 50 μL, PC analizi için 30 μL ve kalan plazma hacmi yedek örnek olarak veya diğer analiz türleri için.
- Plazma örneklerini daha fazla ekstraksiyon için -80 °C'de saklayın (bkz. adımlar 4.1.2 ve 4.1.4).
- Periferik organ örneklemesi gerçekleştirin.
NOT: Tek tek organları, bağ dokularını ve/veya kan damarlarını tanımlamak için hayvan araştırmacılarının katıldığı zorunlu kurslar (FELASA) için sağlanan fare anatomisi referanslarını16 ve belgeleri kullanın.- İğneler kullanarak organ çıkarma işlemini kolaylaştırmak için fare gövdesini hareketsiz hale getir. Pubisun yüksekliğinde düz keskin bir makas kullanarak ventral bir orta hat kesisi yapın. Karın boşluğunu açmak için keserken karın duvarını sabitlemek için künt standart tokmaklar kullanın.
- Künt tokmaklar kullanarak karın organının çıkarılmasına izin vermek için cildi hareketsiz hale getirmek. Kalp veya akciğer çıkarılması için meme mağarası yönünde medial kesime devam edin. İnce kümesler kullanarak akciğeri ve/veya kalbi çıkarın.
- Kanamayı önlemek için meme boşluğunu dikkatlice açın. Organı kesmeden ilgili organı tutturarak bağ dokularını ve kan damarlarını kesin.
- Doku parçalarını hemen önceden havalanmış metal plakalara (-80 °C) aktarın ve tamamen donmaya bırakın. Doku parçalarını önceden havalandırılmış tüplere aktarın ve daha fazla işlem için -80 °C'de saklayın (bkz. adım 4.1).
- Örnekleme sırasını belirleyin.
3. Biyolojik malzeme işleme
NOT: EBC/eiC'lerin ortak ekstraksiyonu için ekstraksiyon tüpleri olarak 2 mL kehribar tüp kullanın ve her tüpe yedi ön soğutmalı çelik top ekleyin. PL/eB'lerin ortak ekstraksiyonu ve çift lipid ve RNA ko-ekstraksiyonu için, seramik boncuklarla çivilenmiş 2 mL RNA içermeyen ekstraksiyon tüpleri kullanın (Malzeme Masası).
- Beyin diseksiyonu ve periferik organ işleme gerçekleştirin.
NOT: Diseksiyon için beynin görünürlüğünü artırmak için büyüteç lambaları kullanın.- Süper ince uçlu tokslar da dahil olmak üzere cerrahi aletleri% 70 etanol ile 2x temizleyin.
- Donmuş beyinleri -80 °C'den önceden soğumuş fizyolojik tampon içeren bir Petri kabına aktarın (pH 5.5) Petri kabının 4 °C'de olduğundan emin olun. Beyinlerin diseksiyona izin vermek için tamamen çözülmesine izin verin. Eleps kullanarak dikkatlice test edin.
DİkKAT: Beyinleri çözülme için gerekenden 4 °C'de tutmayın. - Buz üzerinde bir metal plakayı (4 °C) öncool ve buz gibi fizyolojik tampona (pH 5.5) batırılmış ıslak dokularla örtün ve ventral tarafı olan beyni dikkatlice buz üzerinde önceden soğmuş (4 °C) metal bir plakaya aktarın. Buz gibi fizyolojik tampona batırılmış ıslak dokularla örtün (pH 5.5).
- Süper ince uçlu uzun uçlu tipler kullanarak beyin bölgelerini maksimum 5 dakika içinde parçalara çıkarın. Hipotalamus (HYP) ile başlayın ve sağ tarafa devam etmek için sırt tarafını yukarı çevirin. Hipokampus (HCr), prefrontal korteks (PFCr), striatum (STRr) ve serebral korteksi (cCTXr) izole edin. Sonra sol tarafı parçalara ayrılın. Hipokampus (HCl), prefrontal korteks (PFCl), striatum (STRl) ve serebral korteksi (cCTXl) izole edin. Beyincik ve talamik bölgeyi parçalara ayrıştırın. Beyin bölgesi tanımlaması için yayınlanmış anatomik referansları16,17 kullanın.
- Parçalanmış her parçayı doğrudan alüminyum folyo kaplı, önceden solumuş metal plakaya (-80 °C) aktarın. Etiketli önceden solumuş 2 mL tüplerde izole edilmiş beyin bölgelerinin dondurulmasına ve aktarılmasına izin verin.
- Doku parçalarını bir doku pulverizörü (-80 °C'de) kullanarak pulverize edin ve dokunun çözülmesini önleyin. Soğuk odada, seramik boncuklar veya çelik toplar içeren etiketli, önceden soğmuş ekstraksiyon tüplerinde aliquot doku tozu. Çift lipidomik/transkriptomik analiz için soğuk odadaki doku tozu aliquotlarını tartın. Sadece lipidomik analiz için doku ağırlığına veya protein içeriğine normalleşme arasında seçim yapın. İkincisi için, doku tartımı yapmadan daha fazla ilerleyin.
- Periferik organ dokularını maksimum 20 mg ağırlığında parçalar halinde kesin. Adım 3.1.6'da olduğu gibi doku toz haline getirme işlemine devam edin.
- Doku örneklerinin çıkarılmasına devam edin (bkz. adımlar 4.1.1, 4.1.3 veya 4.1.5) veya tüpleri daha sonra ekstraksiyon için -80 ° C'de saklayın.
NOT: Çalışma tasarımı izin verirse beyin matrisi de kullanılabilir. Bununla birlikte, yöntem ayrık ve sınırlı sayıda beyin bölgesi için daha uygundur ve yukarıda belirtilen tüm beyin bölgelerini belirlenen zaman dilimi içinde parçalamak ve izole etmek pratik değildir.
- Beyin delme işlemi gerçekleştirin.
- Donmuş beyinlerin tamamını kriyostattaki montaj sistemine (Malzeme Masası) monte edin. Kalınlığı 50 μm olarak ayarlayın ve ilgilendiğiniz bölgeye yakın kırpma modunda dilimleyin.
- İlginin alt kısmını yerelleştirmek için toluidin mavisi (%0,1−1) kullanarak beyin dilimini (18−20 μm) lekeleyin. Delilecek ilgi çekici bölgeleri belirlemek için mikroskop kullanarak lekeli dilimleri inceleyin. Uygun beyin anatomik bölgelerini bulmak için referans olarak fare atlası kullanın16. Önceden soğutmalı tüplerdeki numune korselerini kullanarak 0,8−1,0 mm çapında yumruklar alın.
- Donmuş zımbaları soğuk odada seramik boncuklar veya çelik toplar içeren etiketli, önceden soğmuş 2 mL ekstraksiyon tüplerinde tartın. EBC'ler ve eiCs ortak ekstraksiyonu için kehribar tüpler kullanın.
- Ekstraksiyonu başlatın (bkz. adımlar 4.1.1, 4.1.3 veya 4.1.5) veya daha fazla ekstraksiyon için tüpleri -80 °C'de saklayın.
- Plazma işlemeyi gerçekleştirin.
- Donmuş plazma örneklerini buza (4 °C) yerleştirin ve çözülmesine izin verin (~20 dk).
- Ekstraksiyona başlamadan önce plazmanın tamamen çözdök olduğundan emin olun.
- Plazma çıkarma prosedürüne devam edin (bkz. adımlar 4.1.2 veya 4.1.4).
NOT: Plazma örnekleri ekstraksiyona kadar -80 °C'de kalmalıdır. Çözülme ve yeniden donma döngülerinden kaçının.
4. Ekstraksiyon prosedürleri
- Sıvı-Sıvı (LLE) lipid ko-ekstraksiyon protokollerini gerçekleştirin.
- Beyin parçalarından, yumruklardan veya doku tozu örneklerinden EBC'lerin ve eiC'lerin birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
NOT: Prosedür boyunca doğru pipetleme gereklidir.- Doku örneklerini ve yedi çelik topu içeren ekstraksiyon tüplerini buza (4 °C) yerleştirin. İç standartları içeren 600 μL buz gibi MTBE ve 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) ekleyin. Analiz için son hacimdeki iç standartların hedef konsantrasyonu (50 μL) aşağıdaki gibidir: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 ve PGD2-d4 için 5 ng/mL; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; Sırasıyla 20-HETE-d6 ve TXB2-d4.
- 400 μL 0,1 M formik asit ekleyin ve bir doku lyser (30 s-1 dk) ile homojenize edin. Homojenatı 4 °C'de 5.000 x g'da 15 dakika santrifüj edin. Üst organik fazın transferini kolaylaştırmak için sulu alt fazın -80 °C'de 10 dakika donmasına izin verin.
- Organik fazı yeni tüplere aktarın. 37 °C'de nazik bir N2 akışı altında buharlaşın ve daha fazla analiz için 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) olarak yeniden inşa edin.
- Daha fazla protein içeriği analizi için sulu fazı -20 °C veya -80 °C'de saklayın.
- Plazma örneklerinden eBC'lerin ve eiC'lerin birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
- Plazma aliquotlarını 4 °C'de çözün. İç standartları içeren 800 μL MTBE ve 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) ekleyin (doku analizi için kullanılanlara benzer şekilde, bkz. adım 5.1.1). Referans plazma örneklerini kullanarak spiking için dahili standart konsantrasyonu optimize edin.
- 2 dakika boyunca 4 °C'de 600 μL 0,1 M formik asit ve girdap örnekleri ekleyin. 4 °C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj örnekleri.
- Organik fazı yeni tüplere aktarın, 37 °C'de hafif bir N2 akışı altında buharlaşın ve LC/MRM analizi için 50 μL ACN/H2O 'da (1:1; v/v) yeniden inşa edin.
NOT: Mümkünse, kurutulmuş eiC özlerinin depolanmasını önleyin ve hemen LC/MRM analizine geçin. Depolama önlenemiyorsa, LC enjeksiyon çözücüslü numunelerle 4° C'de sadece 2−3 gün kısa süreli depolamaya başvurun.
- PL'lerin ve EB'lerin beyin bölgelerinden, yumruklardan veya diğer doku tozu örneklerinden birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
- Doku örneklerini ve seramik boncukları içeren ekstraksiyon tüplerini buza (4 °C) yerleştirin. İç standartları içeren 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) ve 10 μL MeOH ekleyin. Analiz için son hacimde iç standartların hedef konsantrasyonu (100 μL) aşağıdaki gibidir: PC için 150 ng/mL 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; Pİ 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: Sırasıyla 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 ve 3 ng/mL PEA- d4.
- 25 μM tetrahidrolipstatin/URB597 ve 50 μg/mL BHT içeren 200 μL% 0.1 formik asit ekleyin. Doku homojenizatör (Malzeme Masası) ve santrifüj ile 5.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika homojenizon.
- Yeni tüplerde üst organik fazı kurtarın ve 37 °C'de hafif bir N2 akışı altında buharlaşın. 90 μL MeOH'da yeniden inşa edin ve -20 °C veya -80 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
- Lipid ekstresinin bir aliquot'una (4.1.3.3) % 10 H2O ekleyin ve PLs analizi için LC / MS'ye 10 μL enjekte edin. Daha fazla eCB analizi için adım 4.3.5 ile devam edin.
- Özün bir aliquot alın (4.1.3.3), kuruluğa buharlaşmak ve ACN / H2O (1:1; v / v) yeniden inşa etmek. eCB analizi için LC/MS enjeksiyonu için 20 μL kullanın.
- Plazma örneklerinden PL'lerin ve eB'lerin birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
- Plazma aliquotlarını 4 °C'de çözün, iç standartlar (adım 4.1.3'e benzer) ve 1 dakika boyunca 4 °C'de girdap içeren 1.000 μL MTBE/ metanol (10:3; v / v) ve 10 μL MeOH ekleyin.
- 4 °C'de 45 dakika boyunca 250 μL H2O ve girdap ekleyin. 5.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj örnekleri. Üst organik fazı kurtarın, 37 °C'de nazik bir N2 akışı altında buharlaşın ve daha fazla LC / MS analizi için 90 μL metanolde yeniden inşa edin. -20 °C veya -80 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
- PL analizi için, lipid ekstresinin bir aliquot'una % 10 su ekleyin (4.1.2.2).
- ECB analizi için, lipit ekstresinin bir aliquot'una% 10 su ekleyin (bkz. 4.1.4.3), kuruluğa buharlaşır ve% 50 ACN / H2O'da (1:1; v / v) yeniden inşa edin.
- Doku örneklerinden RNA ve lipitlerin (PL'lerin ve eB'lerin birlikte çıkarılması) çift ekstraksiyonu gerçekleştirin.
DİkKAT: RNA bozulmasını önlemek için RNA içermeyen koşullar altında çalışmayı sağlayın.- Doku tozu aliquots veya beyin demetlerini (4 °C'de) çözün ve 5 μM THL/ URB597 içeren 600 μL RLT tamponu ekleyin, 10 μg/mL BHT ve %1 β-mercaptoethanol (homojenizasyon tamponunun son hacminin yüzdeleri için, bkz. adım 4.1) ile birlikte donmuş beyin yumrukları ve seramik boncuklar içeren ekstraksiyon tüplerine 200 μL kloroform.
- PL'ler ve eCB ortak ekstraksiyonu için 10 μL iç standart karışımlı çivi örnekleri (bkz. adım 4.1.3) ve doku homojenizatör (yüksek hız, 20 s) ile homojenize edin.
- Faz ayrımını sağlamak için lysates'i tam hızda 5 dakika ve 4 °C'de yeni santrifüj tüplerine ve santrifüje aktarın.
- Standart RNA ekstraksiyon prosedür kitlerini (Malzeme Tablosu) kullanarak RNA ekstraksiyonu için üst fazı kurtarın ve kullanın. Toplam 50 μL RNase içermeyen su hacminde Elute RNA ve -80 °C'de depolayın.
NOT: Adım 4.1.5.4'teki örnek, uygun yöntemleri ve araçları kullanarak hem RNA dizilimi hem de qPCR için uygundur. - Lipid ekstraksiyonu için alt kloroform içeren fazı kullanın. 4 °C'de 45 dakika boyunca 800 μL MTBE/metanol (10:3; v/v) ve %0,1 formik asit ve girdap 200 μL ekleyin. Üst organik fazı kurtarın ve 37 °C'de hafif bir N2 akışı altında buharlaşın.
- Daha fazla LC/MS analizi için 90 μL metanolde yeniden inşa edin. -20 °C veya -80 °C'de saklayın veya 5.
- Lipid ekstresinin bir aliquot'una %10 H2O ekleyin (yukarıdaki adım 4.1.5.6'ya bakın) ve PL analizi için LC/MS'ye 10 μL enjekte edin. Daha fazla eCB analizi için adım 5.7 ile devam edin.
- Özün bir aliquot alın (yukarıdaki adım 4.1.5.6 bakın) kuruluğa buharlaşmak ve ACN / H2O (1:1; v / v) yeniden inşa etmek. eCB analizi için LC/MS enjeksiyonu için 20 μL kullanın (adım 4.3.5'e benzer).
- Beyin parçalarından, yumruklardan veya doku tozu örneklerinden EBC'lerin ve eiC'lerin birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
5. LC/MRM nitel ve nicel profil oluşturma
- LC çözücü sistemleri, kalibrasyon çözümleri ve kalite kontrol numuneleri hazırlayın.
- PL'ler için, 7,5 mM amonyum format ve% 0,1 TEA içeren mobil faz A: metanol / su (1:1; v / v) hazırlayın. Mobil faz B'yi hazırlayın: 7,5 mM amonyum formatlı ve %0,1 TEA içeren metanol/izopropanol (2:8; v/v). Çözücüleri LC şişelerinde saklayın.
- eCB ve eiC ayrımı için aşağıdaki LC çözücüleri hazırlayın: mobil faz A olarak %0,1 formik asit ve mobil faz B olarak %0,1 formik asit içeren %100 ACN. Çözücüleri LC şişelerinde saklayın.
- Kalibrasyon standartlarını ve iç standartları (Tablo 3) eşkenel veya kullanıcı tanımlı bir konsantrasyonda kullanarak kalite kontrolleri hazırlayın.
- Yedi konsantrasyon noktası ile kalibrasyon eğrileri hazırlayın. Kalibrasyon eğrisi çözümünde ve analiz edilecek numunelerde yükselmek için aynı dahili standart partiyi kullanın.
- Nitel ve nicel lipit profilleme için LC-MRM yöntemini kullanın.
- Ticari yazılımda (örneğin Analist) Yapı Edinme Yöntemi sekmesini açın ve polarite geçişi ile LC/MRM modunu seçin. Nicel profil oluşturma için iyon geçişlerini ( Tablo 3'te verildiği gibi) yöntemde ayarlayın. Yerleşme süresini 50 ms olarak ayarlayın.
- DLL profil oluşturma için aşağıdaki iyon kaynağı parametrelerini ayarlayın: perde gazı = 40 psi; kaynak ısıtıcı sıcaklığı = 550 °C; iyon sprey gerilimi = negatif iyon modunda -4.500 V ve pozitif iyon modunda +5.200 V.
- EBC'lerin ve eiC'lerin birlikte analizi için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: perde gazı = 40 psi; kaynak ısıtıcı sıcaklığı = 550 °C; iyon sprey gerilimi = negatif iyon modunda -4.500 V ve pozitif iyon modunda +4.500 V.
- PL analizi için, kolon ısıtmasını 45 °C'ye ve akış hızını 200 μL/ dak'a ayarlayın ve aşağıdaki degradeyi ayarlayın: min 0 = % 40 B; dk 3 = %40 B; dk 42 = %90 B; dk 43 = %99 B; min 50 = %99 B ve min 52 = %40 B. Enjeksiyon hacmini 10 μL olarak ayarlayın.
- EBC'ler ve eiCs analizi için, kolon sıcaklığını oda sıcaklığında ayarlayın ve aşağıdaki degradeyi ayarlayın: min 0 = % 20 B; min 1 = %20 B; dk 5 = %50 B, dk 12 = %50 B; dk 13 = %90 B, dk 17 = %90 B; dk 17.5 = %20 B; min 20 = %20 B. Enjeksiyon hacmini 20 μL olarak ayarlayın.
NOT: MRM koşulları enstrümantal platformlar arasında değişebilir, bu nedenle parçalanma ve MRM koşulları deneysel olarak çıkarılmalı ve maksimum hassasiyet ve seçicilik elde etmek için gerekirse iyonizasyon parametreleri test edilmeli ve ayarlanmalıdır.
- Toplu iş analizi gerçekleştirin.
- Yapı Edinme toplu işlemini açın ve örnek açıklama, otomatik örnekleyicinin örnek rafındaki konum ve alma yöntemi (adım 5.2 olarak ayarlanır) için gerekli parametreleri doldurun.
- Her zaman analiz başında ve sonunda ve toplu iş içinde kalite kontrollerini ekleyin. Her 25−30 numuneden sonra, parti içine en az üç kalibrasyon eğrisi ekleyin ve her kalite kontrol örneğinden, kalibrasyon eğrisinin ve numune toplu işleminin sonundan sonra tercih edilen bir çözücüye sahip bir yıkama adımı ekleyin.
- LC/MS şişelerinde 4. Numuneleri toplu işte tanımlanan konuma göre LC otomatik örnekleyicinin yükleme raflarına yerleştirin ve numune rafını LC otomatik örnekleyiciye yükleyin.
- Toplu iş gönderin ve sıra çözümlemesi başlatın.
- Lipid nicelemesi
- EBC'ler ve EIC nicelleştirme için ticari yazılımı (örneğin Analist) ve gömülü nicelik modüllerini ve PL niceliği için ticari yazılımı (örneğin, Çok Nitelikli) kullanın.
NOT: İkinci yazılım, özellikle birden fazla analitenin niceliği için bir iç standart kullanıldığında, eBC'ler ve eiC'ler için de kullanılabilir. - Yapı Niceleme Yöntemi'ni açın ve analizler, iç standartlar, MRM geçişleri için parametreleri doldurun ve iç standartları ölçülecek analizlere atfedin (Tablo 3). Minimum tepe yüksekliğini 500 cps olarak ayarlayın.
- Lipid kimlik ataması ve sonraki niceleme için aşağıdaki kriterleri veya kombinasyonunu kullanın6: lipid endojen analizlerin kalibrasyon standartlarıyla ve/veya mevcut olduğunda kısırlaştırılmış iç standartlarla saklanma süresi; hiçbir standart sağlanmayan lipid analitlerinin belirli bir m/z'si için pozitif ve negatif iyon modu parçalanması ile eşleşen parça iyon; izorik ve/veya izobarik yapıları parçalamak için benzer şekilde kullanılan LC koşulları altında lipitlerin literatür kaynaklı elüasyon davranışı; ve mevcut olduğunda, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile LC/MS ve MS/MS analizi, hedeflenen analize benzer LC koşulları kullanılarak (LC/MRM kullanılarak), ilgi çekici endojen lipitlerin kimliğini ve elüasyon davranışını doğru bir şekilde belirlemek için18,19.
- Toplu iş analizinin doğrulanması için aşağıdaki kriterleri kullanın: nicelik doğruluğu ≤ ±20%; regresyon katsayısı ≥0,97 (ideal olarak ≥0,99).
NOT: Hedef moleküllerin güvenilir ve tekrarlanabilir bir analizini sağlamak için biyoanalitik yöntem geliştirme ve doğrulama yönergelerini izleyin.
- EBC'ler ve EIC nicelleştirme için ticari yazılımı (örneğin Analist) ve gömülü nicelik modüllerini ve PL niceliği için ticari yazılımı (örneğin, Çok Nitelikli) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan protokoller kümesi, hayvan modeli seçimi, örnekleme rotası, ekstraksiyon yöntemi ve profil oluşturma gibi amace özgü bir şekilde farklı düzeylerde birleştirilebilir (Şekil 1).
Akut epileptik nöbet durumu boyunca beyin ve periferde lipid düzeyi değişikliklerini belirlemek ve PEA'nın potansiyel antiepileptik etkisini ve beyin ve periferdeki lipidome değişiklikleri üzerindeki etkisini çözmek için, üç deneysel hayvan grubu araç, akut epilepsiyi teşvik etmek için KA ve antiepileptik ilaç adayı olarak PEA ile tedavi edildi. PEA, KA enjeksiyonundan önce i.p. yoluyla uygulandı (örneğin, akut tedavi için tek bir PEA enjeksiyonu ve subkronik tedavi için iki PEA enjeksiyonu ile). Tedaviden 5 gün sonra çoklu moleküler analiz ve/veya immünhistokinemya lekeleme amacıyla hayvan deneyleri gerektiği gibi tekrarlanmıştır (Şekil 2).
Akut epileptik nöbetlerin KA indüksiyonu maksimum nöbet yoğunluğuna yol açar 1 h enjeksiyon sonrası15 (Şekil 3). Maksimum nöbet yoğunluklarında beyin ve periferik lipit seviyesi değişikliklerini çözmek için, fareler KA enjeksiyonundan sonra 1 saat sonra kurban edildi, ardından plazma, beyin ve periferik organ örneklemesi yapıldı. Donmuş beyinler altı beyin bölgesinde parçalandı (bkz. adım 3.1). Beyin bölgeleri ve periferik organ (kalp ve akciğer) dokuları homojen doku örnekleri elde etmek için toz haline getirildi ve daha sonra eBC'lerin ve eiC'lerin (Şekil 4A ve adım 4.1.1) ve PC'lerin ve eBC'lerin iki lipidomik profillemesi için aliquoted (Şekil 4B ve adım 4.1.3).
Çift ekstraksiyon protokolü (bkz. adım 4.1.5), farklı bölgelerdeki beyin yumruklarından profilleme yoluyla PL/eB'leri ve RNA'yı daha yüksek bir mekansal çözünürlükte gerçekleştirmek için uygulanmıştır: hipotalamus (HYP), bazolateral amigdala (BLA) ve ventral (vHC) ve dorsal (dHC) hipokampus (Şekil 5). Yumruklar KA kaynaklı epileptik farelerden örneklendi (bkz. adım 3.2) ve 1 saat ka sonrası enjeksiyonda maksimum nöbet durumunda fareleri kontrol edin (Şekil 2).
Nörodejenerasyon kapsamını değerlendirmek ve lipid değişikliklerini epilepsi ile nörodejenerasyon derecesine ve PEA ile yeni epilepsi tedavisi üzerine atfetmek, immünohistokimyasal çift boyama beyin bölümlerinde yapıldı (bkz. adım 1.3) 5 gün sonra örneklenen KA kaynaklı epileptik nöbetler (Şekil 2) subkronik PEA tedavisi olmayan farelerde (ortada), subkronik PEA tedavisi ile (sağda) ve salin enjekte edilen farelerde (solda) (Şekil 6 ). KA kaynaklı durum epileptikus (SE), ağırlıklı olarak hipokampüsün CA1, CA3 ve hilus bölgesinde, kontrole kıyasla caspase-3 (CASP3) sinyali (Şekil 6, orta görüntü) ile belirtilen apoptotik olaylar eşliğinde büyük NeuN sinyali kaybına neden oldu (Şekil 6, sol görüntü). Subchronic PEA tedavisi (sağ görüntü) özellikle nöronal çekirdek proteini (NeuN) sinyalini korurken, (CASP3) sinyali zar zor tespit edilebilir.
| KA ve SAL enjeksiyon çözeltisi. |
| KA enjeksiyon çözeltisi (8 mL son hacim): |
| 1. 15 mL tüpte 24 mg KA tartın (dikkat: glothes ve maske takın) |
| 2. 10 dakika boyunca 8 mL salin ve girdap ekleyin |
| 3. Intermdediate depolama için 4°C'de tutun |
| 4. Enjeksiyondan önce oda sıcaklığına ve girdabına yenileme |
| Araç 1 enjeksiyon çözeltisi (8 mL son hacim): |
| 1. adımı atla ve 2-4 arası adımlara devam et |
Tablo 1: Nöbete neden olan ilaç ve araç 1 uygulamasının hazırlanması. Kainic asit (KA) enjeksiyon çözeltisini 30 mg/kg'lık son konsantrasyonda 24 intraperitoneal enjeksiyon (10 mL/kg) ve ilgili araç enjeksiyon çözeltisi (araç 1)1 için hazırlama adımları.
| BEZELYE ve SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)) enjeksiyon çözeltisi. |
| BEZELYE enjeksiyon çözeltisi (8 mL son hacim): |
| 1. 15 mL tüpte 32 mg BEZELYE tartın |
| 2. 10 dakika boyunca 0,4 mL DMSO ve girdap ekleyin |
| 3. 5 dakika boyunca 3,4 mL SAL ve girdap ekleyin |
| 4. 36 ° C'de 5 dakika boyunca sonicate karışımı |
| 5. 5 dakika boyunca 0.4 mL Cremophor ve girdap ekleyin |
| 6. Sonicate 36 ° C'de 1 dakika ve 3.4 mL SAL ekleyin |
| 7. 30 saniye boyunca girdap ve 36 ° C'de 3 dakika sonicate |
| 8. Enjeksiyondan önce çözeltiyi çalkalayıcı ve girdapta düşük hızda 36 °C'de tutun |
| Araç 2 enjeksiyon çözeltisi (8 mL son hacim): |
| 1. adımı atla ve 2-8 arası adımlara devam et |
Tablo 2: Antiepileptik ilacın hazırlanması ve araç 2 uygulaması. Palmitoylethanolamide (PEA) enjeksiyon çözeltisini 40 mg/kg'lık son konsantrasyonda 24 intraperitoneal enjeksiyon (10 mL/kg) ve ilgili araç enjeksiyon çözeltisi (araç 2)1 için hazırlamak için örneklenmiş adımlar.
| Pozitif iyon modu | ||||||
| Seçili Kalibrasyon standartları DLL'leri | İlgili iç standartlar | |||||
| Analit | Öncü iyon | Ürün iyon m/z | Analit | Öncü iyon | Ürün iyon m/z | |
| ad | m/z | ad | m/z | |||
| AEA | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| BEZELYE | 300.2 | 62.1 | BEZELYE-d4 | 304.2 | 62.1 | |
| Bilgisayar 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | Bilgisayar 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| Bilgisayar 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| Bilgisayar 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| Negatif iyon modu | ||||||
| Seçili Kalibrasyon standartları DLL'leri | İlgili iç standartlar | |||||
| Analit | Öncü iyon m/z | Ürün iyon m/z | Analit | Öncü iyon | Ürün iyon m/z | |
| ad | ad | m/z | ||||
| ACAR | 303.05 | 259.1 | AA-d8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-HETE | 319.48 | 115 | 5(S)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-HETE | 319.48 | 155 | 12(S)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(S)-HETE | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20-HETE | 319.48 | 289 | 20-HETE-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| PGD2 | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| Pİ 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | Pİ 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PS 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | PS 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| PS 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| PS 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| Pİ 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | Pİ 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| Pİ 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| Pİ 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
Tablo 3: Hedefli lipidomik analiz için lipid standartları ve MRM geçişleri. Tablo içeriği ilk olarak Lerner ve ark.2'de yayınlandı.
Şekil 1: İş akışı modüllerine genel bakış. Çalışma amacına ve farklı örnekleme yollarına bağlı olarak, ekstraksiyon ve profilleme bir araya edilerek çalışma için önemli bir sonuç elde edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farelerde akut kainik asit (KA) kaynaklı epileptik nöbet modelinin deneysel tasarımı. Fareler ya 1) Salin (10 mL/ kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); ve/veya 3) (alt) potansiyel antiepileptik bileşik Palmitoylethanolamide (PEA) ile kronik olarak ön işlem (1−2x 40 mg/kg i.p.). Grup başına 24 fare yukarıda olarak tedavi edildi ve nöbet yoğunluklarını değerlendirmek için davranış puanlandı. Beyinde, periferik organlarda ve plazmada akut epileptik nöbet durumu boyunca lipid düzeyi değişikliklerini belirlemek için dört farklı zaman noktasının (T1−T4) her birinde grup başına altı fare feda edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akut kainik asit (KA) kaynaklı epilepsi ve kontroller sırasında davranışsal puanlama. Ortalama davranışsal skorlar olarak verilen 180 dk ka-nöbet indüksiyonu (n = 24) veya salin enjeksiyonu (n = 24) süresi boyunca nöbet yoğunluklarının değerlendirilmesi. Araç 1 ve araç 2 enjekte edilen gruplar arasında fark bulunamadı. Hata çubukları = SEM. ANOVA tekrarlanan ölçüm, ölçümlerin zaman noktaları ile test grupları arasında önemli etkileşimler sağladı ve KA tedavisinin davranışsal puanlar üzerindeki önemli etkilerini gösterdi. KA ile tedavi edilen farelerin nöbet yoğunlukları başlangıçta Post ve ark.13Please'de yayınlandıBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Akut epileptik nöbet durumunda beyin ve periferik doku lipit düzeyleri. Maksimum nöbet yoğunluğunda SEM ± ortalama değer olarak sunulan lipid seviyesi değişiklikleri (örn. Altı beyin bölgesinde (n = 9) 1 saat KA sonrası enjeksiyon: serebral korteks (cCTX), striatum (STR), talamik bölge (THL), hipokampus (HC), hipotalamus (HYP), beyincik (CER) ve KA kaynaklı epileptik farelerde kalp ve akciğer dokusu (üst değer) ve kontroller (daha düşük değer). Dokulardaki bazal lipit seviyeleri gri ile tasvir edilir. PL, 2-AG ve AA değerleri sırasıyla nmol/g. ve NAE, eiC ve AEA değerleri pmol/g olarak verilmiştir. Tüm lipit seviyeleri doku ağırlığına göre normalleştirilir. Spesifik moleküler değişiklikleri vurgulamak için, KA ile tedavi edilen farelerin lipit seviyeleri, kontrole kıyasla akut nöbet yoğunluğunda azalan değerleri gösteren bir ısı haritasında salin enjekte edilen (KA/ sal) yüzdesi olarak temsil edilir ve sırasıyla kırmızı ile kontrole kıyasla artan seviyeler açık mavi ile gösterilir. P değerinde <0.05 olarak kabul edilirler. Bu veriler ilk olarak Lerner ve ark.2Please'de yayınlandıBu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 5: Fare beyin yumruklarından nicel profilleme için eB/PL ve RNA'nın çift ekstraksiyonu. (A) Seçilen PL'lerin ve EB'lerin nicel dağılımı: 1) hipotalamusun (HYP) bir alt kısmı; 2) bazolateral amigdala (BLA); ve 3) hipokampüsün ventral (vHC) ve dorsal (dHC) alt bölgelerine, KA kaynaklı epileptik nöbet farelerinden (üst değer) ve kontrollere (düşük değer) (n = 10). Seviyeler doku ağırlığına normalleştirilir (yumruklar yaklaşık 0,5−1,5 mg'a karşılık gelir) ve nmol/g ile ifade edilir. Sadece AEA pmol/g ile ifade edilir. Lipid düzeyleri SEM ± ortalama değer olarak sunulur. Delikli beyin bölgesi başına ortalama değişim (ortalama yüzde olarak SEM, tüm lipitler üzerinde ortalama olarak) şudur: HYP = % 7.83; BLA = %7,80; vHC = %6,28; ve dHC = sırasıyla %7,90. (B) Lipid sinyalinde yer alan endojen enzimlerin ve reseptörlerin göreceli ekspresyon seviyelerinin yanı sıra KA kaynaklı epileptik nöbete (kırmızı) ve kontrollere (açık gri) maruz kalan farelerden farklı beyin bölgelerinde /alt bölgelerinde mRNA düzeyinde araştırılan beyin aktivitesi için belirteçler. Grup araçları arasındaki farkın istatistiksel analizleri, iki kuyruklu eşleşmeyen Öğrencinin t testi kullanılarak gerçekleştirilmiş ve p değerinde <0,05 (n = 10) anlamlı olarak kabul edilmiştir. Bu veriler ilk olarak Lerner ve ark.7Please'de yayınlandıBu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 6: İmmünistokimyasal NeuN ve CASP3 çift leke. Tedavi edilmemiş salin enjekte edilen farelerden (solda), subkronik olarak PEA pretre edilmiş farelerden (ortada) ve ön işlem yapılmadan epileptik farelerden (sağda) beyin kesitlerinde KA enjeksiyonu sonrası immünhistokimya yapıldı. BEZELYE önkseçimi, tedavi edilmeyen epileptik farelere kıyasla nöroprotektif etkiler gösterir (n = 3). Bu veriler ilk olarak Post et'te yayınlandı. al.13Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan nörolipidomik ve transkriptomik metodoloji, beyin ve periferik organlarda yüksek ve düşük mekansal çözünürlükte herhangi bir hastalığı veya sağlıklı gelişimi araştırmak için uygun bir ortalamadır. Optimize edilmiş plazma örnekleme ve elleçleme prosedürleri nedeniyle, doku lipidomik ve transkriptomik için kurban edilen aynı hayvanlardan plazma lipidomik analizi de yapılabilir, böylece doku kanı moleküler korelasyonlarının ve biyobelirteç keşfinin güvenilirliği artırılabilir. Üç protokolden veya kombinasyonlardan birinin uygulanmasıyla geniş bir veri kümesinin sağlanması, sadece bir bağlamda (hayvan modeli deneyi) değil, aynı zamanda deneysel model bağlamları arasında ve arasında nörolojik bir hastalığı araştırmak için değerlidir. Ayrıca, örnekleme, işleme ve moleküler analizin yüksek düzeyde standartlaştırılması moleküler verilerin yüksek tekrarlanabilirliğini kolaylaştırır, bu nedenle çalışmalar ve laboratuvarlar arasındaki ve içindeki moleküler değişikliklere güvenilir bir şekilde atıfta bulunur.
Bununla birlikte, bunu elde etmek için, tanımlanan çalışma amacı için maksimum okuma potansiyeli sunan deneysel bir tasarımın kurulumu kritik öneme sahiptir. Deneysel gruplar arasındaki moleküler değişikliklerin güvenilir bir karşılaştırmasını elde etmek için, hayvan değişkenliğini ve biyolojik lipit seviyelerini telafi etmek için en az on hayvan kullanılması önerilir. Hayvan tedariki ve/veya hayvan elleçleme lojistiği kısıtlayıcı olduğunda, kendinden emin istatistiksel analizleri sağlamak için grup başına en az altı hayvanın kullanılması zorunludur. Grup büyüklüğü hesaplamalarının modele bağlı ölüm oranlarını telafi etmesi gerekir (yani, modelin olası ölüm oranına rağmen çalışma için grup başına en az altı, ideal olarak on hayvan gerekir). Kritik bir koşul, deney grubu başına yaş, cinsiyet ve suşla eşleşen hayvanlar sağlamaktır. Keşif aşaması için, hayvan partileri arasındaki olası davranışsal ve moleküler fenotip farklılıkları nedeniyle bulguların önyargısını önlemek için, tüm çalışmalar için deney hayvanları için aynı sağlayıcının ve mümkünse aynı hayvan grubu için kullanılması esastır. Çalışmalarda belirlenen moleküler ve davranışsal fenotipin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için mümkün olduğunca biyolojik bir çoğaltma analizi yapılması kritik öneme sahiptir.
Bir diğer önemli adım da hayvan gruplarıyla standartlaştırılmış, programlanmış bir deneysel çalışma kurmaktır. Sirkadiyen moleküler değişkenliği atlatmak için hayvanları günün aynı zaman diliminde tedavi etmek zorunludur. Günün saati sirkadiyen ritmin hedef moleküllerin sentezi ve bozulması üzerindeki bilinen etkisine göre ayarlanmalı veya sirkadiyen ritim etkileri hakkında bilgi bulunmadığında tüm deneysel gruplar için tutarlı tutulmalıdır. Benzer şekilde, hayvan kurban etmeden önceki barınma ve beslenme koşulları deneysel modellerde tutarlı ve sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Bu özellikle lipid plazma ve doku metabolizması üzerinde beslenme etkisi nedeniyle lipidomik profilleme için geçerlidir. Terapötik veya hastalık yapıcı ilaçların kullanımı her zaman kontrol gruplarında araç yönetimine paralel olarak yapılmalıdır, böylece araç ilaç tedavisi için kullanılanla aynı olmalıdır. Çalışmanın amacına yönelik en uygun kemirgen suşu ve/veya alt kısıtlar seçilebilmesi için ilaç bazlı tedavi stratejileri, uygulama zamanı ve sıklığı, dozlar ve uygulama yolu ile literatür ve/veya önceki deneyimlerden çıkarılan farklı suşlardaki ilaçlara özgü hassasiyetler açısından ilaç özgüllüğüne göre yapılmalıdır. Bir hastalığın zaman seyri araştırması ve büyük kohort gruplarını veya birden fazla hayvan gruplarını içeren tedaviye yanıtın bir günde tedavi, fedakarlık ve örnekleme açısından yürütülmesi imkansızdır. Bu gibi durumlarda, hayvan grubu işleme ardışık günlerde planlanmalı ve yapılmalıdır, ancak günün saati, deneysel tasarım, işlem süresi, araştırmacılar vb. Kimyasal enjeksiyonların hazırlanması da bir başka kritik adımdır. İlaç veya hastalık indükleyen bileşikler uygulamadan önce ve ilaç spesifikasyonlarına göre taze olarak hazırlanmalıdır. Tüm kohortların karşılaştırılması için ilacın aynı üretim grubunun kullanılması önerilir. Bu özellikle epilepsi indüksiyonu için bu çalışmada kullanılan kainik asit (KA) gibi doğal bileşik formülasyonlarda önemlidir.
Güvenilir lipidomik ve veya transkriptomik profil oluşturmayı etkinleştirmek için, hayvan kurban etme prosedürü 5 dakikalık bir zaman dilimi içinde hayvan grupları arasında tutarlı bir şekilde yapılmalıdır. Kafa kesmeden sonra kan toplanırsa, cam haznede sabit miktarda izofluran tutulması önemlidir. Bu amaçla, aritmi ve çarpıntı başlangıcını önlemek ve plazma örneklemesi için uygun kan basıncını sağlamak için, izofluran ile sık sık (beş kullanımdan sonra) ıslatın ve izofluran kullanarak anestezi süresi boyunca 10 s'yi aşmayın.
Biyolojik malzeme örnekleme ve elleçleme koşulları (örneğin, zaman aralığı ve biyolojik malzeme örnekleme ve elleçleme sırası) tüm gruplar için kesinlikle takip edilmeli ve aynı tutulmalıdır. Lipid ve/veya mRNA seviyelerinin değişken derecelerde doku çözülmesini ve dolayısıyla tutarsız ex vivo doku değişikliklerini önlemek için, numune alma sonrası için kesinlikle kontrollü zaman ve sıcaklık koşullarının korunması esastır.
depolama. doku diseksiyonu veya delme ve sonraki numune işleme ve analizi (bkz. bölüm 3 ve 4). Deneysel hayvan gruplarının büyüklüğü, bu prosedürlerin her biri için burada belirtilen zaman dilimini değiştirmeden hayvan kurban edilmesine, çıkarılmasına ve diseksiyona izin veriyorsa, taze örneklenmiş tüm beyinler önceden keşştirilmeden önceden soğulmuş bir metal plakada (4 °C) hemen kesilebilir. Deneysel grupların boyutu bu prosedürler için pratik değilse, beyinlerin çıtçıtla dondurulması ve daha sonra diseksiyonun işlenmesi için karşılaştırılabilir ve kontrollü zaman sağlaması önerilir. Burada belirtilen protokollere ve zaman çizelgesi yönergelerine kesinlikle uyulurken, taze parçalanmış beyin bölgelerinin çıkarılmasıyla elde edilen moleküler seviyeler ile donmuş beyinlerden parçalanmış beyin bölgeleri arasında herhangi bir tutarsızlık gözlenmedi.
Lipit seviyelerinin gruplar içinde ve gruplar arasında tekrarlanabilir ve minimum değişkenliğe ulaşabilmesi için kritik bir husus, kesinlikle kontrol edilen sıcaklık koşullarında numune işleme dışında, antioksidanların sağlanmasıdır (bkz. bölüm 2 ve 3). Kurban vermeden önce hayvanların herhangi bir stres faktöründen (örneğin kan kokusu) kaçınmak çok önemlidir, çünkü EB'ler gibi nöronal aktivitede yer alan birçok lipit strese yanıt olarak hızla değişebilir.
Lipid ekstraksiyonu ve analizi için, ekstraksiyon gününde iç standartları, kalibrasyon çözümlerini ve ekstraksiyon çözücülerini taze olarak hazırlamak önemlidir. Hem kalibrasyon eğrisi hazırlama hem de numune ekstraksiyonları için aynı iç standartlar kaynağı kullanılmalıdır. Ayrıca, numune çıkarma, depolama ve analiz için kesinlikle kontrol edilen sıcaklık koşullarını takip etmek, moleküllerin ex vivo enzymatic veya kimyasal değişikliklerini en aza indirmek ve kontrol etmek için çok önemlidir. LC/MRM analizi için, hedeflenen lipitler kümesi, yeni bir lipit kümesi için ayırma, algılama ve MRM geçişlerinin optimize edilmesi koşuluyla, hedefler ve buna bağlı olarak iç standartlar ve kalibrantlar eklenerek veya kaldırılarak çalışma amacına göre uyarlanabilir. Sunulan ekstraksiyon protokolleri, teknik arıza vakaları için veya çoğaltma analizinin çalışma için önemli olduğu durumlarda etkili olan eBC'ler ve eiC'ler için iki LC / MRM çoğaltmasının sağlanmasına izin verir. PL ekstraksiyon protokolleri, numune/ekstrakt miktarlarını ekstrakt başına en az 10 analiz için uygun hale getirir (örneğin, sırasıyla öncü iyon ve nötr kayıp taramasına dayalı çoklu tarama deneyleri2; ek LC/MRM analizleri; veya bir çalıştırma sırasında teknik arızayı telafi etmek için LC/MRM çoğaltmaları). Lipit analizi LC/MRM ile sınırlı değildir; Aslında bu protokollerden herhangi biriyle elde edilen lipid özleri, hedefsiz, üst düzey kütle spektrometrisi analizi için uygun. Beyin yumrukları veya ayrık bölgelerden elde edilen dakika miktarda doku dışında (3 mg'dan az), 2−3 mg'dan büyük bölgelerin donmuş pulverize dokuları aliquoted ve çoğaltma analizi ve / veya doku tozunda uygun diğer araştırmalar için burada açıklandığı gibi birden fazla ekstraksiyon modülü için kullanılabilir.
Burada açıklanan protokollerin yaygın olarak kullanılanlara kıyasla genel bir avantajı, hayvan kaynaklarının, sarf malzemelerinin ve analiz maliyetlerinin azaltılmış harcamalarında çok bileşenli ekstraksiyon ve analiz için genel zaman etkinliğinin ve duyarlılığının artmasıdır. Daha da önemlisi, çift lipid / mRNA ekstraksiyon protokolü ayrıca mRNA ekstraksiyonunun daha yüksek verimliliğini ve mRNA'nın bütünlüğünü ilgili mevcut standart protokollere kıyasla ve aynı zamanda lipid ekstraksiyonunun verimliliğini artırır7. Bu muhtemelen çift olarak çıkarıldığında lipid ve mRNA fraksiyonlarının her biri için azaltılmış matris etkisinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, yöntem beyin yumruklarında olduğu gibi yüksek uzamsal çözünürlük profilleme için kolayca uygulanabilir.
Bununla birlikte, protokolün mevcut bir sınırlaması, enflamatuar lipitlerin çift lipid / mRNA ekstraksiyonu kullanılarak analiz ve niceleme için uygun olmamasıdır. Bu nedenle, protokol daha fazla iyileştirme için tabidir. Bu amaçla, doku ve plazma inflamatuar lipitleri ve endocannabinoidler, nöroinflamatuar süreçleri ve endokannabinoidler modüle edilmiş nöronal aktiviteyi aynı anda araştırmak için optimize edilmiş bir araç olan birlikte çıkarılabilir ve birlikte analiz edilebilir (bkz. eiC'lerin ve eBC'lerin birlikte çıkarılması). Fosfolipidlerin bu ikinci teste dahil edilmesinin mümkün olması beklenebilir.
Nörolojik hastalıklar için prospektif multi-omik yaklaşımlar göz önüne alınarak, lipid ekstraksiyon protokolünden sonra elde edilen protein fraksiyonlarının proteomik analizinin (yani, EBC'lerin ve EIC'lerin ortak ekstraksiyonu ve PC'lerin birlikte çıkarılması) mümkün olması beklenebilir olması beklenebilir. Ancak, çift lipid /mRNA protokolü kullanırken bu henüz mümkün değildir. İkincisi için, ekstraksiyonun kimyasal ortamı, bicinkoninik asit testi (BCA) gibi standart protein tahlillerini kullanarak protein miktarı belirlemeyi bile önler. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek ve proteomik profillemenin bu protokollere dahil edilmesini hızlandırmak için daha fazla gelişme planlanmaktadır.
Burada açıklanan modüler protokolü kullanarak, akut epileptik nöbetlerin hayvansal modelinde eIC' lerin, eBC'lerin ve PL'lerin beyin bölgesel haritasına sahip olmak mümkündü (Şekil 4). Protokol, KA kaynaklı akut nöbetler ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen farelerde eIC'ler tarafından enflamatuar süreçlerin hipokampal modülasyonunu ve EBC'ler tarafından nöronal aktivite modülasyonunu gösterdi13. Akut epileptik nöbet durumlarında sırasıyla fosfolipid, endokannabinoid ve mRNA değişikliklerinin subregional beyin lokalizasyonu da gözlenmiştir (Şekil 5). Bu sonuçlar, beyin bölgelerinde ve alt bölgelerde epilepsi gibi karmaşık nörolojik hastalıkların modülasyonunda rol oynayan geniş bir lipit yelpazesi üzerindeki bilginin ilerletmesinde burada açıklanan yöntemlerin değerini ve uygulanabilirliğini vurgulamaktadır. Bu protokoller nörolojik hastalık araştırmalarında ve ötesinde genel uygulanabilirliktedir ve hücre popülasyonları için protokollerin ve uygulamaların daha da geliştirilmesi devam eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.
Acknowledgments
Bu makaleyi Dr. Ermelinda Lomazzo'ya ithaf ediyoruz. Bu makalenin son uzaması sırasında Dr. Ermelinda Lomazzo vefat etti. Bilime olan tutkunun ve anlamlı bir araştırma amacını yerine getirmek için ekip çalışmasına özverili katılımın vücut bulmuş halidir. Her zaman insanların daha iyi olmasına anlamlı bir şekilde katkıda bulunmayı hayal etti. Onun iyi kalpli doğası, bilimin ve yaşamın yorucu yollarından asla ödün vermedi. Paha biçilmez ve sonsuza dek kalbimizde kalacak.
Julia M. Post, Johannes Gutenberg Üniversitesi Mainz Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Çevirisel Sinirbilim Için Odak Programı (FTN) tarafından finanse edildi ve şu anda LB'ye SPP-2225 EXIT projesi tarafından finanse ediliyor Raissa Lerner, DZHK projesi 81X2600250 tarafından LB ve Lipidomics Çekirdek Tesisi'ne kısmen finanse edildi. Bu çalışmalar için kısmi finansman, Johannes Gutenberg Üniversitesi Mainz Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Lipidomics Çekirdek Tesisi, Fizyolojik Kimya Enstitüsü ve Intramural fonlar (LB'ye) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
- Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
- Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
- Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
- Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J.
- Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
- Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
- Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
- Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
- Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
- Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
- Konsman, J. P.
- Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
- Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
