Summary
В этой статье представлен модульный протокол для тканевой липидомики и транскриптомики, а также плазменной липидомики в моделях неврологических заболеваний мышей, нацеленных на липиды, лежащие в основе воспаления и активности нейронов, мембранные липиды, последующие мессенджеры и ферменты / рецепторы, кодирующие мРНК, лежащие в основе липидной функции. Описаны процедуры отбора проб, обработки проб, извлечения и количественной оценки.
Abstract
Липиды служат основным интерфейсом для мозговых оскорблений или стимулов, способствующих неврологическим заболеваниям, и являются резервуаром для синтеза липидов с различными сигнальными или лигандными функциями, которые могут подчеркивать возникновение и прогрессирование заболеваний. Часто изменяясь на предсимптомном уровне, липиды являются новым источником лекарственных мишеней и биомаркеров. Многие неврологические заболевания проявляют нейровоспаление, нейродегенерацию и возбудимость нейронов в качестве общих признаков, частично модулированных специфическими липидными сигнальными системами. Взаимозависимость и взаимосвязь синтеза различных липидов побуждает к многолипидному, мультиферментному и мультирецепторному анализу с целью выявления общих и специфических особенностей неврологических контекстов и ускорения разгадки механистических аспектов возникновения и прогрессирования заболевания. Приписывание липидных ролей различным областям мозга способствует определению молекулярного фенотипа липидов и морфологии, связанных с неврологическим заболеванием.
Представленный здесь модульный протокол, подходящий для анализа мембранных липидов и последующих липидных сигналов вместе с мРНК ферментов и медиаторов, лежащих в основе их функциональности, извлеченных из дискретных областей мозга, которые имеют отношение к конкретному неврологическому заболеванию и / или состоянию. Для обеспечения точного сравнительного липидомного профилирования рабочие процессы и критерии работы были оптимизированы и стандартизированы для: i) отбора проб мозга и рассечения областей, представляющих интерес, ii) совместной экстракции нескольких липидных сигналов и мембранных липидов, iii) двойной экстракции липидов / мРНК, iv) количественной оценки с помощью мониторинга множественных реакций жидкостной хроматографии (LC / MRM) и v) стандартного профилирования мРНК. Этот рабочий процесс поддается малым количествам тканей, полученным путем отбора проб функционально дискретных субрегионов мозга (т.е. путем ударов мозга), что предотвращает смещение в многомолекулярном анализе из-за неоднородности тканей и / или изменчивости животных. Для выявления периферических последствий неврологических заболеваний и установления трансляционных молекулярных показаний неврологических болезненных состояний также проводится и описывается забор проб периферических органов, обработка и их последующий липидомический анализ, а также липидомика плазмы. Протокол демонстрируется на мышиной модели острой эпилепсии.
Introduction
Последние достижения в области функции липидов и их роли в возникновении и прогрессировании неврологических заболеваний открывают новые научно-исследовательские и опытно-конструкторские площадки для новых терапевтических мишеней и выяснения механизмов заболевания1. Задокументированные различия в липидном составе в разных областях мозга, подчеркнутые современными методами молекулярной визуализации, такими как масс-спектрометрическая визуализация и расширенное профилирование масс-спектрометрии, смещают парадигму исследования липидов от всего мозга к функционально различным и дискретным областям мозга. Тот факт, что липидный состав варьируется в разных областях мозга, вызывает новую концептуализацию как мембранной липидной чувствительности, так и последующей липидной сигнализации в ответ на повреждение мозга или стимулы в функционально различных областях мозга. Следовательно, липидные протоколы требуют новых разработок для решения проблемы низких количеств тканей для обнаружения и количественной оценки с более высоким пространственным разрешением и одновременно анализа нескольких липидных компонентов клеточных мембран и сигнальных путей. Кроме того, определение ферментов, липидных лигандов и рецепторов, участвующих в регуляции их уровней и функций, имеет первостепенное значение для выяснения сигнальных путей, затронутых неврологическим заболеванием, и руководства новыми механистическими исследованиями в патофизиологическом контексте.
В дополнение к увеличению пространственного разрешения мозга, существуют две основные трудности, бросающие вызов разработке новых нейролипидомных подходов. Во-первых, липидные сигнальные молекулы, как правило, имеют очень низкое содержание по сравнению с мембранными конститутивными липидами. Во-вторых, липидом проявляет высокую структурную гетерогенность, которую трудно препарировать с помощью одного аналитического подхода. Следовательно, методы экстракции и анализа адаптированы к различным категориям липидов и обычно выполняются в разных образцах тканей.2. Липидомические методы дробовика3 являются отличными инструментами для быстрого выявления широкого профиля мембранных липидов, в то время как повышенная чувствительность и селективность, обеспечиваемые целенаправленными методами открытия и количественной оценки масс-спектрометрических методов, используются для исследования низкообильных сигнальных липидов, включая: i) воспалительные липиды и ii) липиды, участвующие в модуляции нейрональной активности, такие как эндоканнабиноиды (eCB), аминокислотно-связанные липиды, и так далее.4,5. Чтобы охватить изменения липидов как на клеточной мембране, так и на уровне сигнализации, происходящие в областях мозга моделей неврологических заболеваний, обычно экстракция и анализ липидов проводятся в отдельных образцах тканей, полученных из различных партий животных или из разных полушарий, или путем рассечения более крупной области ткани на несколько частей. Когда уровни мРНК ферментных рецепторов также представляют интерес, их исследование обычно требует получения отдельного образца ткани. Например, исследование мембранных липидов, эндогенных каннабиноидов и мРНК потребует трех различных образцов тканей (например, двух образцов для двух методов экстракции липидов - мембранных липидов и сигнальных липидов - и последующих двух методов анализа липидов - и одного образца для анализа мРНК). Исследование воспалительных липидов и эндогенных каннабиноидов требует двух различных образцов тканей, методов экстракции и методов анализа, соответственно. Другим примером является исследование мРНК и любой липидной категории в образце мозгового пунша или лазерной микродиссекции, что, следовательно, требует, чтобы два разных животных получали два образца на (под)область мозга. В таких случаях часто наблюдается значительная степень изменчивости и/или плохой воспроизводимости результатов, обусловленная биологической изменчивостью и/или неоднородностью тканей. Руководствуясь этими практическими ограничениями многомолекулярного анализа, происходящими, в частности, при высоком пространственном разрешении в головном мозге, был разработан трехмодульный протокол нейролипидомики, охватывающий: 1) коэкстракцию и совместный анализ LC / MRM воспалительных липидов (например, эйкозаноидов (EIC)) и липидов, участвующих в модуляции нейронной активности, таких как eCB2; 2) совместная экстракция фосфолипидов (ПЛ) и eCB с последующим мультисканированием LC/MRM и прекурсором/нейтральным анализом потерь2; и 3) двойная экстракция мембранных (фосфо)липидов и eCB, а также мРНК с последующим анализом секвенирования LC/MRM и qPCR или РНК6. В зависимости от биологического вопроса, подлежащего решению при неврологическом заболевании и интересующей области мозга, комбинация первого и второго протокола или первого и третьего протокола может быть применена к одному и тому же образцу ткани для тканей весом около 4 мг. Первый и третий протоколы могут быть независимо применены для тканей около 2 мг. Второй протокол может быть применен для тканей весом всего 0,5 мг. Независимо от выбранного модуля нейролипидомного протокола, забор тканей и преаналитическая обработка, выделение мозга и рассечение области, а также процедура жертвоприношения животной модели стандартизированы и идентичны для всех трех модулей протокола. В нашем исследовании неврологических заболеваний периферические органы, которые имеют отношение к патологическим последствиям заболевания, всегда также собираются и анализируются с использованием этих модульных протоколов. Кроме того, кровь регулярно отбирается для плазменной липидомики, чтобы служить инструментом считывания неврологических заболеваний с целью перспективного трансляционного применения. Представленный здесь модульный протокол липидомики очень универсален: масштабируется до больших количеств тканей и легко применим практически для любого типа тканей и заболевания. Для применения модульного протокола (Рисунок 1) при неврологических заболеваниях любая стандартизированная модель грызунов начала и прогрессирования неврологических расстройств, таких как черепно-мозговая травма, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или эпилепсия, поддаются лечению.
Эти протоколы широко применялись для изучения изменений в тканевом липидоме и/или транскриптоме в острой фазе эпилепсии в мышиной модели эпилепсии, индуцированной кайновой кислотой (КА)2,7, модели, широко используемой в доклинических исследованиях из-за сходства с эпилепсией височной доли человека (TLE)8,9,10,11. Используя эти протоколы, терапевтический потенциал таких препаратов, как Пальмитоилэтаноламид (ПЭА)12,13, оценивали в той же мышиной модели эпилепсии. Исследование выявило изменения липидов и мРНК при высоком и низком пространственном разрешении в мозге и периферии, в точке максимальной интенсивности острых приступов (при 60 мин после индукции после захвата) и при субхроническом и остром лечении ПЭА в четырех различных временных точках (20, 60, 120 и 180 мин) после индукции KA-припадка, временное окно, охватывающее острую фазу эпилепсии. Плазма, мозг и периферические органы необработанных мышей, введенных к КА, острых и субхронически обработанных ПЭА мышей, а также контрольных мышей с транспортным средством и ПЭА-транспортным средством, были собраны в каждый момент времени12,13 и исследованы с помощью этого молекулярного анализа. Молекулярные данные коррелировали с поведенческими фенотипами, полученными с помощью оценки судорог, а также с данными иммуногистохимии о нейродегенеративных процессах, чтобы разгадать прогрессирование фазы острой эпилепсии и потенциал ПЭА для ее облегчения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, соответствуют Директиве Совета Европейского сообщества от 22 сентября 2010 года (2010/63EU) и были одобрены местным комитетом по животным земли Рейнланд-Пфальц, Германия (ссылка на файл: 23 177-07/G16-1-075).
1. Животная модель острой и профилактически леченной KA-индуцированной эпилепсии
- Выполняйте индукцию судорог, лечение и поведенческую оценку.
- Отдельные мыши (минимум n = 6 мышей в группе) в одиночных клетках.
- Готовят приступно-индукционный раствор и соответствующее средство (см. табл. 1), а также лечебно-инъекционный раствор и соответствующее транспортное средство (см. табл. 2).
- Вводите мышам внутрибрюшинно (т.п.) (10 мл/кг массы тела мыши) без анестезии в соответствии с их групповой идентичностью: болезнь, лечение или транспортное средство, обработанное (т.е. KA, ОБРАБОТАННОЕ ПЭА, и две группы транспортных средств). См. рисунок 2, таблица 1 и таблица 2.
- Мониторинг и оценка поведения в соответствии со следующей стандартизированной шкалой интенсивности приступов: 0 = отсутствие ответа; 1 = неподвижность и пристальный взгляд; 2 = разгибание передней конечности и/или хвоста, жесткая осанка; 3 = повторяющиеся движения, покачивание головой; 4 = вздыбление и падение; 5 = непрерывное вздыбление и падение; 6 = тяжелые клоно-тонические припадки; 7 = смерть14,15 (рисунок 3).
- Выполните процедуру жертвоприношения для липидомического и транскриптомического анализа.
- В четырех временных точках (т.е. 20, 60, 120 и 180 мин после КА- или впрыска транспортного средства соответственно) приносят в жертву шесть мышей из каждой из следующих групп: ПЭА, обработанная ПЭА, эпилептическая машина без ПЭА 1 и транспортное средство 2, в соответствии с протоколами, одобренными IACUC.
- Через десять секунд после достижения каждой временной точки обезболивайте мышей, используя пропитанную изофлураном ткань в стеклянной камере. Подтверждают анестезию потерей корректирующего рефлекса, о чем свидетельствует невозможность двигаться при медленном опрокидывании стеклянной камеры. Обезглавливайте мышей с помощью хирургических ножниц и собирайте плазму, мозг и периферические органы (см. шаги 2.2.2−2.2.4).
ВНИМАНИЕ: Этические правила для процедур жертвоприношения варьируются между местными комитетами по животным. Обязательно проверьте и следуйте правилам, выпущенным местным комитетом по животным.
- Следуйте процедуре жертвоприношения для иммуногистохимического анализа.
- Для иммуногистохимического окрашивания13 поведенчески оценивают трех мышей из каждой из следующих групп: ПЭА, получавших ПЭА, ПЭА-нелеченная эпилепсия и транспортные группы, в течение всего временного курса (180 мин).
- Жертвоприношение и перфуз мышей через 5 дней. Глубоко обезболивать мышей (см. этап 1.3.1 для групп мышей) путем инъекции пентобарбитала (100 мг/кг) и бупренорфина (0,1 мг/кг) в качестве наркотических средств. Подтвердите глубокую анестезию потерей рефлекса между пальцами ног.
- Закрепите мышь на полистирольной пластине и сразу же откройте грудную клетку с помощью мелких ножниц и стандартных щипцов. Поместите бабочку в левый желудочек сердца и вырежьте правое предсердие тонкими ножницами.
- Отрегулируйте скорость и давление насоса до постоянного перистальтического потока со скоростью 2−3 мл/мин. Перфюсировать с ледяным фосфатом, буферизованным физиологическим раствором (PBS) в течение ~ 5 мин. При необходимости замените бабочку.
ПРИМЕЧАНИЕ: При правильной перфузии внутренние органы (кроме селезенки) начинают отбеливаться в течение 1−2 мин. - Переведите перфузию на ледяной 4% раствор параформальдегида (PFA) в течение ~5 мин. Изолируют весь мозг, как описано на этапе 2.2.2, и фиксируют в течение 24 ч в 4% растворе PFA при 4 °C.
- Инкубируют мозг в 30% растворе сахарозы в течение 48 ч при 4 °C. Удалите оставшуюся сахарозу сухой папиросной бумагой и заморозьте мозг на металлической пластине (-80 °C). Храните мозг при -80 °C для процедур окрашивания13.
2. Процедуры отбора проб для липидомического/транскриптомного анализа
- Подготовьтесь к отбору проб.
- Предварительноохлаждаемые ЭДТА-трубки для отбора проб плазмы до 4 °C. Предварительно охладить центрифугу и вихревой аппарат до 4 °C. Предварительно охладите металлическую пластину, покрытую алюминиевой фольгой (чтобы защелкнуть замороженный мозг и / или другие ткани, представляющие интерес) на сухом льду (-80 ° C). Предварительно охладить меченые 2 мл и 5 мл пробирки на сухом льду (-80 °C) для аликвот плазмы, замороженной ткани и сбора мозга соответственно. Используйте янтарные трубки для защиты светочувствительных молекул, таких как EIC.
- Очистите оборудование для отбора проб и изоляции тканей (хирургические ножницы, прямые острые тонкие ножницы, прямые гладкие стандартные щипцы, тонкие щипцы с зеркальным покрытием, изогнутые щипцы и шпатель, пластину из пенополистирола и иглы для фиксации) дезинфицирующим средством (например, 70% этанолом).
- Протоколы отбора проб
- Определите порядок отбора проб.
- Собирать кровь сразу после обезглавливания в предварительно охлажденных пробирках ЭДТА объемом 1 мл (см. шаг 2.2.3).
- Удалите весь мозг и заморозьте сразу после удаления. Этот шаг займет 1−2 мин. Храните замороженный мозг при -80 °C для дальнейшей обработки (см. шаг 2.2.2).
- Удалить периферические органы, представляющие интерес (например, легкие, сердце, печень), в течение 5 мин после удаления мозга, а также заморозить и хранить при -80 °C для дальнейшей обработки (см. этап 2.2.4).
- Удалить мозг для рассечения или пробивки процедур. Эта процедура занимает 1−2 мин/мозг.
- После обезглавливания (см. шаг 1.2) начните делать разрез средней линии в коже с помощью мелких ножниц. Освободите череп, перевернув кожу на глаза. Дотянитесь до верхней части черепа и сделайте небольшой каудальный разрез, начиная с уровня внутритеменной кости. Избегайте разрезания мозга.
- Плотно прорежьте самую переднюю часть черепа между глазами, чтобы облегчить удаление мозга. Наклоните одну сторону теменной кости с помощью изогнутых узких щипцов и отломите. Повторите последний шаг для другой стороны.
- Удалите мозговые оболочки. Сдвиньте шпатель под переднюю часть мозга (т.е. обонятельную луковицу) и осторожно наклоните мозг вверх. Сдвиньте шпатель дальше вниз, чтобы сломать зрительный и другие черепно-мозговые нервы.
- Вытащите мозг из черепа и немедленно заморозьте весь мозг на предварительно охлажденной (-80 °C) металлической пластине с вентральной стороной, обращенной к металлической пластине (спинной вверх).
- Позвольте мозгу полностью замерзнуть и перейти в предварительно охлажденные 5 мл пробирки и хранить при -80 °C до рассечения областей мозга или процедуры пробивки (см. шаги 3.1. и 3.2).
- Выполните отбор проб плазмы.
- Спайковые предварительно охлажденные ЭДТА-пробирки с 10 мкл свежеприготовленного индометацина-разведения до целевой концентрации 10 мкМ.
- Соберите кровь ствола сразу после обезглавливания путем мягкого сжатия организма в предварительно охлажденные трубки ЭДТА до максимального объема крови 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае правильного кровяного давления сдавливание не требуется. Если объем крови составляет менее 1 мл, уменьшите время инкубации изофлурана, чтобы обеспечить правильный кровоток. - Немедленно центрифугируют пробирки крови по 2000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Удаляют полученную верхнюю фазу плазмы и с целью мультилипидного анализа аликвотируют определенные объемы плазмы в предварительно охлажденных пробирках 2 мл следующим образом: 50 мкл для анализа eCB/EIC, 30 мкл для анализа PL и оставшийся объем плазмы в качестве резервного образца или для других типов анализа.
- Храните образцы плазмы при температуре -80 °C для дальнейшего извлечения (см. этапы 4.1.2 и 4.1.4).
- Выполните забор периферических органов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ссылки на анатомию мышей16 и документацию, предоставленную для обязательных курсов (FELASA), посещаемых исследователями животных, для идентификации отдельных органов, их соединительных тканей и / или кровеносных сосудов.- Обездвижьте туловище мыши, чтобы облегчить удаление органов с помощью игл. Сделайте вентральный разрез средней линии с помощью прямых острых ножниц на высоте лобка. Используйте тупые стандартные щипцы для фиксации брюшной стенки во время разрезания, чтобы открыть брюшную полость.
- Обездвижить кожу, чтобы позволить удаление органов брюшной полости с помощью тупых щипцов. Для удаления сердца или легких продолжайте медиальный разрез в направлении грудной пещеры. Удалите легкие и / или сердце с помощью тонких щипцов.
- Осторожно откройте грудную полость, чтобы избежать кровотечения. Разрезайте соединительные ткани и кровеносные сосуды, закрепляющие соответствующий орган, не разрезая орган.
- Переложите кусочки ткани сразу на предварительно охлажденные металлические пластины (-80 °C) и дайте полностью замерзнуть. Переложите кусочки ткани в предварительно охлажденные пробирки и храните при -80 °C для дальнейшей обработки (см. этап 4.1).
- Определите порядок отбора проб.
3. Биологическая обработка материала
ПРИМЕЧАНИЕ: Для совместной экстракции eCB/EIC используйте 2 мл янтарных трубок в качестве экстракционных трубок и добавляйте в каждую трубку семь предварительно охлажденных стальных шариков. Для совместной экстракции PL/eCB и для двойной совместной экстракции липидов и РНК используйте 2 мл экстракционных трубок без РНК, шипованных керамическими шариками (Таблица материалов).
- Выполняют рассечение мозга и обработку периферических органов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте увеличительные лампы для увеличения видимости мозга для рассечения.- Очистите хирургические инструменты, в том числе щипцы с очень тонкими наконечниками, в 2 раза с 70% этанолом.
- Перенесите замороженный мозг с -80 °C в чашку Петри, содержащую предварительно охлажденный физиологический буфер (рН 5,5) Убедитесь, что чашка Петри находится при 4 °C. Позвольте мозгу полностью разморозиться, чтобы позволить рассечение. Тщательно проверяйте с помощью щипцов.
ВНИМАНИЕ: Не держите мозг при температуре 4 °C дольше, чем требуется для размораживания. - Предварительно охладите металлическую пластину на льду (4 °C) и накройте ее влажными тканями, пропитанными ледяным физиологическим буфером (рН 5,5), и аккуратно перенесите мозг вентральной стороной вверх на предварительно охлажденную (4 °C) металлическую пластину на льду. Накройте его влажными тканями, пропитанными ледяным физиологическим буфером (рН 5,5).
- Рассекайте области мозга в течение максимум 5 минут, используя супер тонкие щипцы. Начните с гипоталамуса (HYP) и поверните спинную сторону вверх, чтобы продолжить с правой стороны. Изолируйте гиппокамп (HCr), префронтальную кору (PFCr), полосатое тело (STRr) и кору головного мозга (cCTXr). Затем рассекните левую сторону. Изолируйте гиппокамп (HCl), префронтальную кору (PFCl), полосатое тело (STRl) и кору головного мозга (cCTXl). Рассечение мозжечка и таламической области. Используйте опубликованные анатомические ссылки16,17 для идентификации области мозга.
- Переложите каждый рассеченный кусок непосредственно на покрытую алюминиевой фольгой предварительно охлажденную металлическую пластину (-80 °C). Позволяют заморозить и перенести изолированные участки мозга в меченые предварительно охлажденные 2 мл пробирки.
- Измельчите кусочки ткани с помощью тканевого измельчителя (при -80 °C), избегая оттаивания ткани. В холодном помещении аликвотный тканевый порошок в меченых, предварительно охлажденных экстракционных трубках, содержащих керамические бусины или стальные шарики. Для двойного анализа липидомики / транскриптомики взвесьте аликвоты порошка ткани в холодной камере. Для анализа только на липидомику выбирайте между нормализацией веса тканей или содержанием белка. Для последних действуйте дальше без взвешивания тканей.
- Разрезать ткани периферических органов на кусочки с максимальным весом 20 мг. Приступайте к измельчению тканей, как показано на этапе 3.1.6.
- Продолжайте извлечение образцов тканей (см. этапы 4.1.1, 4.1.3 или 4.1.5) или храните пробирки при -80 °C для последующего извлечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица мозга также может быть использована, если позволяет дизайн исследования. Однако метод больше подходит для дискретного и ограниченного числа областей мозга, и нецелесообразно препарировать и изолировать все вышеупомянутые области мозга в установленные сроки.
- Выполняйте удары мозгом.
- Установите целые, замороженные мозги на монтажную систему (Таблицу материалов) в криостате. Установите толщину 50 мкм и нарежьте в режиме обрезки близко к интересующей области.
- Окрашивание мозгового среза (18−20 мкм) с использованием толуидина синего (0,1%−1%) в качестве ориентира для локализации интересующего субрегиона. Осмотрите окрашенные срезы с помощью микроскопа, чтобы определить области, представляющие интерес для пробивки. Используйте атлас мышей в качестве ссылки, чтобы найти соответствующие анатомические области мозга16. Возьмите перфораторы диаметром 0,8−1,0 мм с помощью пробоотборников в предварительно охлажденных пробирках.
- Взвешивайте замороженные перфораторы в холодильной камере в маркированных, предварительно охлажденных экстракционных трубках объемом 2 мл, содержащих керамические шарики или стальные шарики. Используйте янтарные трубки для совместной экстракции eCB и EIC.
- Начните экстракцию (см. этапы 4.1.1, 4.1.3 или 4.1.5) или храните трубы при -80 °C для дальнейшей экстракции.
- Выполните плазменную обработку.
- Поместите замороженные образцы плазмы на лед (4 °C) и дайте им оттаять (~20 мин).
- Убедитесь, что плазма полностью разморожена перед началом экстракции.
- Продолжите процедуру плазменной экстракции (см. шаги 4.1.2 или 4.1.4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы плазмы должны оставаться при температуре -80 °C до экстракции. Избегайте циклов оттаивания и повторного замораживания.
4. Процедуры экстракции
- Выполнение протоколов совместной экстракции липидов жидкостью и жидкостью (LLE).
- Выполняйте совместное извлечение eCB и EIC из кусочков мозга, пуншей или образцов порошка тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры требуется точное дозирование.- Поместите на лед экстракционные трубки, содержащие образцы тканей и семь стальных шариков (4 °C). Добавить 600 мкл ледяного МТБЭ и 50 мкл ACN/H2O (1:1; v/v), содержащие внутренние стандарты. Целевая концентрация внутренних эталонов в конечном объеме для анализа (50 мкл) выглядит следующим образом: 1 нг/мл AEA-d4, 125 нг/мл 2-AG-d5, 3 000 нг/мл AA-d8, 2 нг/мл OEA-d4; ПЭА-д4, 12,5 нг/мл 1-АГ-д5, 2,5 нг/мл PGF2α-d4 и 5 нг/мл для ПГД2-д4; ПГЕ2-д9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 и TXB2-d4 соответственно.
- Добавьте 400 мкл 0,1 М муравьиной кислоты и гомогенизируйте тканевым лизером (30 с-1 мин). Центрифугировать гомогенат в течение 15 мин при 5 000 х г при 4 °C. Оставьте заморозку водной нижней фазы в течение 10 мин при -80 °C, чтобы облегчить перенос верхней органической фазы.
- Перенос органической фазы в новые пробирки. Испаряют под мягким потоком N2 при 37 °C и восстанавливают в 50 мкл ACN/H2O (1:1; v/v) для дальнейшего анализа.
- Храните водную фазу при -20 °C или -80 °C для дальнейшего анализа содержания белка.
- Выполнение совместной экстракции eCB и EIC из образцов плазмы.
- Оттаивание плазменных аликвот при 4 °C. Добавить 800 мкл МТБЭ и 50 мкл ACN/H2O (1:1; v/v), содержащие внутренние стандарты (аналогичные тем, которые используются для анализа тканей, см. шаг 5.1.1). Оптимизируйте внутреннюю стандартную концентрацию для спайков с использованием эталонных образцов плазмы.
- Добавляют 600 мкл 0,1 М муравьиной кислоты и вихревые образцы при 4 °C в течение 2 мин. Образцы центрифуги при 4 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
- Перенесите органическую фазу в новые трубки, испаритесь под мягким потоком N2 при 37 °C и восстановите в 50 мкл ACN/H2O (1:1; v/v) для анализа LC/MRM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, избегайте хранения высушенных экстрактов EIC и немедленно приступайте к анализу LC/MRM. Если хранения не избежать, прибегают к кратковременному хранению только в течение 2−3 дней при 4°С с образцами в инъекционном растворителе LC.
- Выполните совместную экстракцию PL и eCB из областей мозга, ударов или других образцов порошка тканей.
- Поместите экстракционные трубки, содержащие образцы тканей и керамические шарики, на лед (4 °C). Добавьте 800 мкл МТБЭ/МеОГ (10:3; v/v) и 10 мкл MeOH, содержащего внутренние стандарты. Целевая концентрация внутренних эталонов в конечном объеме для анализа (100 мкл) выглядит следующим образом: 150 нг/мл для ПК 17:0/14:1, ПЭ 17:0/14:1, ПА 17:0/14:1, 100 нг/мл PG 17:0/14:1; ПС 17:0/14:1; ПИ 17:0/14:1; LPC 17:0; ЛПА 17:0; SM d18:1/12: 0,1 нг/мл AEA-d4, 60 нг/мл 2-AG-d5, 4 000 нг/мл AA-d8, 2 нг/мл OEA-d2 и 3 нг/мл PEA-d4 соответственно.
- Добавьте 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты, содержащей 25 мкМ тетрагидролипстатина/URB597 и 50 мкг/мл BHT. Гомогенизировать с помощью тканевого гомогенизатора (Таблица материалов) и центрифуги при 5000 х г и 4 °C в течение 15 мин.
- Восстанавливают верхнюю органическую фазу в новых трубках и испаряют под мягким потоком N2 при 37 °C. Восстановите в 90 мкл MeOH и либо храните при -20 °C или -80 °C, либо переходите к следующему шагу.
- Добавьте 10% H2O к аликвоте липидного экстракта (4.1.3.3) и введите 10 мкл в LC/MS для анализа PL. Для дальнейшего анализа eCB перейдите к этапу 4.3.5.
- Взять аликвоту экстракта (4.1.3.3), испарить до сухости и восстановить в ACN/H2O (1:1; v/v). Используйте 20 мкл для инъекции LC/MS для анализа eCB.
- Выполнение совместной экстракции ПЛ и эХБ из образцов плазмы.
- Размораживают плазменные аликвоты при 4 °C, добавляют 1000 мкл МТБЭ/метанола (10:3; v/v) и 10 мкл MeOH, содержащих внутренние эталоны (аналог стадии 4.1.3) и вихревые при 4 °C в течение 1 мин.
- Добавьте 250 мкл H2O и вихрь в течение 45 мин при 4 °C. Образцы центрифуг в течение 15 мин при 5 000 х г и 4 °C. Восстанавливают верхнюю органическую фазу, испаряют под мягким потоком N2 при 37 °C и восстанавливают в 90 мкл метанола для дальнейшего анализа LC/MS. Хранить при температуре -20 °C или -80 °C или перейти к следующему шагу.
- Для анализа ПЛ добавьте 10% воды к аликвоте липидного экстракта (4.1.2.2).
- Для анализа eCB добавьте 10% воды к аликвоте липидного экстракта (см. пункт 4.1.4.3), испарите до сухости и восстановите в 50% ACN/H2O (1:1; v/v).
- Выполните двойную экстракцию РНК и липидов (совместная экстракция PL и eCB) из образцов тканей.
ВНИМАНИЕ: Обеспечьте работу в условиях, свободных от РНК, чтобы избежать деградации РНК.- Разморозьте тканевые порошковые аликвоты или мозговые пучки (при 4 °C) и добавьте 600 мкл буфера RLT, содержащего 5 мкМ THL/URB597, 10 мкг/мл BHT и 1% β-меркаптоэтанола (для процентов конечного объема буфера гомогенизации см. этап 4.1) вместе с 200 мкл хлороформа в экстракционные трубки, содержащие замороженные мозговые пунши и керамические шарики.
- Шиповые образцы с 10 мкл внутренней стандартной смеси для совместной экстракции ПЛ и eCB (см. этап 4.1.3) и гомогенизация с помощью гомогенизатора тканей (высокая скорость, 20 с).
- Передавайте лизаты в новые центрифужные трубки и центрифугу в течение 5 мин на полной скорости и 4 °C, чтобы обеспечить разделение фаз.
- Восстановление и использование верхней фазы для экстракции РНК с использованием стандартных наборов процедур экстракции РНК (Таблица материалов). Элюированная РНК в общем объеме 50 мкл воды без РНКазы и хранится при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец на этапе 4.1.5.4 поддается как секвенированию РНК, так и qPCR с использованием соответствующих методов и инструментов. - Используйте нижнюю хлороформсодержащую фазу для экстракции липидов. Добавьте 800 мкл МТБЭ/метанола (10:3; v/v) и 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты и вихрь в течение 45 мин при 4 °C. Восстанавливают верхнюю органическую фазу и испаряют под мягким потоком N2 при 37 °C.
- Восстанавливают в 90 мкл метанола для дальнейшего анализа ЛК/МС. Хранить при температуре -20 °C или -80 °C или перейти к шагу 5.
- Добавьте 10% H2O к аликвоте липидного экстракта (см. выше этап 4.1.5.6) и введите 10 мкл в LC/MS для анализа ПЛ. Для дальнейшего анализа eCB перейдите к этапу 5.7.
- Взять аликвоту экстракта (см. выше этап 4.1.5.6) испарить до сухости и восстановить в ACN/H2O (1:1; v/v). Используйте 20 мкл для инъекции LC/MS для анализа eCB (аналогично шагу 4.3.5).
- Выполняйте совместное извлечение eCB и EIC из кусочков мозга, пуншей или образцов порошка тканей.
5. Качественное и количественное профилирование LC/MRM
- Подготовка систем растворителей LC, калибровочных растворов и образцов контроля качества.
- Для ПЛ готовят подвижную фазу А: метанол/воду (1:1; об/об), содержащую 7,5 мМ формиата аммония и 0,1% ЧАЯ. Получают подвижную фазу B: метанол/изопропанол (2:8; v/v), содержащий 7,5 мМ формиата аммония и 0,1% TEA. Храните растворители в бутылках LC.
- Для разделения eCB и eiC готовят следующие LC-растворители: 0,1% муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы A и 100% ACN, содержащей 0,1% муравьиной кислоты, в качестве подвижной фазы B. Храните растворители в бутылках LC.
- Подготовка контроля качества с использованием калибровочных стандартов и внутренних стандартов (таблица 3) в эквимолярной или определяемой пользователем концентрации.
- Подготовьте калибровочные кривые с семью точками концентрации. Используйте одну и ту же внутреннюю стандартную партию для пикирования в растворе калибровочной кривой и в образцах, подлежащих анализу.
- Используйте метод LC-MRM для качественного и количественного профилирования липидов.
- Откройте вкладку Build Acquisition Method (Метод сборки ) в коммерческом программном обеспечении (например, Analyst) и выберите режим LC/MRM с переключением полярности. Заданные в методе ионные переходы (как приведено в таблице 3) для количественного профилирования. Установите время успокоения равным 50 мс.
- Для профилирования ПЛ задайте следующие параметры источника ионов: газ завесы = 40 фунтов на кв. дюйм; температура нагревателя источника = 550 °C; напряжение ионного распыления = -4 500 В в режиме отрицательных ионов и = +5 200 В в режиме положительных ионов.
- Для совместного анализа эХБ и ЭИК задайте следующие параметры: газ завесы = 40 фунтов на кв. дюйм; температура нагревателя источника = 550 °C; напряжение ионного распыления = -4 500 В в режиме отрицательных ионов и = +4 500 В в режиме положительных ионов.
- Для анализа PL установите нагрев колонны на 45 °C и скорость потока на 200 мкл/мин и установите следующий градиент: min 0 = 40% B; мин 3 = 40% В; мин 42 = 90% В; мин 43 = 99% В; min 50 = 99% B, и min 52 = 40% B. Установите объем инъекции на уровне 10 мкл.
- Для анализа eCB и eCs установите температуру колонки при комнатной температуре и установите следующий градиент: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; мин 5 = 50% В, мин 12 = 50% В; мин 13 = 90% В, мин 17 = 90% В; мин 17,5 = 20% В; min 20 = 20% B. Установите объем впрыска на уровне 20 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия MRM могут варьироваться между инструментальными платформами, поэтому условия фрагментации и MRM должны быть экспериментально выведены, а параметры ионизации должны быть проверены и скорректированы, если это необходимо, чтобы получить максимальную чувствительность и селективность.
- Выполните пакетный анализ.
- Откройте пакет Build Acquisition и заполните необходимые параметры для описания образца, расположения в стойке образцов автосамплера и метода сбора (задайте шаг 5.2).
- Всегда включайте контроль качества в начале и в конце анализа и в рамках партии. После каждых 25−30 образцов включают по меньшей мере три калибровочные кривые в партию и включают этап промывки с растворителем по выбору после каждого образца контроля качества, калибровочной кривой и в конце партии образца.
- Передавайте образцы, полученные на этапе 4, во флаконы LC/MS. Поместите образцы в загрузочные стойки автопробоотборника LC в соответствии с положением, определенным в партии, и загрузите стойку для образцов в автопробоотборник LC.
- Отправьте пакетный и начните анализ очереди.
- Количественная оценка липидов
- Используйте коммерческое программное обеспечение (например, Analyst) и встроенный модуль количественной оценки для количественной оценки eCB и EIC, а также коммерческое программное обеспечение (например, Multiquant) для количественной оценки ПЛ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Второе программное обеспечение может также использоваться для eCB и EIC, особенно когда один внутренний стандарт используется для количественной оценки нескольких аналитов. - Откройте метод построения количественной оценки и заполните параметры для аналитов, внутренних стандартов, переходов управления записями сообщений и припишите внутренние стандарты анализируемым аналитам (таблица 3). Установите минимальную пиковую высоту 500 cps.
- Использовать следующие критерии или их комбинацию для присвоения липидной идентичности и последующей количественной оценки6: сопоставление времени удержания липидных эндогенных аналитов с калибровочными стандартами и/или дейтерированными внутренними стандартами, если таковые имеются; согласование ионов фрагментов путем фрагментации положительного и отрицательного ионного режима для данного м/з липидных аналитов, для которых не предусмотрены стандарты; выведенное в литературе элюирующее поведение липидов в аналогично используемых условиях LC для рассечения изомерных и/или изобарических структур; и, при наличии, анализ LC/MS и MS/MS с масс-спектрометрией высокого разрешения с использованием условий LC, аналогичных условиям LC для целевого анализа (с использованием LC/MRM), для точной идентификации идентичности и элюционного поведения эндогенных липидов, представляющих интерес18,19.
- Для валидации пакетного анализа используют следующие критерии: точность количественной оценки ≤ ±20%; коэффициент регрессии ≥0,97 (в идеале ≥0,99).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям по разработке и валидации биоаналитических методов для обеспечения надежного, воспроизводимого анализа молекул-мишеней.
- Используйте коммерческое программное обеспечение (например, Analyst) и встроенный модуль количественной оценки для количественной оценки eCB и EIC, а также коммерческое программное обеспечение (например, Multiquant) для количественной оценки ПЛ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Набор описанных протоколов может быть объединен на различных уровнях в соответствии с конкретными целями, такими как выбор модели животного происхождения, маршрут отбора проб, метод извлечения и профилирования (фиг.1).
Чтобы определить изменения уровня липидов в головном мозге и периферии в течение времени острого состояния эпилептического припадка и разгадать потенциальный противоэпилептический эффект ПЭА13 и его влияние на липидомные изменения в мозге и периферии, три экспериментальные группы животных лечились транспортным средством, КА для индуцирования острой эпилепсии и ПЭА в качестве кандидата на противоэпилептическое лекарство. ПЭА вводили через i.p. до введения KA-инъекции (например, с одной инъекцией PEA для острого лечения и двумя инъекциями PEA для субхронического лечения). С целью многократного молекулярного анализа и/или окрашивания иммуногистохимией через 5 дней после лечения эксперименты на животных повторяли по мере необходимости (рисунок 2).
КА-индукция острых эпилептических припадков приводит к максимальной интенсивности припадка через 1 ч после инъекции15 (рисунок 3). Чтобы разгадать изменения мозгового и периферического уровня липидов в состоянии максимальной интенсивности судорог, мышей приносили в жертву через 1 ч после KA-инъекции, а затем проводили забор плазмы, мозга и периферических органов. Замороженный мозг был рассечен в шести областях мозга (см. шаг 3.1). Области мозга и ткани периферических органов (сердца и легких) измельчали для получения однородных образцов тканей и впоследствии аликвотировали для двух липидомических профилирований eCB и eCs (рисунок 4A и стадия 4.1.1) и PLs и eCB (рисунок 4B и этап 4.1.3).
Протокол двойной экстракции (см. шаг 4.1.5) применялся для выполнения PL/eCB и РНК с более высоким пространственным разрешением путем профилирования ударов мозга в разных областях: гипоталамусе (HYP), базолатеральной миндалине (BLA) и вентральном (vHC) и дорсальном (dHC) гиппокампе (рисунок 5). Пунши были отобраны (см. этап 3.2) у индуцированных КА эпилептических мышей и контрольных мышей в максимальном судорожном состоянии через 1 ч после инъекции КА (рисунок 2).
Чтобы оценить степень нейродегенерации и отнести изменения липидов к степени нейродегенерации при эпилепсии и при новом лечении эпилепсией ПЭА, иммуногистохимическое двойное окрашивание проводили на участках мозга (см. шаг 1.3), отобранных через 5 дней после Индуцированных КА эпилептических припадков (рисунок 2) у мышей без субхронического лечения ПЭА (средняя), с субхроническим лечением ПЭА (справа) и у мышей, введенных физиологическим раствором (слева) (рисунок 6) ). KA-индуцированный эпилептический статус (SE) вызвал массивную потерю сигнала NeuN, преимущественно в области CA1, CA3 и hilus гиппокампа, сопровождаемую апоптотическими событиями, обозначенными сигналом caspase-3 (CASP3) (рисунок 6, среднее изображение) по сравнению с контролем (рисунок 6, левое изображение). Субхроническая PEA-обработка (правое изображение), в частности, сохраняет сигнал белка нейрональных ядер (NeuN), тогда как сигнал (CASP3) едва обнаруживается.
| Раствор для инъекций KA- и SAL . |
| Раствор для инъекций KA (конечный объем 8 мл): |
| 1. Взвесьте 24 мг КА в пробирке 15 мл (осторожно: носите шарики и маску) |
| 2. Добавьте 8 мл физиологического раствора и вихря в течение 10 мин |
| 3. Хранить при температуре 4°C для промежуточного хранения |
| 4. Восстановление до комнатной температуры и вихря перед инъекцией |
| Транспортное средство 1 раствор для впрыска (конечный объем 8 мл): |
| Пропустите шаг 1 и перейдите к шагам 2–4 |
Таблица 1: Препарат препарата, вызывающего изъятия, и транспортное средство 1 применение. Этапы приготовления раствора для инъекций кайновой кислоты (КА) для 24 внутрибрюшинных инъекций (10 мл/кг) в конечной концентрации 30 мг/кг и соответствующего раствора для впрыска транспортного средства (транспортное средство 1)1.
| PEA- и SAL/DMSO/Кремофор (18:2:1, (v/v/v)) раствор для инъекций. |
| Раствор для инъекций ПЭА (конечный объем 8 мл): |
| 1. Взвесьте 32 мг ПЭА в пробирке 15 мл |
| 2. Добавьте 0,4 мл DMSO и вихрь в течение 10 мин |
| 3. Добавьте 3,4 мл SAL и вихрь в течение 5 мин |
| 4. Ультразвуковая смесь в течение 5 мин при 36°C |
| 5. Добавьте 0,4 мл кремофора и вихря в течение 5 мин |
| 6. Ультразвук в течение 1 мин при 36°C и добавьте 3,4 мл SAL |
| 7. Вихрь в течение 30 сек и обработка ультразвуком в течение 3 мин при 36°C |
| 8. Держите раствор при 36°C на низкой скорости в шейкере и вихре перед инъекцией |
| Раствор для впрыска Vehicle 2 (конечный объем 8 мл): |
| Пропустите шаг 1 и перейдите к шагам 2–8 |
Таблица 2: Препарат противоэпилептического препарата и средство 2 применения. Примерные этапы приготовления раствора для инъекций пальмитоилэтаноламида (ПЭА) для 24 внутрибрюшинных инъекций (10 мл/кг) в конечной концентрации 40 мг/кг и соответствующего раствора для впрыска в транспортном средстве (транспортное средство 2)1.
| Режим положительных ионов | ||||||
| Выбранные калибровочные стандарты PL | Соответствующие внутренние стандарты | |||||
| Аналит | Ион-предшественник | Ион продукта м/з | Аналит | Ион-предшественник | Ион продукта м/з | |
| имя | м/з | имя | м/з | |||
| АЕА | 348.3 | 62.1 | АЭА-д4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-АГ | 379.1 | 287.2 | 2-АГ-д5 | 384.2 | 287.2 | |
| ОЭА | 326.2 | 62.1 | ОЭА-д2 | 328.2 | 62.1 | |
| ГОРОХ | 300.2 | 62.1 | ПЭА-д4 | 304.2 | 62.1 | |
| ПК 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | ПК 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| ПК 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| ПК 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| ЛПЦ 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| СМ д18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | СМ д18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| Отрицательный ионный режим | ||||||
| Выбранные калибровочные стандарты PL | Соответствующие внутренние стандарты | |||||
| Аналит | Ион-предшественник м/з | Ион продукта м/з | Аналит | Ион-предшественник | Ион продукта м/з | |
| имя | имя | м/з | ||||
| АА | 303.05 | 259.1 | АА-д8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-HETE | 319.48 | 115 | 5(S)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-HETE | 319.48 | 155 | 12(S)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(С)-ХЕТЕ | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20-ГЕТ | 319.48 | 289 | 20-ГЕТЕ-д6 | 325.48 | 295 | |
| ЛхА4 | 351.5 | 115.2 | ЛхА4-д5 | 356.5 | 115 | |
| ПГФ2 α | 353.48 | 309.2 | ПГФ2 α-д4 | 357.5 | 313.3 | |
| ТхБ2 | 369 | 169 | ТхБ2-д4 | 373 | 173 | |
| ПГЭ2 | 351.47 | 315.3 | ПГЕ2-д9 | 360.25 | 324.3 | |
| ПГД2 | 351.47 | 315.3 | ПГД2-д4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| РвД1 | 375.22 | 215.1 | РвД1-д5 | 380.22 | 180.2 | |
| ПЭ 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | ПЭ 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| ПЭ 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| ПЭ 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| ПЭ 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| ПА 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | ПА 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| ЛПА 16:0 | 409.24 | 153 | ЛПА 17:0 | 423.25 | 153 | |
| ЛПА 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| ЛПИ 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| ПГ 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | ПГ 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| ПГ 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| ПГ 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| ПИ 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | ПИ 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| ПС 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | ПС 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| ПС 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| ПС 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| ПИ 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | ПИ 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| ПИ 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| ПИ 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| С1П д18:1 | 378.24 | 78.9 | С1П д17:1 | 364.23 | 78.9 | |
Таблица 3: Липидные стандарты и переходы МИМ для целевого анализа липидомики. Содержание таблицы было первоначально опубликовано в Lerner et al.2
Рисунок 1: Обзор модулей рабочего процесса. В зависимости от цели исследования и различных путей отбора проб, извлечение и профилирование могут быть объединены для обеспечения значительного результата исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальный дизайн модели эпилептического припадка, индуцированного острой кайновой кислотой (KA), у мышей. Мышей либо лечат 1) физиологическим раствором (10 мл/кг в.п.); 2) КА (30 мг/кг в/п.); и/или 3) (суб) хронически предварительно обработанные (1−2x 40 мг/кг в.п.) потенциальным противоэпилептическим соединением пальмитоилэтаноламид (ПЭА). Двадцать четыре мыши в группе рассматривались так, как указано выше, и поведение оценивалось для оценки интенсивности судорог. Шесть мышей в группе были принесены в жертву в каждой из четырех различных временных точек (T1−T4) для определения изменений уровня липидов в течение времени острого эпилептического припадочного состояния в мозге, периферических органах и плазме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Поведенческая оценка в течение времени эпилепсии, вызванной острой кайновой кислотой (KA), по сравнению с контрольной группой. Оценка интенсивности приступов в течение 180 мин после индукции KA-припадка (n = 24) или инъекции физиологического раствора (n = 24), данная как средние поведенческие баллы. Не было обнаружено различий между группами инъекций транспортного средства 1 и транспортного средства 2. Погрешности = SEM. Повторное измерение ANOVA дало значительные взаимодействия между временными точками измерений и тестовыми группами, что указывает на значительное влияние лечения КА на поведенческие показатели. Интенсивность судорог мышей, получавших КА, была первоначально опубликована в Post et al.13Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Уровни липидов в головном мозге и периферических тканях при остром эпилептическом припадке. Изменения уровня липидов представлены как среднее значение ± SEM при максимальной интенсивности судорог (например, 1 ч после инъекции KA) в шести областях мозга (n = 9): коре головного мозга (cCTX), полосатом теле (STR), таламической области (THL), гиппокампе (HC), гипоталамусе (HYP), мозжечке (CER), а также сердце и легочной ткани у KA-индуцированных эпилептических мышей (верхнее значение) и контрольной группы (нижнее значение). Уровни базальных липидов в тканях изображены серым цветом. Значения PLs, 2-AG и AA приведены в нмоль/г., а значения для NAE, EIC и AEA в pmol/g, соответственно. Все уровни липидов нормализуются до массы тканей. Чтобы подчеркнуть специфические молекулярные изменения, уровни липидов мышей, получавших КА, представлены в виде процента от введенного физиологического раствора (КА/сал) на тепловой карте, отображающей пониженные значения при острой интенсивности судорог по сравнению с контролем, изображены светло-синим цветом, а повышенные уровни по сравнению с контролем красным цветом, соответственно. Они считаются значимыми при значении p <0,05. Эти данные были первоначально опубликованы в Lerner et al.2Пожалуйтесь, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Двойное извлечение eCB/PL и РНК для количественного профилирования из ударов мозга мыши. (A) Количественное распределение отдельных ПЛ и эХБ по: 1) субрегиону гипоталамуса (ГИП); 2) базолатеральная миндалина (БЛА); и 3) вентральный (vHC) и дорсальный (dHC) субрегионы гиппокампа от мышей эпилептического припадка, индуцированного KA (верхнее значение) по сравнению с контрольной группой (нижнее значение) (n = 10). Уровни нормализуются до массы ткани (пунши соответствуют примерно 0,5−1,5 мг) и экспрессируются в нмоль/г. Только АЭА выражается в пмоле/г. Уровни липидов представлены как среднее значение ± SEM. Среднее изменение на перфорированную область мозга (SEM в процентах от среднего, усредненное по всем липидам) составляет: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; и dHC = 7,90%, соответственно. (B) Относительные уровни экспрессии эндогенных ферментов и рецепторов, участвующих в передаче липидных сигналов, а также маркеры активности мозга, исследованные на уровне мРНК в различных областях мозга / субрегионах у мышей, подвергшихся Индуцированному KA эпилептическому припадку (красный) и контрольной группе (светло-серый). Статистический анализ разницы между групповыми средними проводился с использованием двуххвостого непарного t-теста Стьюдента и считался значимым при значении p <0,05 (n = 10). Эти данные были первоначально опубликованы в Lerner et al.7Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Иммуногистохимическое neuN и двойное окрашивание CASP3. Пятидневную иммуногистохимию после инъекции КА проводили на участках мозга у необработанных мышей, введенных физиологическим раствором (слева), субхронически обработанных мышей с ПЭА (средняя) и эпилептических мышей без предварительной обработки (справа). Предварительное лечение ПЭА показывает нейропротекторные эффекты по сравнению с нелеченными эпилептическими мышами (n = 3). Эти данные были первоначально опубликованы в Post et. al.13Пожалуйстайте, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нейролипидомная и транскриптомная методология, описанная здесь, является жизнеспособным средством для исследования любого заболевания или здорового развития при высоком и низком пространственном разрешении в мозге и периферических органах. Благодаря оптимизированному отбору образцов плазмы и процедурам обработки, липидомный анализ плазмы также может проводиться у тех же животных, принесенных в жертву для тканевой липидомики и транскриптомики, что повышает надежность молекулярных коррелятов тканевой крови и обнаружения биомаркеров. Предоставление широкого набора данных путем применения любого из трех протоколов или их комбинаций имеет значение для исследования не только неврологического заболевания в контексте (эксперимент на животных моделях), но и в контексте экспериментальной модели и между ними. Кроме того, высокий уровень стандартизации отбора проб, обработки и молекулярного анализа способствует высокой воспроизводимости молекулярных данных, что позволяет надежно ссылаться на молекулярные изменения между исследованиями и лабораториями и внутри них.
Однако для достижения этой цели решающее значение имеет установка экспериментального проекта, который предлагает максимальный потенциал считывания для определенной цели исследования. Для достижения достоверного сравнения молекулярных изменений между экспериментальными группами рекомендуется использовать минимум десять животных для компенсации изменчивости животных и биологического диапазона уровней липидов. Когда закупка животных и / или логистика обработки животных являются ограничительными, использование как минимум шести животных на группу является обязательным для обеспечения уверенного статистического анализа. Расчеты размера группы должны компенсировать коэффициенты смертности, связанные с моделью (т.е. для исследования требуется минимум шесть, в идеале десять животных на группу, несмотря на возможный уровень смертности модели). Критическим условием является обеспечение соответствия возрасту, полу и штамму животных в каждой экспериментальной группе. Для фазы открытия важно использовать одного и того же поставщика для экспериментальных животных для всех исследований и одну и ту же партию животных, если это возможно, чтобы избежать смещения результатов из-за возможных поведенческих и молекулярных фенотипических различий между партиями животных. Для обеспечения надежности и воспроизводимости молекулярного и поведенческого фенотипа, определенного в исследованиях, крайне важно по возможности проводить биологический реплицированный анализ.
Другим важным шагом является создание стандартизированной, запланированной экспериментальной работы с группами животных. Крайне важно лечить животных в течение одного и того же временного окна дня, чтобы обойти циркадную молекулярную изменчивость. Время суток должно быть установлено в соответствии с известным влиянием циркадного ритма на синтез и деградацию молекул-мишеней или поддерживаться постоянным для всех экспериментальных групп, когда информация о влиянии циркадного ритма недоступна. Аналогичным образом, условия содержания и кормления до жертвоприношения животных должны поддерживаться последовательными и строго контролироваться экспериментальными моделями. Это особенно актуально для липидомного профилирования из-за влияния питания на липидную плазму и тканевой обмен. Введение терапевтических или вызывающих заболевание препаратов должно неизменно осуществляться параллельно с введением транспортного средства в контрольных группах, при этом транспортное средство должно быть таким же, как и то, которое используется для введения лекарственного средства. Для того, чтобы выбрать наиболее подходящий штамм грызунов и/или субстэды для целей исследования, стратегии лечения на основе лекарств должны осуществляться в соответствии со специфичностью препарата с точки зрения времени и частоты введения, доз и пути введения, а также конкретной восприимчивости к препаратам различных штаммов, выведенных из литературы и/или предыдущего опыта. Временное исследование заболевания и реакции на терапию с участием больших когортных групп или нескольких групп животных невозможно провести за один день с точки зрения лечения, жертвоприношения и отбора проб. В таких случаях обработка группы животных должна планироваться и проводиться в последовательные дни, но с соблюдением тех же условий с точки зрения времени суток, экспериментального проектирования, времени обработки, исследователей и т. Д. Подготовка химических инъекций является еще одним критическим шагом. Лекарственные или индуцирующие заболевание соединения должны быть свежеприготовлены перед введением и в соответствии со спецификациями лекарственного средства. Применение одной и той же производственной партии препарата рекомендуется для сравнения всех когорт. Это особенно важно в случае натуральных составов соединений, таких как каиновая кислота (КА), используемых в этом исследовании для индукции эпилепсии.
Чтобы обеспечить надежное липидомическое и /или транскриптомическое профилирование, процедура жертвоприношения животных должна выполняться последовательно во всех группах животных в течение 5 минут. Если кровь собирается после обезглавливания, важно поддерживать постоянное количество изофлурана в стеклянной камере. Для этого часто замачивайте (после пяти применений) изофлураном и не превышайте 10 с на время анестезии с использованием изофлурана, чтобы избежать возникновения аритмии и сердцебиения и обеспечить надлежащее артериальное давление для забора плазмы.
Условия отбора проб биологических материалов и обращения с ними (например, временное окно и порядок отбора проб биологических материалов и обращения с ними) должны строго соблюдаться и поддерживаться одинаковыми для всех групп. Чтобы избежать различных степеней оттаивания тканей и, следовательно, непоследовательных изменений уровня липидов и/или мРНК ex vivo, важно поддерживать строго контролируемые временные и температурные условия для пост-отбора проб
хранение. вскрытие или штамповка тканей, а также последующая обработка и анализ образцов (см. разделы 3 и 4). Свежеотбираемый целый мозг может быть немедленно вскрыт на предварительно охлажденной металлической пластине (4 ° C) без предварительного замораживания, если размер экспериментальных групп животных позволяет жертвовать, удалять и рассеивать животных без изменения временных рамок, указанных здесь для каждой из этих процедур. Если размер экспериментальных групп не практичен для этих процедур, рекомендуется мгновенное замораживание мозга и последующее рассечение, чтобы обеспечить сопоставимое и контролируемое время для обработки. При строгом следовании протоколам и временным рекомендациям, указанным здесь, не наблюдалось никаких расхождений между молекулярными уровнями, полученными путем извлечения свежерассеченных областей мозга, и областями мозга, рассеченными из замороженного мозга.
Критическим аспектом для достижения воспроизводимой и минимальной изменчивости уровней липидов внутри и между группами, помимо обработки проб в строго контролируемых температурных условиях, является предоставление антиоксидантов (см. разделы 2 и 3). Избегание любых стрессовых факторов (например, запаха крови) животных до жертвоприношения имеет первостепенное значение, поскольку многие липиды, участвующие в нейронной активности, такие как eCB, могут быстро меняться в ответ на стресс.
Для экстракции и анализа липидов важно только что подготовить внутренние стандарты, калибровочные растворы и экстракционные растворители в день экстракции. Один и тот же источник внутренних эталонов должен использоваться как для подготовки калибровочной кривой, так и для извлечения проб. Кроме того, следование строго контролируемым температурным условиям для извлечения, хранения и анализа образцов имеет первостепенное значение для минимизации и контроля ферментативных или химических изменений молекул ex vivo. Для анализа LC/MRM набор целевых липидов может быть адаптирован к цели исследования путем добавления или удаления мишеней и, соответственно, внутренних стандартов и калибрантов при условии, что разделение, обнаружение и переходы MRM для нового набора липидов оптимизированы. Представленные протоколы извлечения позволяют предоставлять две реплики LC/MRM для eCB и eIC, что имеет важное значение для случаев технического сбоя или когда реплицированный анализ имеет значение для исследования. Протоколы экстракции PL делают количества образцов/экстрактов пригодными для по меньшей мере 10 анализов на экстракт (например, многократные эксперименты сканирования на основе сканирования ионов прекурсоров и нейтральных потерь2, соответственно; дополнительные анализы LC /MRM; или реплики LC/MRM для компенсации технического сбоя во время запуска). Анализ липидов не ограничивается LC/MRM; на самом деле липидные экстракты, полученные с помощью любого из этих протоколов, поддаются непривязанному, высококлассному масс-спектрометрическому анализу. За исключением ударов мозга или незначительного количества тканей, полученных из дискретных областей (менее 3 мг), замороженные измельченные ткани областей размером более 2−3 мг могут быть аликвотированы и использованы для нескольких экстракционных модулей, как описано здесь для реплицированного анализа и/или для других исследований, поддающихся исследованию в тканевом порошке.
Общим преимуществом описанных здесь протоколов по сравнению с широко используемыми является повышенная общая временная эффективность и чувствительность для многокомпонентной добычи и анализа при снижении затрат на ресурсы животных, расходные материалы и затраты на анализ. Важно отметить, что протокол двойной экстракции липидов/мРНК также обеспечивает более высокую эффективность экстракции мРНК20,21 и целостность мРНК по сравнению с соответствующими доступными стандартными протоколами и одновременно повышает эффективность экстракции липидов7. Это, вероятно, также связано с уменьшением матричного эффекта для каждой из фракций липидов и мРНК при двойном извлечении. Благодаря этому метод легко применим для профилирования с высоким пространственным разрешением, например, при ударах мозга.
Однако в настоящее время ограничение протокола заключается в том, что воспалительные липиды не поддаются анализу и количественной оценке с использованием двойной экстракции липидов / мРНК. Таким образом, протокол подлежит дальнейшему уточнению. С этой целью тканевые и плазменные воспалительные липиды и эндоканнабиноиды могут быть совместно экстрагированы и совместно проанализированы, что является оптимизированным инструментом для одновременного исследования нейровоспалительных процессов и эндоканнабиноидной нейронной активности (см. Коэкстракция EIC и eCB). Ожидается, что включение фосфолипидов в этот последний анализ будет осуществимым.
С учетом перспективных мультиомных подходов к неврологическим заболеваниям ожидается проведение протеомного анализа белковых фракций, полученных после протокола экстракции липидов (т.е. совместной экстракции эХБ и ЭИС, а также совместной экстракции ПЛ и эХБ). Однако это пока невозможно при использовании протокола двойного липида/мРНК. Для последнего химическая среда экстракции исключает даже определение количества белка с использованием стандартных белковых анализов, таких как анализ бицинхониновой кислоты (BCA). Планируется дальнейшее развитие событий для преодоления этого ограничения и ускорения включения протеомного профилирования в эти протоколы.
Используя модульный протокол, описанный здесь, удалось получить региональную карту мозга eIC, eCB и PL в животной модели острых эпилептических припадков (рисунок 4). Протокол показал гиппокампальную модуляцию воспалительных процессов с помощью EIC и модуляцию активности нейронов eCB у обработанных и необработанных мышей с KA-индуцированными острыми судорогами13. Также наблюдалась субрегиональная локализация в мозге изменений фосфолипидов, эндоканнабиноидов и мРНК при острых эпилептических припадочных состояниях соответственно (рисунок 5). Эти результаты подчеркивают ценность и применимость методов, описанных здесь, в продвижении знаний о широком спектре липидов, участвующих в модуляции сложных неврологических заболеваний, таких как эпилепсия в областях мозга и субрегионах. Эти протоколы имеют общую применимость в исследовании неврологических заболеваний и за его пределами, в то время как дальнейшая разработка протоколов и приложений для клеточных популяций продолжается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы посвящаем эту статью доктору Эрмелинде Ломаццо. Во время завершения этой рукописи доктор Эрмелинда Ломаццо скончалась. Она является воплощением страсти к науке и самоотверженного участия в командной работе для выполнения значимой исследовательской цели. Она всегда мечтала внести значимый вклад в большее благосостояние людей. Ее добросердечная натура никогда не была скомпрометирована напряженными дорогами науки и жизни. Она останется бесценной и навсегда в наших сердцах.
Джулия М. Пост финансировалась Программой фокусировки по трансляционной неврологии (FTN) в Университетском медицинском центре Университета Иоганна Гутенберга в Майнце и в настоящее время финансируется проектом SPP-2225 EXIT для LB. Раиса Лернер частично финансировалась проектом DZHK 81X2600250 для LB и Lipidomics Core Facility. Частичное финансирование этих исследований было предоставлено Основным центром липидомики, Институтом физиологической химии и очными фондами (для LB) из Университетского медицинского центра Университета Иоганна Гутенберга в Майнце.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
- Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
- Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
- Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
- Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J.
- Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
- Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
- Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
- Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
- Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
- Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
- Konsman, J. P.
- Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
- Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
