Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipidomikk og transskriftomikk ved nevrologiske sykdommer

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/59423
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

Denne artikkelen presenterer en modulær protokoll for vev lipidomikk og transkripsjonomikk, og plasma lipidomics i nevrologiske sykdom mus modeller rettet mot lipider underliggende betennelse og nevronal aktivitet, membran lipider, nedstrøms budbringere, og mRNA-koding enzymer / reseptorer underliggende lipid funksjon. Prøvetaking, prøvebehandling, ekstraksjon og kvantifiseringsprosedyrer er skissert.

Abstract

Lipider tjener som det primære grensesnittet til hjerne fornærmelser eller stimuli bidrar til nevrologiske sykdommer og er et reservoar for syntese av lipider med ulike signalering eller ligand funksjon som kan understreke utbruddet og progresjonen av sykdommer. Lipider endrer seg ofte på presymptomatisk nivå, og er en fremvoksende kilde til narkotikamål og biomarkører. Mange nevrologiske sykdommer viser nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon og nevronal spenning som vanlige kjennetegn, delvis modulert av spesifikke lipidsignalsystemer. Gjensidig avhengighet og sammenheng mellom syntese av ulike lipider fører til en multilipid, multienzyme og multireseptoranalyse for å utlede fellestrekk og spesifisiteter i nevrologiske sammenhenger og for å fremskynde unravelling av mekanistiske aspekter ved sykdomsde begynnelse og progresjon. Ascribing lipid roller til distinkte hjerneregioner fremmer bestemmelse av lipid molekylær fenotype og morfologi forbundet med en nevrologisk sykdom.

Presentert her er en modulær protokoll egnet for analyse av membranlipider og nedstrøms lipidsignaler sammen med mRNA av enzymer og mediatorer som ligger til grunn for deres funksjonalitet, hentet fra diskrete hjerneregioner som er relevante for en bestemt nevrologisk sykdom og / eller tilstand. For å sikre nøyaktig komparativ lipidomisk profilering ble arbeidsflytene og driftskriteriene optimalisert og standardisert for: i) hjerneprøvetaking og disseksjon av interesseregioner, ii) samtidig utvinning av flere lipidsignaler og membranlipider, iii) dobbel lipid/mRNA-ekstraksjon, iv) kvantifisering ved væskekromatografi multippel reaksjonsovervåking (LC/MRM) og v) standard mRNA-profilering. Denne arbeidsflyten er egnet for de lave vevsmengdene oppnådd ved prøvetaking av de funksjonelt diskrete hjerneunderregionene (dvs. ved hjernestansing), og forhindrer dermed skjevheter i multimolekylær analyse på grunn av vevs heterogenitet og / eller dyrs variasjon. For å avdekke perifere konsekvenser av nevrologiske sykdommer og etablere translasjonelle molekylære avlesninger av nevrologiske sykdomstilstander, perifer organprøvetaking, behandling og deres påfølgende lipidomiske analyse, samt plasma lipidomikk, forfølges og beskrives også. Protokollen er demonstrert på en akutt epilepsimusmodell.

Introduction

Nylige fremskritt i funksjonen av lipider og deres rolle i utbruddet og progresjonen av nevrologiske sykdommer åpner nye forsknings- og utviklingssteder for nye terapeutiske mål og sykdomsmekanisme belysning1. Dokumenterte forskjeller i lipidsammensetning i ulike hjerneregioner, understreket av moderne molekylære avbildningsteknikker som massespektrometriavbildning og avansert massespektrometriprofilering, skifter paradigmet for lipidundersøkelse fra hele hjernen til funksjonelt distinkte og diskrete hjerneregioner. Det faktum at lipidsammensetning varierer i forskjellige hjerneregioner, fører til ny konseptualisering av både membran lipidfølsomhet og nedstrøms lipidsignalering som svar på en hjerne fornærmelse eller stimuli over de funksjonelt distinkte hjerneregionene. Derfor krever lipidprotokoller nye utviklinger for å løse utfordringen med lave vevsmengder for høyere romlig oppløsningsdeteksjon og kvantifisering, og samtidig analyse av flere lipidkomponenter i cellemembraner og signalveier. Også bestemmelse av enzymer, lipidliginer og reseptorer involvert i regulering av deres nivåer og funksjon er avgjørende for å belyse signalveiene som påvirkes i en nevrologisk sykdom og veilede nye mekanistiske undersøkelser i en patofysiologisk kontekst.

I tillegg til den økte hjernens romlige oppløsning, er det to store vanskeligheter som utfordrer utviklingen av nye nevrolipidomiske tilnærminger. For det første er lipidsignalmolekylene vanligvis av svært lav overflod sammenlignet med membrankonstituerende lipider. For det andre viser lipidomet en høy strukturell heterogenitet, vanskelig å dissekere ved hjelp av en enkelt analytisk tilnærming. Derfor er ekstraksjons- og analysemetoder skreddersydd for ulike lipidkategorier og utføres vanligvis i distinkte vevsprøver2. Hagle lipidomiske metoder3 er gode verktøy for raskt å avdekke en bred profil av membranlipider, mens økt følsomhet og selektivitet gitt av målrettede oppdagelses- og kvantifiseringsmassespektrometriske metoder er kapitalisert for undersøkelse av lave rikelige signalleider, inkludert: i) inflammatoriske lipider og ii) lipider involvert i modulering av nevronal aktivitet, for eksempel endocannabinoider (eCBs), aminosyrekoblede lipider, etc.4,5. For å omfatte lipidforandringer både på cellemembranen og signalnivået som forekommer i hjerneregioner av nevrologiske sykdomsmodeller, utføres vanligvis lipidekstraksjonen og analysen i distinkte vevsprøver, hentet fra forskjellige dyrepartier eller fra forskjellige halvkule, eller ved å dissekere en større vevsregion i flere stykker. Når mRNA-nivåer av enzymreseptorer også er av interesse, krever deres undersøkelse vanligvis anskaffelse av en distinkt vevsprøve. For eksempel vil undersøkelsen av membranlipider, endogene cannabinoider og mRNA kreve tre forskjellige vevsprøver (f.eks. to prøver for de to lipidekstraksjonsmetodene-membranlipider og signalisering av lipider- og påfølgende to lipidanalysemetoder - og en prøve for mRNA-analyse). Undersøkelse av inflammatoriske lipider og endogene cannabinoider krever to distinkte vevsprøver, ekstraksjonsmetoder og analysemetoder. Et annet eksempel er undersøkelsen av mRNA og av enhver lipidkategori i en hjernestans eller lasermikrodesinfeksjonsprøve som følgelig krever to forskjellige dyr for å skaffe to prøver per hjerne (sub)region. I slike tilfeller oppstår det ofte en betydelig grad av variasjon og/eller dårlig reproduserbarhet av resultatene, som stammer fra biologisk variasjon og/eller vevs heterogenitet. Styrt av disse praktiske begrensningene i multimolekylær analyse, som forekommer spesielt ved høy romlig oppløsning i hjernen, ble en tremodulær nevrolipidomisk protokoll designet som omfatter: 1) samtidighet og samanalyse av LC / MRM av inflammatoriske lipider (f.eks. egenkosanoider (eCs)) og lipider involvert i modulering av nevronaktivitet, for eksempel eCBs2; 2) co-utvinning av fosfolipider (PLs) og eCB med påfølgende multiscan LC / MRM og forløper / nøytral tapsskanningsanalyse2; og 3) dobbel ekstraksjon av membran (fosfo)lipider og eCB samt mRNA, med påfølgende LC/MRM og qPCR- eller RNA-sekvenseringsanalyse6. Avhengig av det biologiske spørsmålet som skal tas opp i en nevrologisk sykdom og hjerneregionen av interesse, kan en kombinasjon av den første og den andre protokollen, eller den første og den tredje protokollen, brukes på samme vevsprøve for vev som veier rundt 4 mg. Den første og tredje protokollen kan brukes uavhengig for vev rundt 2 mg. Den andre protokollen kan brukes for vev som veier så lite som 0,5 mg. Uavhengig av den valgte nevrolipidomiske protokollmodulen, er vevsprøvetaking og preanalytisk behandling, hjerneisolasjon og region disseksjon, samt prosedyren for å ofre dyremodellen standardisert og identisk for alle tre modulene i protokollen. I vår undersøkelse av nevrologiske sykdommer samles og analyseres også perifere organer som er relevante for de patologiske konsekvensene av sykdommen ved hjelp av disse modulære protokollene. I tillegg blir blod regelmessig samplet for plasma lipidomikk for å tjene som et avlesningsverktøy for nevrologiske sykdommer med sikte på potensielle translasjonelle applikasjoner. Her presenteres modulær lipidomisk protokoll er svært allsidig: skalerbar til større vevsmengder og lett anvendelig for praktisk talt alle vevstyper og sykdommer. For bruk av modulprotokollen (Figur 1) i nevrologiske sykdommer, er enhver standardisert gnagermodell av utbrudd og progresjon av nevrologiske lidelser, som traumatisk hjerneskade, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller epilepsi mottagelig.

Disse protokollene har blitt grundig anvendt for å studere endringer i vev lipidomet og / eller transcriptome i den akutte fasen av epilepsi i kainsyre (KA) -indusert musemodell av epilepsi2,7, en modell som er mye brukt i prekliniske studier på grunn av likheten med human temporal lobe epilepsi (TLE) 8,9,10,11. Ved hjelp av disse protokollene ble det terapeutiske potensialet til legemidler som Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 vurdert i samme musemodell av epilepsi. Studien identifiserte lipid- og mRNA-endringer ved høy og lav romlig oppløsning i hjernen og periferien, på tidspunktet for maksimal akutt anfallsintensitet (ved 60 min postseizure induksjon), og ved subkronisk og akutt behandling med PEA ved fire forskjellige tidspunkter (20, 60, 120 og 180 min) etter KA-anfallsinduksjon, et tidsvindu som dekker den akutte fasen av epilepsi. Plasma-, hjerne- og perifere organer av ubehandlede KA-injiserte mus, akutte og subkronisk PEA-behandlede mus, samt kjøretøy- og PEA-kjøretøykontrollmus, ble samlet inn på hvert tidspunkt punkt12,13, og undersøkt med denne molekylære analysen. De molekylære dataene var korrelert med atferdsmessige fenotyper oppnådd ved anfallsscoring, samt med immunhiistokjemi-avledede data om nevrodegenerative prosesser, for å avdekke progresjonen av den akutte epilepsifasen og PEAs potensial til å lindre den.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet her er i samsvar med Det europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 22.

1. Dyremodell av akutt og profylaktisk behandlet KA-indusert epilepsi

  1. Utfør anfallsinduksjon, behandling og atferdsmessig skåring.
    1. Separate mus (minimum n = 6 mus per gruppe) i enkle bur.
    2. Klargjør anfallsinduksjonsløsning og tilsvarende kjøretøy (se tabell 1), samt behandlingsinjeksjonsløsning og tilsvarende kjøretøy (se tabell 2).
    3. Injiser mus intraperitonealt (dvs.) (10 ml/kg musekroppsmasse) uten anestesi i henhold til deres gruppeidentitet: sykdom, behandlet eller kjøretøybehandlet (dvs. KA, PEA-behandlet KA og de to kjøretøygruppene). Se figur 2, tabell 1 og tabell 2.
    4. Overvåk og skår atferden i henhold til følgende standardiserte anfallsintensitetsskala: 0 = ingen respons; 1 = immobilitet og stirring; 2 = forbens- og/eller haleforlengelse, stiv holdning; 3 = repeterende bevegelser, hodebobbing; 4 = oppdrett og fall; 5 = kontinuerlig oppdrett og fall; 6 = alvorlige klonisk-toniske anfall; 7 = død14,15 (figur 3).
  2. Utfør ofre prosedyre for lipidomisk og transkripsjonsanalyse.
    1. På fire tidspunkter (dvs. henholdsvis 20, 60, 120 og 180 min post KA- eller kjøretøyinjeksjon), ofre seks mus fra hver av følgende grupper: PEA-behandlet, PEA-ubehandlet epileptisk kjøretøy 1 og kjøretøy 2, etter IACUC-godkjente protokoller.
    2. Ti sekunder etter at hvert tidspunkt er nådd, bedøv musene ved hjelp av et isofluran-gjennomvåt vev i et glasskammer. Bekreft anestesi ved tap av høyre refleks, indikert av manglende evne til å bevege seg mens du sakte velter glasskammeret. Halshugge mus ved hjelp av kirurgisk saks og samle plasma-, hjerne- og perifere organer (se trinn 2.2.2−2.2.4).
      FORSIKTIG: Etiske regler for ofre varierer mellom lokale dyrekomiteer. Sørg for å sjekke og følge regelverket utstedt av den lokale dyreutvalget.
  3. Følg ofreprosedyren for immunhiistokjemianalyse.
    1. For immunhiistokjemisk farging13, skårer atferdsmessig tre mus fra hver av følgende grupper: PEA behandlet, PEA-ubehandlet epilepsi og kjøretøygrupper, over hele tidsforløpet (180 min).
    2. Offer og parfyme mus 5 dager senere. Dyp bedøvelse av mus (se trinn 1.3.1 for musegruppene) ved injeksjon av pentobarbital (100 mg/kg) og buprenorfin (0,1 mg/kg) som narkotiske legemidler. Bekreft dypbedøvelse ved tap av refleks mellom tåene.
    3. Fest musen på en polystyrenplate og åpne thoraxen umiddelbart ved hjelp av fin saks og standard tang. Sett sommerfuglen i venstre hjerte ventrikel og kutt høyre atrium ved hjelp av fin saks.
    4. Juster pumpens hastighet og trykk til en konstant peristaltisk strømning med en hastighet på 2-3 ml/min. Perfuse med iskald fosfatbufret saltvann (PBS) i ca. 5 min. Bytt om nødvendig sommerfuglen.
      MERK: Med riktig perfusjon begynner de indre organene (unntatt milten) å bleke ut innen 1-2 min.
    5. Bytt perfusjon til iskald 4% paraformaldehyd (PFA) løsning i ~ 5 min. Isoler hele hjerner som beskrevet i trinn 2.2.2 og fest i 24 timer i 4% PFA-oppløsning ved 4 °C.
    6. Inkuber hjernen i 30% sukroseoppløsning i 48 timer ved 4 °C. Fjern rester av sukrose med et tørt vevspapir og frys hjernen på en metallplate (-80 °C). Oppbevar hjernen ved -80 °C for fargingsprosedyrene13.

2. Prøvetakingsprosedyrer for lipidomisk/transkripsjonsanalyse

  1. Forbered prøvetaking.
    1. Prekol EDTA-rør for plasmaprøvetaking til 4 °C. Forkjøl sentrifuge- og virvelapparatet til 4 °C. Forkjøl metallplaten dekket med aluminiumsfolie (for å knipse frossen hjerne og/eller annet vev av interesse) på tørris (-80 °C). Forkjøl de merkede 2 ml og 5 ml rørene på tørris (-80 °C) for henholdsvis plasma aliquots, frossent vev og hjerneoppsamling. Bruk gule rør for å beskytte lysfølsomme molekyler, for eksempel eic.
    2. Rengjør vevsprøvetakings- og isolasjonsutstyret (kirurgisk saks, rett skarp fin saks, rette glatte standard tang, fine tang med speilfinish, buede tang og spatel, polystyrenskumplate og nåler for fiksering) med et desinfeksjonsmiddel (f.eks. 70% etanol).
  2. Utvalgsprotokoller
    1. Bestem rekkefølgen på prøvetakingen.
      1. Samle blod umiddelbart etter halshugging i forhåndskjølte 1 ml EDTA-rør (se trinn 2.2.3).
      2. Fjern hele hjernen og klikk fryse umiddelbart etter fjerning. Dette trinnet tar 1−2 min. Oppbevar frosne hjerner ved -80 °C for videre behandling (se trinn 2.2.2).
      3. Fjern perifere organer av interesse (f.eks. lunge, hjerte, lever), innen 5 min etter hjernefjerning, og trykk på frys og oppbevar ved -80 °C for videre behandling (se trinn 2.2.4).
    2. Fjern hjernen for disseksjons- eller stanseprosedyrer. Denne prosedyren tar 1-2 min/hjerne.
      1. Etter halshugging (se trinn 1.2), begynn å lage et midtlinje snitt i huden ved hjelp av fin saks. Frigjør skallen ved å vende huden over øynene. Nå til toppen av skallen og gjør et lite kaudal snitt som starter på nivået av det intraparietale beinet. Unngå å skjære gjennom hjernen.
      2. Skjær fast gjennom den mest fremre delen av skallen mellom øynene for å lette hjernefjerningen. Vipp den ene siden av parietalbenet ved hjelp av buede smale mønster tang og bryte av. Gjenta det siste trinnet for den andre siden.
      3. Fjern hjernens meninger. Skyv en slikkepott under den fremre delen av hjernen (dvs. den olfaktoriske pæren) og vipp hjernen forsiktig oppover. Skyv spatelen lenger ned for å bryte optikken og andre kranialnervene.
      4. Løft hjernen ut av skallen og trykk på hele hjernen umiddelbart på en ferdigkjølt (-80 °C) metallplate med ventralsiden vendt mot metallplaten (dorsal opp).
      5. La hjernen fryse helt og overføre til forhåndskjølte 5 ml rør og lagre ved -80 °C til disseksjonen av hjerneregionene eller stanseprosedyren (se trinn 3.1. og 3.2).
    3. Utfør plasmaprøvetaking.
      1. Spike precooled EDTA-rør med 10 μL nytilberedt indomethacin-fortynning til en målkonsentrasjon på 10 μM.
      2. Samle bagasjerommet blod umiddelbart etter halshugging ved mild klemming av kroppen i precooled EDTA rør til et maksimalt blodvolum på 1 ml.
        MERK: Ved riktig blodtrykk er det ikke nødvendig å klemme. Hvis blodvolumet er mindre enn 1 ml, reduser isofluraninkubasjonstiden for å muliggjøre riktig blodstrøm.
      3. Sentrifuger umiddelbart blodrør ved 2000 x g i 10 min ved 4 °C.
      4. Fjern den resulterende øvre plasmafasen og med det formål å multilipidanalyse aliquot definert plasmavolumer i forhåndskjølte 2 ml rør som følger: 50 μL for eCB / eiCs analyse, 30 μL for PLs analyse, og gjenværende plasmavolum som sikkerhetskopiprøve eller for andre typer analyser.
      5. Oppbevar plasmaprøvene ved -80 °C for ytterligere ekstraksjon (se trinn 4.1.2 og 4.1.4).
    4. Utfør prøvetaking av perifert organ.
      MERK: Bruk museanatomireferanser16 og dokumentasjon som er gitt for de obligatoriske kursene (FELASA) som dyreetterforskere deltar på for å identifisere de enkelte organene, bindevevet og/eller blodårene.
      1. Immobilisere musen torso for å lette organ fjerning ved hjelp av nåler. Lag et ventralt midtlinjesnitt ved hjelp av en rett skarp saks på pubisens høyde. Bruk stumpe standard tang for å fikse bukveggen mens du kutter for å åpne bukhulen.
      2. Immobiliser huden for å tillate fjerning av mageorganer ved hjelp av stumpe tang. For hjerte- eller lungefjerning, fortsett medial kutt i retning av brysthulen. Fjern lungen og/eller hjertet med fine tang.
      3. Åpne brysthulen forsiktig for å unngå blødning. Klipp bindevevet og blodkarene som forankrer det respektive organet uten å skjære gjennom orgelet.
      4. Overfør vevsstykker umiddelbart på ferdigkjølte metallplater (-80 °C) og la det fryse helt. Overfør vevsstykker til forhåndskjølte rør og oppbevar ved -80 °C for videre behandling (se trinn 4.1).

3. Behandling av biologisk materiale

MERK: For co-ekstraksjon av eCB/eiCs, bruk 2 ml gule rør som ekstraksjonsrør og tilsett i hvert rør syv ferdigkjølte stålkuler. For co-ekstraksjon av PLs/eCB og for dobbel lipid og RNA co-ekstraksjon, bruk 2 ml RNAse-frie ekstraksjonsrør pigget med keramiske perler (Materialbord).

  1. Utfør hjerne disseksjon og perifer organbehandling.
    MERK: Bruk forstørrelseslamper for å øke synligheten til hjernen for disseksjon.
    1. Rengjør de kirurgiske verktøyene, inkludert tang med super fine tips, 2x med 70% etanol.
    2. Overfør de frosne hjernene fra -80 °C til en Petri-tallerken som inneholder ferdigkjølt fysiologisk buffer (pH 5,5) Kontroller at Petri-retten er ved 4 °C. La hjernen helt frigi for å tillate disseksjon. Test forsiktig ved hjelp av tang.
      FORSIKTIG: Ikke hold hjernen ved 4 °C lenger enn det som er nødvendig for opptining.
    3. Forkjøl en metallplate på is (4 °C) og dekk den med vått vev gjennomvåt i iskald fysiologisk buffer (pH 5,5) og overfør hjernen med ventral side opp forsiktig til en ferdigkjølt (4 °C) metallplate på is. Dekk det med vått vev gjennomvåt i iskald fysiologisk buffer (pH 5,5).
    4. Disseker hjerneregioner innen maksimalt 5 minutter ved hjelp av super fine tip tang. Start med hypothalamus (HYP) og vri dorsalsiden opp for å fortsette med høyre side. Isoler hippocampus (HCr), prefrontal cortex (PFCr), striatum (STRr) og hjernebark (cCTXr). Deretter dissekerer du venstre side. Isoler hippocampus (HCl), prefrontal cortex (PFCl), striatum (STRl) og cerebral cortex (cCTXl). Disseker cerebellum og thalamic regionen. Bruk publiserte anatomiske referanser16,17 for identifikasjon av hjerneregionen.
    5. Overfør hvert dissekerte stykke direkte på en aluminiumsfoliedekket, ferdigkjølt metallplate (-80 °C). Tillat frysing og overføring av de isolerte hjerneområdene i de merkede forhåndskjølte 2 ml-rørene.
    6. Pulveriser vevsstykkene ved hjelp av en vevs pulverisator (ved -80 °C), og unngå opptining av vevet. I det kalde rommet, aliquot vev pulver i merket, precooled ekstraksjon rør som inneholder keramiske perler eller stål baller. For den doble lipidomiske/transkripsjonsanalysen, vei vevpulveret aliquots i kjølerommet. For lipidomisk analyse, velg mellom normalisering til vevsvekt eller proteininnhold. For sistnevnte, fortsett videre uten vevsveiing.
    7. Klipp det perifere organvevet i stykker med en maksimal vekt på 20 mg. Fortsett med vevs pulverisering som i trinn 3.1.6.
    8. Fortsett med utvinning av vevsprøver (se trinn 4.1.1, 4.1.3 eller 4.1.5) eller lagre rør ved -80 °C for senere ekstraksjon.
      MERK: Hjernematrisen kan også brukes hvis studiedesignet tillater det. Metoden er imidlertid mer egnet for et diskret og begrenset antall hjerneregioner, og det er ikke praktisk å dissekere og isolere alle de ovennevnte hjerneregionene innenfor den angitte tidsrammen.
  2. Utfør hjernestansing.
    1. Monter hele, frosne hjerner på monteringssystemet (Materialbord) i kryostaten. Sett tykkelsen til 50 μm og skjær i trimmodus nær interesseområdet.
    2. Flekkhjerneskive (18-20 μm) ved hjelp av toluidinblå (0,1%−1%) som referanse til lokalisering av underregionen av interesse. Inspiser de fargede skivene ved hjelp av et mikroskop for å identifisere områdene av interesse som skal stanses. Bruk et museatlas som referanse for å finne de riktige hjerneanatomiske områdene16. Ta slag med en diameter på 0,8-1,0 mm ved hjelp av prøvekorer i forhåndskjølte rør.
    3. Vei frosne slag i kjølerommet i merkede, forhåndskjølte 2 ml ekstraksjonsrør som inneholder keramiske perler eller stålkuler. Bruk gule rør for eCB og eiCs co-extraction.
    4. Start ekstraksjonen (se trinn 4.1.1, 4.1.3 eller 4.1.5) eller lagre rør ved -80 °C for ytterligere ekstraksjon.
  3. Utfør plasmabehandling.
    1. Plasser de frosne plasmaprøvene på is (4 °C) og la dem tine (~20 min).
    2. Forsikre deg om at plasmaet er helt ikke frosset før du starter utvinning.
    3. Fortsett med plasmautvinningsprosedyren (se trinn 4.1.2 eller 4.1.4).
      MERK: Plasmaprøver bør forbli ved -80 °C til ekstraksjon. Unngå sykluser med opptining og nyfrysing.

4. Ekstraksjonsprosedyrer

  1. Utfør LLE-lipidprotokoller (Liquid-Liquid).
    1. Utfør co-ekstraksjon av eCB-er og eIc-er fra hjernestykker, slag eller vevspulverprøver.
      MERK: Nøyaktig pipettering er nødvendig gjennom hele prosedyren.
      1. Plasser ekstraksjonsrørene som inneholder vevsprøvene og syv stålkuler på is (4 °C). Tilsett 600 μL iskald MTBE og 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) som inneholder de interne standardene. Målkonsentrasjonen av de interne standardene i det endelige volumet for analyse (50 μL) er som følger: 1 ng/ml AEA-d4, 125 ng/ml 2-AG-d5, 3000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/ml 1-AG-d5, 2,5 ng/ml PGF2α-d4 og 5 ng/ml for PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; henholdsvis 20-HETE-d6 og TXB2-d4.
      2. Tilsett 400 μL 0,1 M maursyre og homogeniser med en vevs lyser (30 s-1 min). Sentrifuger homogenatet i 15 min ved 5000 x g ved 4 °C. La frysing av den vandige nedre fasen i 10 min ved -80 °C for å lette overføringen av den øvre organiske fasen.
      3. Overfør den organiske fasen i nye rør. Fordamp under en skånsom strøm av N2 ved 37 °C og rekonstituer i 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) for videre analyse.
      4. Oppbevar den vandige fasen ved -20 °C eller -80 °C for videre proteininnholdsanalyse.
    2. Utfør co-utvinning av eCB-er og eC-er fra plasmaprøver.
      1. Tine plasma aliquots ved 4 °C. Tilsett 800 μL MTBE og 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) som inneholder de interne standardene (analogt med de som brukes til vevsanalyse, se trinn 5.1.1). Optimaliser den interne standardkonsentrasjonen for spiking ved hjelp av referanseplasmaprøver.
      2. Tilsett 600 μL 0,1 M maursyre- og virvelprøver ved 4 °C i 2 minutter. Sentrifugeprøver ved 4000 x g i 15 min ved 4 °C.
      3. Overfør den organiske fasen til nye rør, fordamp under en skånsom strøm av N2 ved 37 °C, og rekonstituer i 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) for LC/MRM-analyse.
        MERK: Unngå om mulig lagring av tørkede ekstrakter av eic-er og fortsett umiddelbart til LC/MRM-analyse. Hvis lagring ikke kan unngås, kan du ty til korttidslagring i bare 2-3 dager ved 4 ° C med prøver i LC injeksjonsløsningsmiddel.
    3. Utfør co-ekstraksjon av PLs og eCB fra hjerneregioner, slag eller andre vevspulverprøver.
      1. Plasser ekstraksjonsrørene som inneholder vevsprøvene og keramiske perler på is (4 °C). Tilsett 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) og 10 μL MeOH som inneholder de interne standardene. Målkonsentrasjonen av de interne standardene i det endelige volumet for analyse (100 μL) er som følger: 150 ng/ml for PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/ml PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/ml AEA-d4, 60 ng/ml 2-AG-d5, 4000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d2 og 3 ng/ml PEA-d4.
      2. Tilsett 200 μL 0,1% maursyre som inneholder 25 μM tetrahydrolipstatin/URB597 og 50 μg/ml BHT. Homogeniser med vevshomogenisatoren (materialtabellen) og sentrifugen ved 5000 x g og 4 °C i 15 minutter.
      3. Gjenopprett den øvre organiske fasen i nye rør og fordampe under en mild strøm av N2 ved 37 °C. Rekonstituer i 90 μL MeOH og enten lagre ved -20 °C eller -80 °C, eller fortsett med neste trinn.
      4. Tilsett 10 % H2O i et alikvart lipidekstrakt (4.1.3.3) og injiser 10 μL i LC/MS for PLs-analyse. For videre eCB-analyse fortsett med trinn 4.3.5.
      5. Ta en aliquot av ekstraktet (4.1.3.3), fordampe til tørrhet og rekonstituere i ACN / H2O (1:1; v / v). Bruk 20 μL til LC/MS-injeksjon for eCB-analyse.
    4. Utfør co-ekstraksjon av PLer og eCBer fra plasmaprøver.
      1. Tine plasma aliquots ved 4 °C, tilsett 1000 μL MTBE/metanol (10:3; v/v) og 10 μL MeOH som inneholder interne standarder (analogt med trinn 4.1.3) og virvel ved 4 °C i 1 min.
      2. Tilsett 250 μL H2O og virvel i 45 min ved 4 °C. Sentrifugeprøver i 15 min ved 5000 x g og 4 °C. Gjenopprett den øvre organiske fasen, fordampe under en skånsom strøm av N2 ved 37 °C, og rekonstituer i 90 μL metanol for videre LC/MS-analyse. Oppbevars ved -20 °C eller -80 °C, eller gå videre til neste trinn.
      3. For PLs-analyse, tilsett 10% vann til en aliquot lipidekstrakt (4,1,2,2).
      4. For eCB-analyse, tilsett 10% vann til en aliquot av lipidekstraktet (se 4.1.4.3), fordampe til tørrhet og rekonstituere i 50% ACN / H2O (1:1; v / v).
    5. Utfør dobbel ekstraksjon av RNA og lipider (co-ekstraksjon av PLer og eCB) fra vevsprøver.
      FORSIKTIG: Sørg for å arbeide under RNA-frie forhold for å unngå RNA-nedbrytning.
      1. Tine vevspulver aliquots eller hjernebunter (ved 4 °C) og tilsett 600 μL RLT-buffer som inneholder 5 μM THL/URB597, 10 μg/ml BHT, og 1% β-mercaptoetanol (for prosentandeler av det endelige volumet av homogeniseringsbuffer, se trinn 4.1) sammen med 200 μL kloroform til ekstraksjonsrør som inneholder frosne hjerneslag og keramiske perler.
      2. Spike prøver med 10 μL intern standard blanding for PLs og eCB co-ekstraksjon (se trinn 4.1.3) og homogenisere via vev homogenisator (høy hastighet, 20 s).
      3. Overfør lysater til nye sentrifugerør og sentrifuger i 5 minutter ved full hastighet og 4 °C for å muliggjøre faseseparasjon.
      4. Gjenopprett og bruk den øvre fasen for RNA-ekstraksjon ved hjelp av standard RNA-ekstraksjonsprosedyresett (Materialliste). Elute RNA i et totalt volum på 50 μL RNase-fritt vann og oppbevares ved -80 °C.
        MERK: Prøven i trinn 4.1.5.4 er egnet for både RNA-sekvensering og qPCR ved hjelp av de riktige metodene og instrumentering.
      5. Bruk den nedre kloroformholdige fasen for lipidavsug. Tilsett 800 μL MTBE/metanol (10:3; v/v) og 200 μL 0,1 % maursyre og virvel i 45 minutter ved 4 °C. Gjenopprett den øvre organiske fasen og fordampe under en mild strøm av N2 ved 37 °C.
      6. Rekonstituer i 90 μL metanol for videre LC/MS-analyse. Oppbevars ved -20 °C eller -80 °C, eller fortsett til trinn 5.
      7. Tilsett 10 % H2O i et alikvart lipidekstrakt (se trinn 4.1.5.6 ovenfor) og injiser 10 μL i LC/MS for PLs-analyse. For videre eCB-analyse fortsett med trinn 5.7.
      8. Ta en aliquot av ekstraktet (se ovenfor trinn 4.1.5.6) fordampe til tørrhet og rekonstituere i ACN / H2O (1:1; v / v). Bruk 20 μL for LC/MS-injeksjon for eCB-analyse (analogt til trinn 4.3.5).

5. Kvalitativ og kvantitativ profilering av LC/MRM

  1. Klargjør LC-løsningsmiddelsystemer, kalibreringsløsninger og kvalitetskontrollprøver.
    1. For PLs, forberede mobil fase A: metanol / vann (1:1; v / v) som inneholder 7,5 mM ammoniumformat og 0,1% TEA. Forbered mobil fase B: metanol/isopropanol (2:8; v/v) som inneholder 7,5 mM ammoniumformat og 0,1 % TE. Oppbevar løsemidler i LC-flasker.
    2. For eCB- og eiC-separasjon, klargjør du følgende LC-løsningsmidler: 0,1 % maursyre som mobil fase A, og 100 % ACN som inneholder 0,1 % maursyre som mobilfase B. Oppbevar løsemidler i LC-flasker.
    3. Klargjør kvalitetskontroller ved hjelp av kalibreringsstandarder og interne standarder (tabell 3) i en equimolar eller brukerdefinert konsentrasjon.
    4. Forbered kalibreringskurver med syv konsentrasjonspunkter. Bruk den samme interne standardbunken til å øke i kalibreringskurveløsningen og i prøver som skal analyseres.
  2. Bruk LC-MRM-metoden for kvalitativ og kvantitativ lipidprofilering.
    1. Åpne fanen Build Acquisition Method i den kommersielle programvaren (f.eks. analytiker) og velg LC/MRM-modus med polaritetsveksling. Angi i metoden ionovergangene (som angitt i tabell 3) for kvantitativ profilering. Sett avregningstiden til 50 ms.
    2. For PLs-profilering angir du følgende ionkildeparametere: gardingass = 40 psi; kildevarmer temperatur = 550 °C; ionsprayspenning = -4500 V i negativ ionmodus og = +5200 V i positiv ionmodus.
    3. For samanalyse av eCB og eiCs, sett følgende parametere: gardingass = 40 psi; kildevarmer temperatur = 550 °C; ionsprayspenning = -4500 V i negativ ionmodus og = +4500 V i positiv ionmodus.
    4. For PL-analyse setter du kolonnevarmen til 45 °C og strømningshastigheten til 200 μL/min og stiller inn følgende gradering: min 0 = 40 % B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99 % B, og min 52 = 40 % B. Sett injeksjonsvolumet til 10 μL.
    5. For eCB- og EICs-analyse angir du kolonnetemperaturen ved romtemperatur og stiller inn følgende gradient: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20 % B; min 20 = 20 % B. Sett injeksjonsvolumet til 20 μL.
      MERK: MRM-forholdene kan variere mellom instrumentelle plattformer, derfor må fragmenterings- og MRM-forhold utledes eksperimentelt, og iioniseringsparametere bør testes og justeres om nødvendig for å få maksimal følsomhet og selektivitet.
  3. Utføre satsvis analyse.
    1. Åpne Bygg anskaffelse-bunken , og fyll ut de nødvendige parameterne for eksempelbeskrivelse, plassering i autosamplerens prøvestativ og anskaffelsesmetode (angitt som trinn 5.2).
    2. Inkluder alltid kvalitetskontroller på begynnelsen og slutten av analysen og i bunken. Etter hver 25-30 prøve inkluderer du minst tre kalibreringskurver i batchen og inkluderer et vasketrinn med et løsningsmiddel etter hver kvalitetskontrollprøve, kalibreringskurve og på slutten av prøvebunken.
    3. Overføringsprøver oppnådd i trinn 4 i LC/MS-hetteglass. Plasser prøvene i lastestativene til LC-autosampleren i henhold til posisjonen som er definert i batchen, og last inn prøvestativet i LC-autosampleren.
    4. Send inn satsvis analyse og start køanalyse.
  4. Lipid kvantifisering
    1. Bruk den kommersielle programvaren (f.eks. analytiker) og den innebygde kvantifiseringsmodulen for eCB-er og eiCs kvantifisering og kommersiell programvare (f.eks. multikant) for PLs kvantifisering.
      MERK: Den andre programvaren kan også brukes til eCB og eiCs, spesielt når en intern standard brukes til kvantifisering av flere analytter.
    2. Åpne Bygge kvantifiseringsmetode og fyll ut parametrene for analytter, interne standarder, MRM-overganger, og tilskriv de interne standardene til analyttene som skal kvantifiseres (tabell 3). Sett minimumshøyden til 500 cps.
    3. Bruk følgende kriterier eller kombinasjon av disse for lipididentitetstilordning og påfølgende kvantifisering6: oppbevaringstidsmatching av lipid endogene analytter med kalibreringsstandarder og/eller deutererte interne standarder, der det er tilgjengelig; fragment ion matchende ved positiv og negativ ion modus fragmentering for en gitt m / z av lipid analytter som ingen standarder er gitt for; litteraturinferrert elution oppførsel av lipider under tilsvarende anvendte LC-forhold for å dissekere isomeriske og / eller isobariske strukturer; og, der det er tilgjengelig, LC/MS- og MS/MS-analyse med høyoppløselig massespektrometri, ved hjelp av lignende LC-betingelser som for målrettet analyse (ved hjelp av LC/MRM), for å nøyaktig identifisere identiteten og elution-oppførselen til endogene lipider av interesse18,19.
    4. For validering av satsvis analyse, bruk følgende kriterier: nøyaktighet av kvantifisering ≤ ±20%; regresjonskoeffisient ≥0,97 (ideelt sett ≥0,99).
      MERK: Følg retningslinjene for utvikling og validering av bioanalytiske metoder for å sikre en pålitelig, reproduserbar analyse av målmolekylene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Settet med beskrevne protokoller kan kombineres på ulike nivåer på en målspesifikk måte, for eksempel valg av dyremodell, prøvetakingsvei, utvinningsmetode og profilering (figur 1).

For å bestemme lipidnivåendringer i hjernen og periferien over et tidsforløp av en akutt epileptisk anfallstilstand og for å avdekke den potensielle antiepileptiske effekten13 av PEA og dens innvirkning på lipidomeendringer i hjernen og periferien, ble tre eksperimentelle dyregrupper behandlet med kjøretøy, KA for å indusere akutt epilepsi og PEA som en antiepileptisk legemiddelkandidat. PEA ble administrert via i.p. før KA-injeksjonen (f.eks. med en enkelt PEA-injeksjon for akutt behandling og to PEA-injeksjoner for subkron behandling). I forbindelse med multippel molekylær analyse og/eller immunhiistokjemifarging etter 5 dager etter behandling ble dyreforsøkene gjentatt etter behov (figur 2).

KA-induksjon av akutte epileptiske anfall fører til maksimal anfallsintensitet 1 t etter injeksjon15 (figur 3). For å avdekke endringer i hjerne- og perifer lipidnivå ved maksimal anfallsintensitet ble mus ofret ved 1 t etter KA-injeksjon, etterfulgt av plasma-, hjerne- og perifer organprøvetaking. Frosne hjerner ble dissekert i seks hjerneregioner (se trinn 3.1). Hjerneregioner og perifert organ (hjerte og lunge) vev ble pulverisert for å oppnå homogene vevsprøver og deretter aliquoted for de to lipidomiske profilering av eCB og eCs (figur 4A og trinn 4.1.1) og PLs og eCB (figur 4B og trinn 4.1.3).

Den doble ekstraksjonsprotokollen (se trinn 4.1.5) ble brukt til å utføre PLs/eCBer og RNA med høyere romlig oppløsning via profilering fra hjerneslag i forskjellige regioner: hypothalamus (HYP), basolateral amygdala (BLA) og ventral (vHC) og dorsal (dHC) hippocampus (figur 5). Slag ble samplet (se trinn 3.2) fra KA-induserte epileptiske mus og kontrollmus ved maksimal anfallstilstand ved 1 t post-KA-injeksjon (figur 2).

For å vurdere nevrodegenerasjonsutbredelsen og tilskrive lipidforandringer i nevrodegenerasjonsutbredelse med epilepsi og ved ny epilepsibehandling med PEA, immunhiistokjemisk dobbeltfarging ble utført på hjerneseksjoner (se trinn 1.3) samplet 5 dager etter KA-induserte epileptiske anfall (figur 2) hos mus uten subkronISK ERA-behandling (midten), med subkronISK PEA-behandling (høyre) og i saltvannsinjiserte mus (venstre) (figur 6) (figur 6) ). KA-indusert status epilepticus (SE) forårsaket massivt tap av NeuN-signal, hovedsakelig i CA1, CA3 og hilus-regionen i hippocampus, ledsaget av apoptotiske hendelser indikert av caspase-3 (CASP3) signal (figur 6, mellombilde) sammenlignet med kontrollen (figur 6, venstre bilde). Subkronisk PEA-behandling (høyre bilde) bemerkelsesverdig bevart nevronalt nukleiprotein (NeuN) signal, mens (CASP3) signal knapt kan påvises.

KA- og SAL injeksjonsvæske, oppløsning.
KA injeksjonsvæske, oppløsning (8 ml sluttvolum):
1. Vei ut 24 mg KA i 15 ml rør (forsiktig: bruk glothes og maske)
2. Tilsett 8 ml saltvann og virvel i 10 min
3. Oppbevares ved 4 °C for oppbevaring av intermdediate
4. Rekondisjonering til romtemperatur og virvel før injeksjon
Kjøretøy 1 injeksjonsløsning (8 ml sluttvolum):
Hopp over trinn 1 og fortsett med trinn 2-4

Tabell 1: Fremstilling av anfallsinduserende legemiddel- og kjøretøy 1-applikasjon. Fremgangsmåte for å forberede Kainic acid (KA) injeksjonsoppløsning for 24 intraperitoneale injeksjoner (10 ml/kg) i en endelig konsentrasjon på 30 mg/kg og den tilsvarende injeksjonsløsningen for kjøretøy (kjøretøy 1)1.

PEA- og SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)) injeksjonsvæske, oppløsning.
PEA injeksjonsvæske, oppløsning (8 ml sluttvolum):
1. Vei ut 32 mg PEA i 15 ml rør
2. Tilsett 0,4 ml DMSO og virvel i 10 min
3. Tilsett 3,4 ml SAL og virvel i 5 min
4. Soniker blanding i 5 min ved 36°C
5. Tilsett 0,4 ml cremofor og virvel i 5 min
6. Soniker i 1 min ved 36 °C og tilsett 3,4 ml SAL
7. Virvel i 30 sek og soniker i 3 min ved 36 °C
8. Hold oppløsningen ved 36 °C ved lav hastighet i shaker og virvel før injeksjon
Kjøretøy 2 injeksjonsløsning (8 ml sluttvolum):
Hopp over trinn 1 og fortsett med trinn 2-8

Tabell 2: Fremstilling av antiepileptisk legemiddel og kjøretøy 2 applikasjon. Eksemplifiserte trinn for å forberede Palmitoylethanolamide (PEA) injeksjonsvæske, oppløsning til 24 intraperitoneale injeksjoner (10 ml/kg) i en endelig konsentrasjon på 40 mg/kg og den tilsvarende injeksjonsløsningen for kjøretøy (kjøretøy 2)1.

Positiv ion-modus
Utvalgte kalibreringsstandarder PLer Tilsvarende interne standarder
Analytt Forløper ion Produkt ion m/z Analytt Forløper ion Produkt ion m/z
navn m/z navn m/z
AEA 348.3 62.1 AEA-d4 352.3 66.1
2-AG 379.1 287.2 2-AG-d5 384.2 287.2
OEA 326.2 62.1 OEA-d2 328.2 62.1
ERT 300.2 62.1 ERA-d4 304.2 62.1
PC 16:0/18:1 760.59 184.07 PC 17:0/14:1 718.54 184.07
PC 18:2_20:4 806.57 184.07
PC 18:0_20:4 810.6 184.07
LPC 18:0 524.37 184.07 LPC 17:0 510.36 184.07
LPC 20:4 544.34 184.07
SM d18:1/18:0 731.61 184.07 SM d18:1/12:0 647.51 184.07
Negativ ion-modus
Utvalgte kalibreringsstandarder PLer Tilsvarende interne standarder
Analytt Forløper ion m/z Produkt ion m/z Analytt Forløper ion Produkt ion m/z
navn navn m/z
AA 303.05 259.1 AA-d8 311.04 267
5(ER)-HETE 319.48 115 5(S)-HETE-d8 327.48 116
8(S)-HETE 319.48 155 12(S)-HETE-d8 327.48 184
12(S)-HETE 319.48 179
15(S)-HETE 319.48 219
19(S)-HETE 319.48 231
20-HETE 319.48 289 20-HETE-d6 325.48 295
LxA4 351.5 115.2 LxA4-d5 356.5 115
PGF2 α 353.48 309.2 PGF2 α-d4 357.5 313.3
TxB2 369 169 TxB2-d4 373 173
PGE2 351.47 315.3 PGE2-d9 360.25 324.3
PGD2 351.47 315.3 PGD2-d4 355.25 319.3
11β-PGF2 α 353.24 193
RvD1 375.22 215.1 RvD1-d5 380.22 180.2
PE 16:0/18:1 716.52 281.25 PE 17:0/14:1 674.48 225.19
PE 38:4 766.54 303.23
PE 40:6 790.54 303.23
PE 40:4 794.57 303.23
PA 16:0/18:1 673.48 255.23 PA 17:0/14:1 631.43 269.25
LPA 16:0 409.24 153 LPA 17:0 423.25 153
LPA 20:4 457.24 153
LPI 20:4 619.29 303.23
PG 16:0/18:1 747.52 281.25 PG 17:0/14:1 705.47 225.19
PG 16:1_20:4 767.49 303.23
PG 18:1_20:4 795.52 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PS 16:0/18:1 760.51 255.23 PS 17:0/14:1 718.47 269.25
PS 36:4 782.49 303.23
PS 38:4 810.53 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PI 36:4 857.52 303.23
PI 38:4 885.55 303.23
C1P d18:1/16:0 616.47 78.9 C1P d18:1/12:0 560.41 78.9
S1P d18:1 378.24 78.9 S1P d17:1 364.23 78.9

Tabell 3: Lipidstandarder og MRM-overganger for målrettet lipidomisk analyse. Tabellinnhold ble opprinnelig publisert i Lerner et al.2

Figure 1
Figur 1: Oversikt over arbeidsflytmodulene. Avhengig av studiemålet og ulike ruter for prøvetaking, kan utvinning og profilering kombineres for å muliggjøre et betydelig utfall for studien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentell design av akutt kainsyre (KA)-indusert epileptisk anfallsmodell hos mus. Mus behandles enten med 1) Saltvann (10 ml/kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); og/eller 3) (sub) kronisk forbehandlet (1−2x 40 mg/kg i.p.) med den potensielle antiepileptiske forbindelsen Palmitoylethanolamid (PEA). Tjuefire mus per gruppe ble behandlet som ovenfor og atferd ble scoret for å evaluere anfallsintensiteter. Seks mus per gruppe ble ofret ved hvert av de fire forskjellige tidspunktene (T1-T4) for å bestemme lipidnivåendringer over en tid med akutt epileptisk anfallstilstand i hjernen, perifere organer og plasma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Atferdsmessig skåring over en tid med akutt kainsyre (KA)-indusert epilepsi vs. kontroller. Vurdering av anfallsintensiteter over et tidsforløp på 180 min etter KA-anfallsinduksjon (n = 24) eller saltvannsinjeksjon (n = 24) gitt som gjennomsnittlige atferdspoeng. Det ble ikke funnet forskjeller mellom kjøretøy 1 og kjøretøy 2 injiserte grupper. Feilfelt = SEM. ANOVA gjentatt måling ga signifikante interaksjoner mellom tidspunktene til målingene og testgruppene, noe som indikerer signifikante effekter av KA-behandling på atferdspoeng. Anfallsintensiteter av KA-behandlede mus ble opprinnelig publisert i Post et al.13Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Hjerne- og perifert vev lipidnivåer ved akutt epileptisk anfallstilstand. Endringer i Lipidnivå presentert som gjennomsnittsverdi ± SEM ved maksimal anfallsintensitet (f.eks. 1 h post-KA injeksjon) over seks hjerneregioner (n = 9): hjernebark (cCTX), striatum (STR), thalamic region (THL), hippocampus (HC), hypothalamus (HYP), cerebellum (CER), samt hjerte- og lungevev i KA-induserte epileptiske mus (øvre verdi) og kontroller (lavere verdi). Basale lipidnivåer i vev er avbildet i grått. Verdiene for PLer, 2-AG og AA er angitt i henholdsvis nmol/g. og verdiene for NAEer, EIC og AEA i pmol/g. Alle lipidnivåer normaliseres til vevsvekten. For å markere de spesifikke molekylære endringene, er lipidnivåene til de KA-behandlede musene representert som prosentandelen av saltvannsinjisert (KA / sal) i et varmekart som viser reduserte verdier ved akutt anfallsintensitet sammenlignet med kontrollen er avbildet i lyseblått og de økte nivåene sammenlignet med kontroll i rødt, henholdsvis. De regnes som signifikante til en p-verdi <0,05. Disse dataene ble opprinnelig publisert i Lerner et al.2Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Dobbel ekstraksjon av eCB/PLer og RNA for kvantitativ profilering fra musehjerneslag. (A) Kvantitativ fordeling av utvalgte PLer og eCBer på tvers: 1) en underregion av hypothalamus (HYP); 2) den basolaterale amygdala (BLA); og 3) de ventrale (vHC) og dorsale (dHC) underregionene i hippocampus, fra de KA-induserte epileptiske anfallsmusene (øvre verdi) kontra kontrollene (lavere verdi) (n = 10). Nivåene normaliseres til vevsvekten (slag tilsvarer ca. 0,5-1,5 mg) og uttrykkes i nmol/g. Bare AEA uttrykkes i pmol/g. Lipidnivåene presenteres som gjennomsnittsverdi ± SEM. Gjennomsnittlig variasjon per stanset hjerneregion (SEM i prosent av gjennomsnitt, gjennomsnittet over alle lipider) er: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; og dHC = henholdsvis 7,90 %. (B) Relative uttrykksnivåer av endogene enzymer og reseptorer involvert i lipidsignalering, samt markører for hjerneaktivitet undersøkt på mRNA-nivå i forskjellige hjerneregioner/underregioner fra mus utsatt for KA-indusert epileptisk anfall (rød) og kontroller (lysegrå). Statistiske analyser av forskjellen mellom gruppemidler ble utført ved hjelp av den tosidige uparrede student t-testen og betraktet signifikant med en p-verdi <0,05 (n = 10). Disse dataene ble opprinnelig publisert i Lerner et al.7Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Immunhiistokjemisk NeuN og CASP3 dobbel flekk. Fem dager etter KA injeksjonsimmunohistokjemi ble utført på hjerneseksjoner fra ubehandlede saltvannsinjiserte mus (venstre), subkronisk PEA forbehandlede mus (midten) og epileptiske mus uten forbehandling (høyre). PEA-forbehandling viser nevrobeskyttende effekter sammenlignet med ubehandlede epileptiske mus (n = 3). Disse dataene ble opprinnelig publisert i Post et. al.13Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nevrolipidomiske og transkripsjonshemmelige metodikken som er beskrevet her, er et levedyktig middel for å undersøke enhver sykdom eller sunn utvikling ved høy og lav romlig oppløsning i hjernen og perifere organer. På grunn av optimalisert plasma prøvetaking og håndtering prosedyrer, plasma lipidomisk analyse kan også utføres fra de samme dyrene ofret for vev lipidomics og transcriptomics, og dermed forbedre påliteligheten av vev blod molekylære korrelater og biomarkør oppdagelse. Levering av et bredt sett med data ved anvendelse av en av de tre protokollene eller kombinasjonene derav, er av verdi for å undersøke ikke bare en nevrologisk sykdom i en kontekst (dyremodelleksperiment), men også på tvers av og mellom eksperimentelle modellkontekster. Videre legger et høyt nivå av standardisering av prøvetaking, prosessering og molekylær analyse til rette for høy reproduserbarhet av molekylære data, og refererer derfor pålitelig til molekylære endringer mellom og innenfor studier og laboratorier.

For å oppnå dette er imidlertid oppsettet av et eksperimentelt design som gir maksimalt avlesningspotensial for det definerte studiemålet kritisk. For å oppnå en pålitelig sammenligning av molekylære endringer mellom eksperimentelle grupper, anbefales det å bruke minst ti dyr for å kompensere for dyrs variasjon og det biologiske spekteret av lipidnivåer. Når innkjøp av dyr og/eller logistikk av dyrehåndtering er restriktiv, er bruk av minimum seks dyr per gruppe avgjørende for å ha råd til selvsikker statistisk analyse. Gruppestørrelsesberegninger må kompensere for modellrelatert dødelighet (dvs. minimum seks, ideelt ti, dyr per gruppe kreves for studien til tross for modellens mulige dødelighet). En kritisk forutsetning er å sikre alders-, kjønns- og belastningstilpassede dyr per eksperimentell gruppe. For oppdagelsesfasen er det viktig å bruke samme leverandør for eksperimentelle dyr for alle studier og samme dyreparti om mulig, for å unngå skjevheter i funnene på grunn av mulige atferdsmessige og molekylære fenotype forskjeller mellom dyrepartier. For å sikre pålitelighet og reproduserbarhet av den molekylære og atferdsmessige fenotypen som bestemmes i studiene, er det viktig å utføre en biologisk replikeringsanalyse når det er mulig.

Et annet viktig skritt er å sette opp et standardisert, planlagt eksperimentelt arbeid med dyregrupper. Det er viktig å behandle dyrene innen samme tidsvindu på dagen for å omgå circadian molekylær variasjon. Tidspunktet på dagen bør settes i henhold til den kjente effekten av døgnrytme på syntese og nedbrytning av målmolekylene eller holdes konsistent for alle eksperimentelle grupper når ingen informasjon om døgnrytmeeffekter er tilgjengelig. På samme måte må bolig- og fôringsforholdene før dyreoffer opprettholdes konsistent og strengt kontrollert på tvers av eksperimentelle modeller. Dette er spesielt relevant for lipidomisk profilering på grunn av påvirkning av ernæring på lipidplasma og vevsmetabolisme. Administrasjon av terapeutiske eller sykdomsinduserende legemidler bør alltid utføres parallelt med kjøretøyadministrasjon i kontrollgrupper, hvorved kjøretøyet må være det samme som det som brukes til legemiddeladministrasjon. For å velge den mest egnede gnagerstammen og/eller substrains for studiens formål, bør de legemiddelbaserte behandlingsstrategiene utføres i henhold til legemiddelspesifikkitet når det gjelder tid og hyppighet av administrasjon, doser og administrasjonsvei, og de spesifikke følsomhetene for legemidler av forskjellige stammer utledet fra litteratur og / eller tidligere erfaring. En tidskursundersøkelse av en sykdom og respons på terapi som involverer store kohortgrupper eller flere dyregrupper er umulig å utføre på en dag når det gjelder behandling, ofre og prøvetaking. I slike tilfeller må dyregruppebehandling planlegges og utføres i påfølgende dager, men opprettholde de samme forholdene når det gjelder tid på dagen, eksperimentell design, behandlingstid, forskere, etc. Utarbeidelsen av kjemiske injeksjoner er et annet kritisk skritt. Legemiddel- eller sykdomsinduserende forbindelser må tilberedes ferskt før administrering og i henhold til legemiddelspesifikasjoner. Bruken av samme produksjonsparti av legemidlet anbefales for alle kohorter som skal sammenlignes. Dette er spesielt viktig når det gjelder naturlige sammensatte formuleringer som kainsyre (KA) som brukes i denne studien for epilepsiinduksjon.

For å muliggjøre pålitelig lipidomisk og eller transkripsjonsprofilering, må dyrevernprosedyren utføres konsekvent på tvers av dyregruppene innen en tidsramme på 5 minutter. Hvis blod samles etter halshugging, er det viktig å opprettholde en konstant mengde isofluran i glasskammeret. Til dette formål, suge ofte (etter fem bruksområder) med isofluran og ikke overstige 10 s for varigheten av anestesi ved hjelp av isofluran, for å unngå utbrudd av arytmi og hjertebank og sikre riktig blodtrykk for plasma prøvetaking.

Betingelser for biologisk materialprøvetaking og håndtering (f.eks. tidsvinduet og rekkefølgen på biologisk materiale prøvetaking og håndtering) må følges nøye og vedlikeholdes identisk for alle grupper. For å unngå variable grader av vevstining og dermed inkonsekvente eks vivovevsendringer av lipid- og/eller mRNA-nivåer, er det viktig å opprettholde strengt kontrollerte tids- og temperaturforhold for etterprøvetaking
lagring. vevsredusering eller stansing, og påfølgende prøvebehandling og analyse (se pkt. 3 og 4). Nyprøvede hele hjerner kan umiddelbart dissekeres på en ferdigkjølt metallplate (4 °C) uten forutgående snapfreezing, hvis størrelsen på de eksperimentelle dyregruppene tillater dyreoffer, fjerning og disseksjon uten å endre tidsrammen som er angitt her for hver av disse prosedyrene. Hvis størrelsen på eksperimentelle grupper ikke er praktisk for disse prosedyrene, anbefales snap-frysing av hjernen og etterfølgende disseksjon for å tillate sammenlignbar og kontrollert tid til behandling. Når de strengt fulgte protokollene og tidslinjeretningslinjene som er angitt her, ble det ikke observert noen avvik mellom molekylære nivåer oppnådd ved utvinning av ny dissekerte hjerneregioner og hjerneregioner dissekert fra frosne hjerner.

Et kritisk aspekt for å oppnå reproduserbare og minimale variasjoner av lipidnivåene i og mellom grupper, bortsett fra prøvebehandling under strengt kontrollerte temperaturforhold, er tilveiebringelse av antioksidanter (se avsnitt 2 og 3). Å unngå stressfaktorer (f.eks. lukten av blod) av dyrene før ofre er av avgjørende betydning, siden mange lipider involvert i nevronaktivitet som eCB-er raskt kan endres som respons på stress.

For lipidutvinning og analyse er det viktig å forberede de interne standardene, kalibreringsløsningene og ekstraksjonsløsningsmidlene på ekstraksjonsdagen. Den samme kilden til interne standarder må brukes til både kalibreringskurveforberedelse og for prøveekstraksjoner. Også, etter strengt kontrollerte temperaturforhold for prøveutvinning, lagring og analyse er avgjørende for å minimere og kontrollere ex vivo enzymatiske eller kjemiske endringer av molekyler. For LC/MRM-analyse kan settet med målrettede lipider skreddersys til studiemålet ved å legge til eller fjerne mål og tilsvarende interne standarder og kalibranter, forutsatt at separasjons-, deteksjons- og MRM-overgangene for et nytt sett med lipider er optimalisert. De presenterte utvinningsprotokollene gjør det mulig å levere to LC/MRM-replikeringer for eCB-er og eC-er, noe som er medvirkende for tilfeller av teknisk svikt eller når replikeringsanalyse er av betydning for studien. PL-ekstraksjonsprotokoller gjengir prøve-/ekstraktmengder som er egnet for minst 10 analyser per ekstrakt (f.eks. multippel skanneeksperimenter basert på forløperion og nøytral tapsskanning2, henholdsvis ytterligere LC/MRM-analyser; eller LC/MRM replikerer for å kompensere for teknisk svikt under en løpetur). Lipidanalysen er ikke begrenset til LC/MRM; Faktisk lipid ekstrakter oppnådd med noen av disse protokollene er egnet for untargteted, high-end masse spektrometriy analyse. Bortsett fra hjerneslag eller minuttmengde av vev hentet fra diskrete regioner (mindre enn 3 mg), kan frosne pulveriserte vev i regioner større enn 2-3 mg alisiteres og brukes til flere ekstraksjonsmoduler som beskrevet her for replikeringsanalyse og / eller for andre undersøkelser som kan brukes i vevspulver.

En generell fordel med protokollene som er beskrevet her sammenlignet med vanlige, er den økte generelle tidseffektiviteten og følsomheten for flerkomponert utvinning og analyse ved reduserte utgifter til dyreressurser, forbruksvarer og analysekostnader. Det er viktig at den doble lipid/mRNA-ekstraksjonsprotokollen også gir en høyere effektivitet av mRNA-ekstraksjon20,21 og integriteten til mRNA sammenlignet med tilsvarende tilgjengelige standardprotokoller, og samtidig økt effektivitet av lipidutvinningen7. Dette skyldes sannsynligvis også den reduserte matriseeffekten for hver av lipid- og mRNA-fraksjonene når de er behørig ekstrahert. På grunn av dette er metoden lett anvendelig for profilering med høy romlig oppløsning, for eksempel i hjerneslag.

En nåværende begrensning av protokollen er imidlertid at de inflammatoriske lipidene ikke er egnet for analyse og kvantifisering ved hjelp av dobbel lipid / mRNA-ekstraksjon. Dermed er protokollen gjenstand for ytterligere raffinement. For dette formål kan vevs- og plasmainflammatoriske lipider og endocannabinoider co-ekstraheres og analyseres samtidig, noe som er et optimalisert verktøy for samtidig å undersøke nevroinflammatoriske prosesser og endocannabinoider-modulert nevronaktivitet (se coextraction av eCs og eCB). Inkludering av fosfolipider i denne sistnevnte analysen forventes å være mulig.

I lys av prospektive multi-omic tilnærminger for nevrologiske sykdommer, forventes den proteomiske analysen av proteinfraksjoner oppnådd etter lipidekstraksjonsprotokollen (dvs. co-utvinning av eCB og eCs, samt co-utvinning av PLs og eCB) å være mulig. Dette er imidlertid ennå ikke mulig når du bruker dual lipid/mRNA-protokollen. For sistnevnte utelukker det kjemiske miljøet i utvinningen selv proteinmengdebestemmelse ved hjelp av standard proteinanalyser som bicinchoninic acid assay (BCA). Videre utvikling for å overvinne denne begrensningen og fremskynde inkluderingen av proteomisk profilering i disse protokollene er planlagt.

Ved hjelp av den modulære protokollen som er beskrevet her, var det mulig å oppnå et hjernens regionale kart over eCs, eCB-er og PLer i en dyremodell av akutte epileptiske anfall (figur 4). Protokollen viste hippocampal modulasjon av inflammatoriske prosesser av eCs og av nevronal aktivitet modulasjon av eCB i behandlede og ubehandlede mus med KA-induserte akutte anfall13. Subregional hjernelokalisering av fosfolipid, endocannabinoid og mRNA-endringer ved henholdsvis akutt epileptiske anfallstilstander ble også observert (figur 5). Disse resultatene fremhever verdien og anvendbarheten av metodene beskrevet her for å fremme kunnskapen om et bredt spekter av lipider involvert i modulering av komplekse nevrologiske sykdommer som epilepsi i hjerneregioner og underregioner. Disse protokollene er av generell anvendbarhet i nevrologisk sykdomsundersøkelse og utover mens videreutvikling av protokoller og anvendelser for cellepopulasjoner fortsetter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi dedikerer denne artikkelen til Dr. Ermelinda Lomazzo. Under ferdigstillelsen av dette manuskriptet gikk Dr. Ermelinda Lomazzo bort. Hun er legemliggjørelsen av lidenskap for vitenskap og uselvisk engasjement i teamarbeid for å oppfylle et meningsfylt forskningsformål. Hun drømte alltid om å bidra meningsfullt til menneskers større velvære. Hennes godhjertede natur ble aldri kompromittert av de anstrengende veiene i vitenskap og liv. Hun vil forbli uvurderlig, og for alltid, i våre hjerter.

Julia M. Post ble finansiert av Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) ved University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz og er for tiden finansiert av SPP-2225 EXIT-prosjektet til LB. Raissa Lerner ble delvis finansiert av DZHK-prosjektet 81X2600250 til LB og Lipidomics Core Facility. Delvis finansiering av disse studiene ble gitt av Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry og Intramural funds (til LB) fra University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
  3. Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  4. Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
  5. Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
  6. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
  7. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
  8. Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
  9. Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
  10. Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
  11. Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
  12. Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
  13. Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
  14. Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
  15. Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
  16. Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
  17. Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
  18. Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
  19. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  20. Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
  21. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 181 lipidomikk transkripsjon hjerneregioner dyremodeller av nevrologiske sykdommer hjernens høye romlige oppløsning kvantitativ lipidomikk
Lipidomikk og transskriftomikk ved nevrologiske sykdommer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter,… More

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter