Summary
Cet article présente un protocole modulaire pour la lipidomique tissulaire et la transcriptomique, et la lipidomique plasmatique dans des modèles murins de maladies neurologiques ciblant les lipides sous-jacents à l’inflammation et à l’activité neuronale, les lipides membranaires, les messagers en aval et les enzymes/récepteurs codant pour l’ARNm sous-jacents à la fonction lipidique. Les procédures d’échantillonnage, de traitement des échantillons, d’extraction et de quantification sont décrites.
Abstract
Les lipides servent d’interface principale aux insultes cérébrales ou aux stimuli propices aux maladies neurologiques et sont un réservoir pour la synthèse des lipides avec diverses fonctions de signalisation ou de ligand qui peuvent souligner l’apparition et la progression des maladies. Changeant souvent au niveau présymptomatique, les lipides sont une source émergente de cibles médicamenteuses et de biomarqueurs. De nombreuses maladies neurologiques présentent la neuroinflammation, la neurodégénérescence et l’excitabilité neuronale comme caractéristiques communes, partiellement modulées par des systèmes de signalisation lipidique spécifiques. L’interdépendance et l’interrelation de la synthèse de divers lipides incitent à une analyse multilipide, multienzymatique et multiréceptrice afin d’en déduire les points communs et les spécificités des contextes neurologiques et d’accélérer le démêlage des aspects mécanistes de l’apparition et de la progression de la maladie. L’attribution de rôles lipidiques à des régions cérébrales distinctes fait progresser la détermination du phénotype moléculaire lipidique et de la morphologie associée à une maladie neurologique.
Présenté ici est un protocole modulaire adapté à l’analyse des lipides membranaires et des signaux lipidiques en aval ainsi que de l’ARNm des enzymes et des médiateurs sous-jacents à leur fonctionnalité, extraits de régions cérébrales discrètes pertinentes pour une maladie et/ou une affection neurologique particulière. Pour assurer un profilage lipidomique comparatif précis, les flux de travail et les critères d’exploitation ont été optimisés et normalisés pour : i) l’échantillonnage cérébral et la dissection des régions d’intérêt, ii) la co-extraction de multiples signaux lipidiques et lipides membranaires, iii) l’extraction double lipide/ARNm, iv) la quantification par chromatographie liquide par surveillance des réactions multiples (LC/MRM) et v) le profilage standard de l’ARNm. Ce flux de travail se prête aux faibles quantités de tissus obtenues par l’échantillonnage des sous-régions cérébrales fonctionnellement discrètes (c’est-à-dire par poinçonnage du cerveau), empêchant ainsi les biais dans l’analyse multimoléculaire dus à l’hétérogénéité tissulaire et / ou à la variabilité animale. Pour révéler les conséquences périphériques des maladies neurologiques et établir des lectures moléculaires translationnelles des états de maladie neurologique, l’échantillonnage et le traitement des organes périphériques et leur analyse lipidomique ultérieure, ainsi que la lipidomique plasmatique, sont également poursuivis et décrits. Le protocole est démontré sur un modèle murin d’épilepsie aiguë.
Introduction
Les progrès récents dans la fonction des lipides et leur rôle dans l’apparition et la progression des maladies neurologiques ouvrent de nouveaux lieux de recherche et de développement de nouvelles cibles thérapeutiques et d’élucidation des mécanismes de la maladie1. Les différences documentées dans la composition lipidique dans différentes régions du cerveau, soulignées par les techniques modernes d’imagerie moléculaire telles que l’imagerie par spectrométrie de masse et le profilage avancé par spectrométrie de masse, déplacent le paradigme de l’investigation des lipides de l’ensemble du cerveau vers des régions cérébrales fonctionnellement distinctes et discrètes. Le fait que la composition lipidique varie dans différentes régions du cerveau incite à une nouvelle conceptualisation de la sensibilité aux lipides membranaires et de la signalisation lipidique en aval en réponse à une insulte cérébrale ou à des stimuli dans les régions cérébrales fonctionnellement distinctes. Par conséquent, les protocoles lipidiques nécessitent de nouveaux développements pour relever le défi des faibles quantités de tissus pour la détection et la quantification à plus haute résolution spatiale, et simultanément, l’analyse de multiples composants lipidiques des membranes cellulaires et des voies de signalisation. En outre, la détermination des enzymes, des ligands lipidiques et des récepteurs impliqués dans la régulation de leurs niveaux et de leur fonction est primordiale pour élucider les voies de signalisation affectées dans une maladie neurologique et guider de nouvelles investigations mécanistes dans un contexte physiopathologique.
En plus de l’augmentation de la résolution spatiale du cerveau, deux difficultés majeures remettent en question le développement de nouvelles approches neurolipidomiques. Tout d’abord, les molécules de signalisation lipidique sont généralement de très faible abondance par rapport aux lipides constitutifs de la membrane. Deuxièmement, le lipidome présente une grande hétérogénéité structurelle, difficile à disséquer à l’aide d’une seule approche analytique. Par conséquent, les méthodes d’extraction et d’analyse sont adaptées à différentes catégories de lipides et couramment effectuées dans des échantillons de tissus distincts.2. Méthodes lipidomiques Shotgun3 sont d’excellents outils pour révéler rapidement un large profil des lipides membranaires, tandis que la sensibilité et la sélectivité accrues offertes par les méthodes de spectrométrie de masse de découverte et de quantification ciblées sont capitalisées pour étudier les lipides de signalisation à faible abondance, y compris: i) les lipides inflammatoires et ii) les lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les endocannabinoïdes (eCB), les lipides liés aux acides aminés, etc.4,5. Pour englober les changements lipidiques à la fois au niveau de la membrane cellulaire et de la signalisation se produisant dans les régions du cerveau des modèles de maladies neurologiques, l’extraction et l’analyse des lipides sont généralement effectuées dans des échantillons de tissus distincts, obtenus à partir de lots animaux distincts ou de différents hémisphères, ou en disséquant une plus grande région tissulaire en plusieurs morceaux. Lorsque les niveaux d’ARNm des récepteurs enzymatiques sont également intéressants, leur étude nécessite généralement l’obtention d’un échantillon de tissu distinct. Par exemple, l’étude des lipides membranaires, des cannabinoïdes endogènes et de l’ARNm nécessiterait trois échantillons de tissus différents (par exemple, deux échantillons pour les deux méthodes d’extraction des lipides - lipides membranaires et lipides de signalisation - et deux méthodes d’analyse des lipides subséquentes - et un échantillon pour l’analyse de l’ARNm). L’étude des lipides inflammatoires et des cannabinoïdes endogènes nécessite respectivement deux échantillons de tissus, des méthodes d’extraction et des méthodes d’analyse distincts. Un autre exemple est l’étude de l’ARNm et de toute catégorie de lipides dans un échantillon de microdissection cérébrale ou laser qui nécessite par conséquent deux animaux distincts pour obtenir deux échantillons par (sous-)région cérébrale. Une variabilité importante et/ou une mauvaise reproductibilité des résultats se produisent fréquemment dans de tels cas, provenant de la variabilité biologique et/ou de l’hétérogénéité tissulaire. Guidé par ces limites pratiques de l’analyse multimoléculaire, se produisant en particulier à haute résolution spatiale dans le cerveau, un protocole neurolipidomique à trois modules a été conçu englobant: 1) la coextraction et la co-analyse par LC / MRM des lipides inflammatoires (par exemple, les eicosanoïdes (eiC)) et des lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les eCB2; 2) co-extraction des phospholipides (PL) et des eCB avec analyse LC/MRM multiscan et analyse de perte précurseur/neutre ultérieure2; et 3) double extraction des lipides membranaires (phospho)et des eCB ainsi que de l’ARNm, avec analyse ultérieure LC/MRM et qPCR ou séquençage de l’ARN6. Selon la question biologique à traiter dans une maladie neurologique et la région du cerveau d’intérêt, une combinaison du premier et du deuxième protocole, ou du premier et du troisième protocole, peut être appliquée sur le même échantillon de tissu pour des tissus pesant environ 4 mg. Les premier et troisième protocoles peuvent être appliqués indépendamment pour les tissus autour de 2 mg. Le deuxième protocole peut être appliqué pour les tissus pesant aussi peu que 0,5 mg. Quel que soit le module de protocole neurolipidomique sélectionné, le prélèvement tissulaire et le traitement pré-analytique, l’isolement cérébral et la dissection de la région, ainsi que la procédure de sacrifice du modèle animal sont standardisés et identiques pour les trois modules du protocole. Dans notre enquête sur les maladies neurologiques, les organes périphériques pertinents pour les conséquences pathologiques de la maladie sont toujours collectés et analysés à l’aide de ces protocoles modulaires. De plus, le sang est régulièrement prélevé pour la lipidomique plasmatique afin de servir d’outil de lecture des maladies neurologiques en vue d’applications translationnelles potentielles. Le protocole lipidomique modulaire présenté ici est très polyvalent : évolutif à de plus grandes quantités de tissus et facilement applicable à pratiquement tous les types de tissus et de maladies. Pour l’application du protocole modulaire (Graphique 1) dans les maladies neurologiques, tout modèle normalisé d’apparition et de progression de troubles neurologiques, tels que les lésions cérébrales traumatiques, la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou l’épilepsie, est acceptable.
Ces protocoles ont été largement appliqués pour étudier les changements dans le lipidome tissulaire et / ou le transcriptome à la phase aiguë de l’épilepsie dans le modèle murin d’épilepsie induit par l’acide kainique (KA)2,7, un modèle largement utilisé dans les études précliniques en raison de la ressemblance avec l’épilepsie du lobe temporal humain (TLE)8,9,10,11. À l’aide de ces protocoles, le potentiel thérapeutique de médicaments tels que le palmitoyléthanolamide (PEA)12,13 a été évalué dans le même modèle murin d’épilepsie. L’étude a identifié des changements de lipides et d’ARNm à haute et basse résolution spatiale dans le cerveau et la périphérie, au point temporel des intensités de crise aiguës maximales (à 60 min après l’induction de l’incendie), et lors d’un traitement subchronique et aigu avec PEA à quatre moments différents (20, 60, 120 et 180 min) après l’induction de la crise KA, une fenêtre temporelle couvrant la phase aiguë de l’épilepsie. Le plasma, le cerveau et les organes périphériques de souris injectées de KA non traitées, de souris traitées au PEA aigu et subchroniquement, ainsi que de souris témoins de véhicules et de véhicules PEA, ont été collectés à chaque point de temps12,13 et étudiés avec cette analyse moléculaire. Les données moléculaires ont été corrélées avec les phénotypes comportementaux obtenus par scoring de crise, ainsi qu’avec les données dérivées de l’immunohistochimie sur les processus neurodégénératifs, afin de démêler la progression de la phase d’épilepsie aiguë et le potentiel du PEA pour l’atténuer.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales décrites ici sont conformes à la directive du Conseil de la Communauté européenne du 22 septembre 2010 (2010/63UE) et ont été approuvées par le comité local des animaux de l’État de Rhénanie-Palatinat, Allemagne (référence du dossier: 23 177-07/G16-1-075).
1. Modèle animal d’épilepsie aiguë et traitée prophylactiquement induite par l’AC
- Effectuer l’induction des crises, le traitement et la notation comportementale.
- Séparer les souris (minimum n = 6 souris par groupe) dans des cages simples.
- Préparer la solution injectable d’induction épileptique et le véhicule correspondant (voir tableau 1), ainsi que la solution d’injection de traitement et le véhicule correspondant (voir tableau 2).
- Injecter des souris par voie intrapéritonéale (i.p.) (10 mL/kg de masse corporelle de souris) sans anesthésie selon leur identité de groupe : maladie, traitée ou traitée par véhicule (c.-à-d. KA, KA traitée par PEA et les deux groupes de véhicules). Voir la figure 2, le tableau 1 et le tableau 2.
- Surveiller et noter le comportement selon l’échelle d’intensité de crise standardisée suivante : 0 = aucune réponse ; 1 = immobilité et regard fixe; 2 = extension du membre antérieur et/ou de la queue, posture rigide; 3 = mouvements répétitifs, balancement de la tête; 4 = élevage et chute; 5 = élevage et chute continus; 6 = crises clonico-toniques sévères; 7 = décès14,15 (figure 3).
- Effectuer une procédure de sacrifice pour l’analyse lipidomique et transcriptomique.
- À quatre moments (c.-à-d. 20, 60, 120 et 180 min après l’injection de KA ou de véhicule, respectivement), sacrifiez six souris de chacun des groupes suivants : traité par PEA, véhicule épileptique non traité PEA 1 et véhicule 2, conformément aux protocoles approuvés par l’IACUC.
- Dix secondes après chaque point de temps atteint, anesthésiez les souris à l’aide d’un tissu imbibé d’isoflurane dans une chambre en verre. Confirmer l’anesthésie par la perte du réflexe de redressement, indiquée par l’incapacité de bouger tout en renversant lentement la chambre à verre. Décapiter des souris à l’aide de ciseaux chirurgicaux et prélever du plasma, du cerveau et des organes périphériques (voir les étapes 2.2.2−2.2.4).
ATTENTION : Les règles éthiques pour les procédures de sacrifice varient d’un comité animalier local à l’autre. Assurez-vous de vérifier et de suivre les règlements émis par le comité local des animaux.
- Suivez la procédure de sacrifice pour l’analyse immunohistochimique.
- Pour la coloration immunohistochimique13, notez comportementalement trois souris de chacun des groupes suivants : PEA traité, PEA-épilepsie non traitée et groupes de véhicules, sur l’ensemble du cours du temps (180 min).
- Sacrifiez et perfusez les souris 5 jours plus tard. Anesthésier en profondeur les souris (voir étape 1.3.1 pour les groupes de souris) par injection par voie intraveineuse de pentobarbital (100 mg/kg) et de buprénorphine (0,1 mg/kg) comme stupéfiants. Confirmer l’anesthésie profonde par la perte de réflexe entre les orteils.
- Fixez la souris sur une plaque de polystyrène et ouvrez immédiatement le thorax à l’aide de ciseaux fins et de pinces standard. Placez le papillon dans le ventricule cardiaque gauche et coupez l’oreillette droite à l’aide de ciseaux fins.
- Ajuster la vitesse et la pression de la pompe à un débit péristaltique constant avec un débit de 2−3 mL/min. Perfuser avec une solution saline tamponnée au phosphate glacé (PBS) pendant environ 5 min. Si nécessaire, remplacez le papillon.
REMARQUE: Avec une perfusion appropriée, les organes internes (à l’exception de la rate) commencent à blanchir en 1-2 min. - Passer de la perfusion à une solution glacée de paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant environ 5 min. Isoler les cerveaux entiers comme décrit à l’étape 2.2.2 et fixer pendant 24 h dans une solution de PFA à 4 % à 4 °C.
- Incuber les cerveaux dans une solution de saccharose à 30% pendant 48 h à 4 °C. Retirez les restes de saccharose avec un papier de soie sec et congelez les cerveaux sur une plaque métallique (-80 °C). Stockez le cerveau à -80 °C pour les procédures de coloration13.
2. Procédures d’échantillonnage pour l’analyse lipidomique/transcriptomique
- Préparez-vous à l’échantillonnage.
- Tubes EDTA prérefroidis pour l’échantillonnage plasma à 4 °C. Prérefroidir la centrifugeuse et l’appareil vortex à 4 °C. Prérefroidissez la plaque métallique recouverte de papier d’aluminium (pour casser le cerveau gelé et/ou d’autres tissus d’intérêt) sur de la glace carbonique (-80 °C). Prérefroidir les tubes marqués de 2 mL et 5 mL sur de la glace carbonique (-80 °C) pour les aliquotes plasmatiques, les tissus congelés et la collecte de cerveaux, respectivement. Utilisez des tubes ambrés pour protéger les molécules sensibles à la lumière, telles que les eiC.
- Nettoyez l’équipement d’échantillonnage et d’isolement des tissus (ciseaux chirurgicaux, ciseaux fins droits et tranchants, pinces standard droites et lisses, pinces fines avec finition miroir, pinces et spatules incurvées, plaque de mousse de polystyrène et aiguilles pour la fixation) avec un désinfectant (p. ex. éthanol à 70 %).
- Protocoles d’échantillonnage
- Déterminer l’ordre d’échantillonnage.
- Prélever le sang immédiatement après la décapitation dans des tubes EDTA de 1 mL prérefroidis (voir étape 2.2.3).
- Retirez tout le cerveau et congelez immédiatement après le retrait. Cette étape prendra 1 à 2 min. Conserver les cerveaux congelés à -80 °C pour un traitement ultérieur (voir étape 2.2.2).
- Prélever les organes périphériques d’intérêt (p. ex., poumon, cœur, foie), dans les 5 minutes suivant l’ablation du cerveau, et congeler et conserver à -80 °C pour un traitement ultérieur (voir l’étape 2.2.4).
- Retirez le cerveau pour les procédures de dissection ou de poinçonnage. Cette procédure prend 1−2 min/cerveau.
- Après la décapitation (voir étape 1.2), commencez à faire une incision médiane dans la peau à l’aide de ciseaux fins. Libérez le crâne en retournant la peau sur les yeux. Atteignez le sommet du crâne et faites une petite incision caudale en commençant au niveau de l’os intrapariétal. Évitez de couper dans le cerveau.
- Coupez fermement la partie la plus antérieure du crâne entre les yeux pour faciliter l’ablation du cerveau. Inclinez un côté de l’os pariétal à l’aide de pinces incurvées à motif étroit et rompez. Répétez la dernière étape pour l’autre côté.
- Enlevez les méninges cérébrales. Faites glisser une spatule sous la partie antérieure du cerveau (c’est-à-dire le bulbe olfactif) et inclinez doucement le cerveau vers le haut. Faites glisser la spatule plus bas pour briser l’optique et d’autres nerfs crâniens.
- Soulevez le cerveau hors du crâne et congelez tout le cerveau immédiatement sur une plaque métallique prérefroidie (-80 ° C) avec la face ventrale faisant face à la plaque métallique (dorsale vers le haut).
- Laisser les cerveaux geler complètement et transférer dans des tubes de 5 mL prérefroidis et les stocker à -80 °C jusqu’à la dissection des régions du cerveau ou la procédure de poinçonnage (voir étapes 3.1. et 3.2).
- Effectuer un échantillonnage plasmatique.
- Tubes EDTA prérefroidis Spike avec 10 μL d’indométacine-dilution fraîchement préparée à une concentration cible de 10 μM.
- Prélever le sang du tronc immédiatement après la décapitation en pressant doucement le corps dans des tubes EDTA prérefroidis jusqu’à un volume sanguin maximal de 1 mL.
REMARQUE: En cas de pression artérielle appropriée, il n’est pas nécessaire de presser. Si le volume sanguin est inférieur à 1 mL, diminuez le temps d’incubation de l’isoflurane pour permettre une bonne circulation sanguine. - Centrifuger immédiatement les tubes sanguins à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirer la phase plasmatique supérieure résultante et aux fins de l’analyse multilipidique des volumes plasma définis par aliquote dans des tubes prérefroidis de 2 mL comme suit: 50 μL pour l’analyse eCB/eiCs, 30 μL pour l’analyse PLs et le volume plasma restant comme échantillon de secours ou pour d’autres types d’analyse.
- Conserver les échantillons de plasma à -80 °C pour une extraction ultérieure (voir étapes 4.1.2 et 4.1.4).
- Effectuer un prélèvement d’organes périphériques.
REMARQUE: Utilisez les références d’anatomie de la souris16 et la documentation fournie pour les cours obligatoires (FELASA) suivis par les chercheurs sur les animaux afin d’identifier les organes individuels, leurs tissus conjonctifs et / ou leurs vaisseaux sanguins.- Immobilisez le torse de la souris pour faciliter le prélèvement d’organes à l’aide d’aiguilles. Faites une incision ventrale de la ligne médiane à l’aide d’un ciseau droit et pointu à la hauteur du pubis. Utilisez des pinces standard émoussées pour fixer la paroi abdominale tout en coupant pour ouvrir la cavité abdominale.
- Immobiliser la peau pour permettre le prélèvement des organes abdominaux à l’aide de pinces contondantes. Pour l’ablation du cœur ou des poumons, continuer la coupe médiale dans la direction de la grotte mammaire. Retirez le poumon et/ou le cœur à l’aide d’une pince fine.
- Ouvrez soigneusement la cavité mammaire pour éviter les saignements. Coupez les tissus conjonctifs et les vaisseaux sanguins qui ancrent l’organe respectif sans couper à travers l’organe.
- Transférer immédiatement les morceaux de tissu sur des plaques métalliques prérefroidies (-80 °C) et laisser geler complètement. Transférer les morceaux de tissu dans des tubes prérefroidis et les conserver à -80 °C pour un traitement ultérieur (voir étape 4.1).
- Déterminer l’ordre d’échantillonnage.
3. Traitement des matières biologiques
REMARQUE: Pour la co-extraction des eCB/eiCs, utilisez des tubes ambrés de 2 mL comme tubes d’extraction et ajoutez dans chaque tube sept billes d’acier prérefroidies. Pour la co-extraction des PL/eCB et pour la double co-extraction des lipides et des ARN, utilisez 2 mL de tubes d’extraction sans ARNi enrichis de billes de céramique (Table des matériaux).
- Effectuer la dissection cérébrale et le traitement des organes périphériques.
REMARQUE: Utilisez des lampes grossissantes pour augmenter la visibilité du cerveau pour la dissection.- Nettoyez les outils chirurgicaux, y compris les pinces avec des pointes super fines, 2x avec 70% d’éthanol.
- Transférer les cerveaux congelés de -80 °C dans une boîte de Pétri contenant un tampon physiologique prérefroidi (pH 5,5) Assurez-vous que la boîte de Pétri est à 4 °C. Permettre aux cerveaux de se dégeler complètement pour permettre la dissection. Testez soigneusement à l’aide de pinces.
ATTENTION : Ne gardez pas le cerveau à 4 °C plus longtemps que nécessaire pour la décongélation. - Prérefroidir une plaque métallique sur de la glace (4 °C) et la recouvrir de tissus humides imbibés de tampon physiologique glacé (pH 5,5) et transférer soigneusement le cerveau avec le côté ventral vers le haut sur une plaque métallique prérefroidie (4 °C) sur de la glace. Couvrez-le de tissus humides imbibés d’un tampon physiologique glacé (pH 5,5).
- Disséquez les régions du cerveau dans un délai maximum de 5 minutes à l’aide de pinces à pointe super fine. Commencez par l’hypothalamus (HYP) et tournez la face dorsale vers le haut pour continuer avec le côté droit. Isolez l’hippocampe (HCr), le cortex préfrontal (PFCr), le striatum (STRr) et le cortex cérébral (cCTXr). Ensuite, disséquez le côté gauche. Isolez l’hippocampe (HCl), le cortex préfrontal (PFCl), le striatum (STRl) et le cortex cérébral (cCTXl). Disséquer le cervelet et la région thalamique. Utilisez des références anatomiques publiées16,17 pour l’identification de la région du cerveau.
- Transférer chaque pièce disséquée directement sur une plaque métallique prérefroidie recouverte d’une feuille d’aluminium (-80 °C). Permettre la congélation et le transfert des régions cérébrales isolées dans les tubes de 2 mL prérefroidis étiquetés.
- Pulvériser les morceaux de tissu à l’aide d’un pulvérisateur de tissu (à -80 °C), en évitant la décongélation du tissu. Dans la chambre froide, poudre de tissu aliquote dans des tubes d’extraction étiquetés et prérefroidis contenant des billes de céramique ou des billes d’acier. Pour l’analyse double lipidomique/transcriptomique, peser les aliquotes de poudre tissulaire dans la chambre froide. Pour l’analyse lipidomique uniquement, choisissez entre la normalisation du poids tissulaire ou de la teneur en protéines. Pour ce dernier, continuez sans peser les tissus.
- Couper les tissus des organes périphériques en morceaux d’un poids maximum de 20 mg. Procéder à la pulvérisation des tissus comme à l’étape 3.1.6.
- Procéder à l’extraction d’échantillons de tissus (voir étapes 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou stocker des tubes à -80 °C pour une extraction ultérieure.
REMARQUE: La matrice cérébrale peut également être utilisée si la conception de l’étude le permet. Cependant, la méthode est plus appropriée pour un nombre discret et limité de régions du cerveau, et il n’est pas pratique de disséquer et d’isoler toutes les régions du cerveau mentionnées ci-dessus dans le délai imparti.
- Effectuez un coup de poing dans le cerveau.
- Montez les cerveaux entiers et gelés sur le système de montage (Table des matériaux) dans le cryostat. Réglez l’épaisseur sur 50 μm et coupez en mode découpage près de la région d’intérêt.
- Colorer une tranche de cerveau (18−20 μm) en utilisant du bleu de toluidine (0,1 %−1 %) comme référence pour localiser la sous-région d’intérêt. Inspectez les tranches colorées à l’aide d’un microscope pour identifier les régions d’intérêt à poinçonner. Utilisez un atlas de souris comme référence pour trouver les régions anatomiques cérébrales appropriées16. Prenez des poinçons d’un diamètre de 0,8 à 1,0 mm à l’aide de carottes d’échantillon dans des tubes prérefroidis.
- Peser les poinçons congelés dans la chambre froide dans des tubes d’extraction étiquetés et prérefroidis de 2 mL contenant des billes de céramique ou des billes d’acier. Utilisez des tubes ambrés pour la co-extraction des eCB et des eiCs.
- Commencez l’extraction (voir les étapes 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou stockez les tubes à -80 °C pour une extraction ultérieure.
- Effectuer un traitement plasma.
- Placer les échantillons de plasma congelés sur de la glace (4 °C) et les laisser décongeler (~20 min).
- Assurez-vous que le plasma est entièrement décongelé avant de commencer l’extraction.
- Procéder à la procédure d’extraction au plasma (voir les étapes 4.1.2 ou 4.1.4).
REMARQUE : Les échantillons de plasma doivent rester à -80 °C jusqu’à l’extraction. Évitez les cycles de décongélation et de recongélation.
4. Procédures d’extraction
- Effectuer des protocoles de co-extraction lipidique liquide-liquide (LLE).
- Effectuer la co-extraction d’eCB et d’eiCs à partir de morceaux de cerveau, de poinçons ou d’échantillons de poudre de tissu.
REMARQUE: Un pipetage précis est nécessaire tout au long de la procédure.- Placer les tubes d’extraction contenant les échantillons de tissus et sept billes d’acier sur de la glace (4 °C). Ajouter 600 μL de MTBE glacé et 50 μL d’ACN/H2O (1:1; v/v) contenant les étalons internes. La concentration cible des étalons internes dans le volume final pour analyse (50 μL) est la suivante : 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3 000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 et 5 ng/mL pour PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 et TXB2-d4, respectivement.
- Ajouter 400 μL d’acide formique 0,1 M et homogénéiser avec un lyseur tissulaire (30 s-1 min). Centrifuger l’homogénat pendant 15 min à 5 000 x g à 4 °C. Laisser congeler la phase inférieure aqueuse pendant 10 min à -80 °C pour faciliter le transfert de la phase organique supérieure.
- Transférer la phase organique dans de nouveaux tubes. Évaporer sous un léger jet de N2 à 37 °C et reconstituer dans 50 μL d’ACN/H2O (1:1; v/v) pour une analyse plus approfondie.
- Conservez la phase aqueuse à -20 °C ou -80 °C pour une analyse plus approfondie de la teneur en protéines.
- Effectuer la co-extraction des eCB et des eiCs à partir d’échantillons de plasma.
- Décongeler les aliquotes de plasma à 4 °C. Ajouter 800 μL de MTBE et 50 μL d’ACN/H2O (1:1; v/v) contenant les étalons internes (analogues à ceux utilisés pour l’analyse tissulaire, voir l’étape 5.1.1). Optimiser la concentration étalon interne pour le pic à l’aide d’échantillons de plasma de référence.
- Ajouter 600 μL d’acide formique 0,1 M et des échantillons de vortex à 4 °C pendant 2 min. Échantillons de centrifugeuse à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Transférer la phase organique dans de nouveaux tubes, évaporer sous un doux flux de N2 à 37 °C et reconstituer dans 50 μL d’ACN/H2O (1:1; v/v) pour l’analyse LC/MRM.
REMARQUE: Si possible, évitez de stocker des extraits séchés d’eiCs et passez immédiatement à l’analyse LC / MRM. Si le stockage ne peut être évité, recourir à un stockage de courte durée pendant seulement 2−3 jours à 4 ° C avec des échantillons dans un solvant d’injection LC.
- Effectuer la co-extraction des PL et des eCB à partir de régions du cerveau, de poinçons ou d’autres échantillons de poudre de tissu.
- Placer les tubes d’extraction contenant les échantillons de tissus et les perles de céramique sur de la glace (4 °C). Ajouter 800 μL de MTBE/MeOH (10:3; v/v) et 10 μL de MeOH contenant les étalons internes. La concentration cible des étalons internes dans le volume final pour analyse (100 μL) est la suivante : 150 ng/mL pour PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1 ; PI 17:0/14:1 ; PLC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12 : 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4 000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 et 3 ng/mL PEA-d4 respectivement.
- Ajouter 200 μL d’acide formique à 0,1 % contenant 25 μM de tétrahydrolipstatine/URB597 et 50 μg/mL de BHT. Homogénéiser avec l’homogénéisateur tissulaire (Table des matières) et centrifuger à 5 000 x g et 4 °C pendant 15 min.
- Récupérer la phase organique supérieure dans de nouveaux tubes et évaporer sous un doux flux de N2 à 37 °C. Reconstituer dans 90 μL de MeOH et conserver à -20 °C ou -80 °C ou passer à l’étape suivante.
- Ajouter 10 % de H2O à une aliquote d’extrait lipidique (4.1.3.3) et injecter 10 μL dans la CL/SM pour l’analyse des PL. Pour une analyse plus approfondie de la CEE, passez à l’étape 4.3.5.
- Prendre une aliquote de l’extrait (4.1.3.3), évaporer à sec et reconstituer en ACN/H2O (1:1; v/v). Utilisez 20 μL pour l’injection de LC/MS pour l’analyse eCB.
- Effectuer la co-extraction des PL et des eCB à partir d’échantillons de plasma.
- Décongeler les aliquotes plasmatiques à 4 °C, ajouter 1 000 μL de MTBE/méthanol (10:3; v/v) et 10 μL de MeOH contenant des étalons internes (analogues à l’étape 4.1.3) et vortex à 4 °C pendant 1 min.
- Ajouter 250 μL de H2O et vortex pendant 45 min à 4 °C. Échantillons de centrifugeuse pendant 15 min à 5 000 x g et 4 °C. Récupérer la phase organique supérieure, évaporer sous un doux flux de N2 à 37 °C et reconstituer dans 90 μL de méthanol pour une analyse LC/MS plus poussée. Conserver à -20 °C ou -80 °C ou passer à l’étape suivante.
- Pour l’analyse des PL, ajouter 10 % d’eau à une aliquote d’extrait lipidique (4.1.2.2).
- Pour l’analyse eCB, ajouter 10 % d’eau à une aliquote de l’extrait lipidique (voir 4.1.4.3), évaporer à sec et reconstituer dans 50 % d’ACN/H2O (1:1; v/v).
- Effectuer une double extraction de l’ARN et des lipides (co-extraction des PL et des eCB) à partir d’échantillons de tissus.
ATTENTION : Assurez-vous de travailler dans des conditions sans ARN pour éviter la dégradation de l’ARN.- Décongeler les aliquotes de poudre de tissu ou les grappes de cerveau (à 4 °C) et ajouter 600 μL de tampon RLT contenant 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL de BHT et 1 % de β-mercaptoéthanol (pour les pourcentages du volume final du tampon d’homogénéisation, voir l’étape 4.1) ainsi que 200 μL de chloroforme aux tubes d’extraction contenant des poinçons cérébraux congelés et des perles de céramique.
- Épiler des échantillons avec 10 μL de mélange étalon interne pour les PL et la co-extraction eCB (voir étape 4.1.3) et homogénéiser via un homogénéisateur tissulaire (haute vitesse, 20 s).
- Transférer les lysats dans de nouveaux tubes centrifuges et centrifuger pendant 5 min à pleine vitesse et 4 °C pour permettre la séparation de phase.
- Récupérez et utilisez la phase supérieure pour l’extraction de l’ARN à l’aide de kits de procédure d’extraction d’ARN standard (Table des matériaux). Éluter l’ARN dans un volume total de 50 μL d’eau sans RNase et stocker à -80 °C.
REMARQUE : L’échantillon à l’étape 4.1.5.4 se prête à la fois au séquençage de l’ARN et à la qPCR à l’aide des méthodes et de l’instrumentation appropriées. - Utilisez la phase inférieure contenant du chloroforme pour l’extraction des lipides. Ajouter 800 μL de MTBE/méthanol (10:3; v/v) et 200 μL d’acide formique à 0,1 % et vortex pendant 45 min à 4 °C. Récupérer la phase organique supérieure et évaporer sous un doux jet de N2 à 37 °C.
- Reconstituer dans 90 μL de méthanol pour une analyse plus approfondie de la CL/SEP. Conserver à -20 °C ou -80 °C ou passer à l’étape 5.
- Ajouter 10 % de H2O à une aliquote d’extrait lipidique (voir l’étape 4.1.5.6 ci-dessus) et injecter 10 μL dans la CL/MS pour l’analyse des PL. Pour une analyse plus approfondie de la CEE, passez à l’étape 5.7.
- Prendre une aliquote de l’extrait (voir ci-dessus étape 4.1.5.6) évaporer à sec et reconstituer en ACN/H2O (1:1; v/v). Utiliser 20 μL pour l’injection de CL/MS pour l’analyse eCB (analogue à l’étape 4.3.5).
- Effectuer la co-extraction d’eCB et d’eiCs à partir de morceaux de cerveau, de poinçons ou d’échantillons de poudre de tissu.
5. Profilage qualitatif et quantitatif LC/MRM
- Préparer des systèmes de solvants LC, des solutions d’étalonnage et des échantillons de contrôle de la qualité.
- Pour les PL, préparer la phase mobile A : méthanol/eau (1:1; v/v) contenant 7,5 mM de formiate d’ammonium et 0,1 % de TEA. Préparer la phase B mobile : méthanol/isopropanol (2:8; v/v) contenant 7,5 mM de formiate d’ammonium et 0,1 % de TEA. Conservez les solvants dans des bouteilles LC.
- Pour la séparation eCB et eiC, préparer les solvants LC suivants : 0,1 % d’acide formique en phase mobile A et 100 % d’ACN contenant 0,1 % d’acide formique en phase B mobile. Conserver les solvants dans des bouteilles de LC.
- Préparer les contrôles de qualité à l’aide des étalons d’étalonnage et des étalons internes (tableau 3) à une concentration équimolaire ou définie par l’utilisateur.
- Préparez des courbes d’étalonnage avec sept points de concentration. Utilisez le même lot étalon interne pour monter en flèche dans la solution de courbe d’étalonnage et dans les échantillons à analyser.
- Utilisez la méthode LC-MRM pour le profilage qualitatif et quantitatif des lipides.
- Ouvrez l’onglet Méthode d’acquisition de build dans le logiciel commercial (par exemple, Analyste) et sélectionnez le mode LC/MRM avec commutation de polarité. Définissez dans la méthode les transitions ioniques (comme indiqué dans le tableau 3) pour le profilage quantitatif. Réglez le temps de décantation à 50 ms.
- Pour le profilage PLs, définissez les paramètres de source d’ions suivants : gaz rideau = 40 psi ; température du chauffe-source = 550 °C; tension de pulvérisation ionique = -4 500 V en mode ion négatif et = +5 200 V en mode ion positif.
- Pour la co-analyse des eCB et des eiC, définissez les paramètres suivants: gaz rideau = 40 psi; température du chauffe-source = 550 °C; tension de pulvérisation ionique = -4 500 V en mode ion négatif et = +4 500 V en mode ion positif.
- Pour l’analyse PL, réglez le chauffage de la colonne à 45 °C et le débit à 200 μL/min et réglez le gradient suivant: min 0 = 40% B; min 3 = 40 % B; min 42 = 90 % B; min 43 = 99 % B; min 50 = 99 % B et min 52 = 40 % B. Réglez le volume d’injection à 10 μL.
- Pour l’analyse des eCB et des eiCs, réglez la température de la colonne à température ambiante et définissez le gradient suivant: min 0 = 20% B; min 1 = 20 % B; min 5 = 50 % B, min 12 = 50 % B; min 13 = 90 % B, min 17 = 90 % B; min 17,5 = 20 % B; min 20 = 20 % B. Régler le volume d’injection à 20 μL.
REMARQUE: Les conditions MRM peuvent varier d’une plate-forme instrumentale à l’autre, d’où la fragmentation et les conditions MRM doivent être déduites expérimentalement et les paramètres d’ionisation doivent être testés et ajustés si nécessaire afin d’obtenir une sensibilité et une sélectivité maximales.
- Effectuer une analyse par lots.
- Ouvrez build acquisition batch et remplissez les paramètres requis pour la description de l’exemple, l’emplacement dans le rack d’échantillons de l’échantillonneur automatique et la méthode d’acquisition (définie à l’étape 5.2).
- Incluez toujours des contrôles de qualité au début et à la fin de l’analyse et dans le lot. Après chaque 25 à 30 échantillons, inclure au moins trois courbes d’étalonnage dans le lot et inclure une étape de lavage avec un solvant de choix après chaque échantillon de contrôle de la qualité, courbe d’étalonnage et à la fin du lot d’échantillon.
- Transférer des échantillons obtenus à l’étape 4 dans des flacons de CL/SEP. Placez les échantillons dans les racks de chargement de l’échantillonneur automatique LC en fonction de la position définie dans le lot et chargez le rack d’échantillons dans l’échantillonneur automatique LC.
- Envoyez un lot et démarrez l’analyse de la file d’attente.
- Quantification des lipides
- Utilisez le logiciel commercial (p. ex., Analyst) et le module de quantification intégré pour la quantification des eCB et des eiCs et le logiciel commercial (p. ex., Multiquant) pour la quantification des PL.
REMARQUE: Le deuxième logiciel peut également être utilisé pour les eCB et les eiC, en particulier lorsqu’une norme interne est utilisée pour la quantification de plusieurs analytes. - Méthode de quantification Open Build et remplissez les paramètres des analytes, des normes internes, des transitions MRM et attribuez les normes internes aux analytes à quantifier (tableau 3). Réglez la hauteur de crête minimale sur 500 cps.
- Utiliser les critères suivants ou leur combinaison pour l’attribution de l’identité lipidique et la quantification ultérieure6 : correspondance du temps de rétention des analytes endogènes lipidiques avec les étalons d’étalonnage et/ou les étalons internes deutérés, le cas échéant ; l’appariement des fragments par fragmentation en mode ionique positif et négatif pour un m/z donné d’analytes lipidiques pour lesquels aucune norme n’est fournie; comportement d’élution des lipides dans des conditions de CL utilisées de manière similaire pour disséquer les structures isomériques et/ou isobares; et, le cas échéant, l’analyse LC/MS et MS/MS avec spectrométrie de masse à haute résolution, en utilisant des conditions LC similaires à celles de l’analyse ciblée (utilisant LC/MRM), pour identifier avec précision l’identité et le comportement d’élution des lipides endogènes d’intérêt18,19.
- Pour la validation de l’analyse des lots, utilisez les critères suivants : précision de la quantification ≤ ±20 % ; coefficient de régression ≥0,97 (idéalement ≥0,99).
REMARQUE: Suivez les directives pour le développement et la validation de méthodes bioanalytiques afin d’assurer une analyse fiable et reproductible des molécules cibles.
- Utilisez le logiciel commercial (p. ex., Analyst) et le module de quantification intégré pour la quantification des eCB et des eiCs et le logiciel commercial (p. ex., Multiquant) pour la quantification des PL.
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Representative Results
L’ensemble des protocoles décrits peut être combiné à différents niveaux d’une manière spécifique à l’objectif, comme le choix du modèle animal, la voie d’échantillonnage, la méthode d’extraction et le profilage (figure 1).
Afin de déterminer les changements du taux de lipides dans le cerveau et la périphérie au cours d’un état épileptique aigu et de démêler l’effet antiépileptique potentiel13 du PEA et son impact sur les changements lipidomatiques dans le cerveau et la périphérie, trois groupes d’animaux expérimentaux ont été traités avec véhicule, KA pour induire l’épilepsie aiguë et PEA comme candidat médicament antiépileptique. Le PEA a été administré par i.p. avant l’injection de KA (par exemple, avec une seule injection de PEA pour le traitement aigu et deux injections de PEA pour le traitement subchronique). Aux fins de l’analyse moléculaire multiple et/ou de la coloration immunohistochimique 5 jours après le traitement, les expériences sur les animaux ont été répétées au besoin (Figure 2).
L’induction KA des crises d’épilepsie aiguë conduit à une intensité de crise maximale 1 h après l’injection15 (Figure 3). Pour démêler les changements du niveau de lipides cérébraux et périphériques à l’état d’intensité maximale des crises, les souris ont été sacrifiées 1 h après l’injection de KA, suivies d’un prélèvement de plasma, de cerveau et d’organes périphériques. Les cerveaux gelés ont été disséqués dans six régions du cerveau (voir l’étape 3.1). Les régions du cerveau et les tissus des organes périphériques (cœur et poumon) ont été pulvérisés pour obtenir des échantillons de tissus homogènes, puis alicités pour les deux profils lipidomiques des eCB et des eiC (figure 4A et étape 4.1.1) et des PL et eCB (figure 4B et étape 4.1.3).
Le protocole de double extraction (voir étape 4.1.5) a été appliqué pour effectuer des PL/eCB et de l’ARN à une résolution spatiale plus élevée via le profilage à partir de poinçons cérébraux dans différentes régions : l’hypothalamus (HYP), l’amygdale basolatérale (BLA) et l’hippocampe ventral (vHC) et dorsal (dHC) (Figure 5). Des poinçons ont été prélevés (voir étape 3.2) sur des souris épileptiques induites par l’AC et des souris témoins à l’état épileptique maximal à 1 h après l’injection d’AC (figure 2).
Pour évaluer l’étendue de la neurodégénérescence et attribuer des changements lipidiques à l’étendue de la neurodégénérescence avec épilepsie et lors d’un nouveau traitement de l’épilepsie par PEA, une double coloration immunohistochimique a été effectuée sur des coupes cérébrales (voir étape 1.3) échantillonnées 5 jours après les crises d’épilepsie induites par KA (Figure 2) chez des souris sans traitement subchronique par PEA (au milieu), avec un traitement subchronique au PEA (à droite) et chez des souris injectées dans une solution saline (à gauche) (Figure 6 ). L’état de mal épileptique (SE) induit par l’KA a causé une perte massive du signal NeuN, principalement dans la région CA1, CA3 et hilus de l’hippocampe, accompagnée d’événements apoptotiques indiqués par le signal caspase-3 (CASP3) (Figure 6, image du milieu) par rapport au témoin (Figure 6, image de gauche). Le traitement subchronique PEA (image de droite) a notamment préservé le signal de la protéine des noyaux neuronaux (NeuN), tandis que le signal (CASP3) est à peine détectable.
| Solution injectable de KA et de SAL. |
| Solution injectable de KA (volume final de 8 mL) : |
| 1. Peser 24 mg de KA dans un tube de 15 mL (attention : portez des glothes et un masque) |
| 2. Ajouter 8 mL de solution saline et vortex pendant 10 min |
| 3. Conserver à 4 °C pour le stockage intermdediate |
| 4. Reconditionnement à la température ambiante et au vortex avant l’injection |
| Solution injectable pour véhicule 1 (volume final de 8 mL): |
| Sautez l’étape 1 et passez aux étapes 2 à 4 |
Tableau 1 : Préparation du médicament induisant des crises et application du véhicule 1. Étapes de préparation de la solution injectable d’acide kaïnique (KA) pour 24 injections intrapéritonéales (10 mL/kg) à une concentration finale de 30 mg/kg et la solution d’injection pour véhicule correspondante (véhicule 1)1.
| Solution injectable de PEA et SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v) ). |
| Solution injectable de PEA (volume final de 8 mL) : |
| 1. Peser 32 mg de PEA dans un tube de 15 mL |
| 2. Ajouter 0,4 mL de DMSO et vortex pendant 10 min |
| 3. Ajouter 3,4 mL sal et vortex pendant 5 min |
| 4. Mélange sonique pendant 5 min à 36°C |
| 5. Ajouter 0,4 mL de crémophore et vortex pendant 5 min |
| 6. Sonicate pendant 1 min à 36°C et ajouter 3,4 mL de SAL |
| 7. Vortex pendant 30 secondes et sonicate pendant 3 min à 36°C |
| 8. Conserver la solution à 36 °C à basse vitesse dans l’agitateur et le vortex avant l’injection |
| Solution injectable pour véhicule 2 (volume final de 8 mL): |
| Sautez l’étape 1 et passez aux étapes 2 à 8 |
Tableau 2 : Préparation du médicament antiépileptique et application du véhicule 2. Étapes illustrées pour préparer la solution injectable de palmitoyléthanolamide (PEA) pour 24 injections intrapéritonéales (10 mL/kg) à une concentration finale de 40 mg/kg et la solution d’injection pour véhicule correspondante (véhicule 2)1.
| Mode ionique positif | ||||||
| Étalons d’étalonnage sélectionnés PL | Normes internes correspondantes | |||||
| Analyte | Ion précurseur | Ion de produit m/z | Analyte | Ion précurseur | Ion de produit m/z | |
| nom | m/z | nom | m/z | |||
| AEA | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| L’OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| POIS | 300.2 | 62.1 | PEA-d4 | 304.2 | 62.1 | |
| PC 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | PC 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| PC 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| PC 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| PLC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| Mode ion négatif | ||||||
| Étalons d’étalonnage sélectionnés PL | Normes internes correspondantes | |||||
| Analyte | Ion précurseur m/z | Ion de produit m/z | Analyte | Ion précurseur | Ion de produit m/z | |
| nom | nom | m/z | ||||
| AA | 303.05 | 259.1 | AA-d8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-HETE | 319.48 | 115 | 5(S)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-HETE | 319.48 | 155 | 12(S)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(S)-HETE | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20-HETE | 319.48 | 289 | 20-HETE-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| DPI2 | 351.47 | 315.3 | DPI2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PS 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | PS 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| PS 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| PS 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
Tableau 3 : Normes lipidiques et transitions MRM pour l’analyse lipidomique ciblée. Le contenu du tableau a été publié à l’origine dans Lerner et al.2
Figure 1 : Vue d’ensemble des modules de flux de travail. En fonction de l’objectif de l’étude et des différentes voies d’échantillonnage, d’extraction et de profilage peuvent être combinés pour permettre un résultat significatif pour l’étude. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Conception expérimentale du modèle de crise d’épilepsie aiguë induite par l’acide kaïnique (KA) chez la souris. Les souris sont soit traitées avec 1) solution saline (10 mL/kg de p.i.); 2) KA (30 mg/kg d’AP); et/ou 3) (sub) prétraitée chroniquement (1−2x 40 mg/kg i.p.) avec le composé antiépileptique potentiel Palmitoylethanolamide (PEA). Vingt-quatre souris par groupe ont été traitées comme ci-dessus et le comportement a été noté pour évaluer l’intensité des crises. Six souris par groupe ont été sacrifiées à chacun des quatre points temporels différents (T1−T4) pour déterminer les changements du taux de lipides au cours d’une période de crise d’épilepsie aiguë dans le cerveau, les organes périphériques et le plasma. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Notation comportementale sur une évolution temporelle de l’épilepsie aiguë induite par l’acide kainique (KA) par rapport aux témoins. Évaluation de l’intensité des crises sur une période de 180 minutes après l’induction de la crise KA (n = 24) ou l’injection de solution saline (n = 24) donnée comme scores comportementaux moyens. Aucune différence n’a été constatée entre les groupes injectés du véhicule 1 et du véhicule 2. Barres d’erreur = SEM. Les mesures répétées de l’ANOVA ont donné des interactions significatives entre les points temporels des mesures et les groupes de test, indiquant des effets significatifs du traitement KA sur les scores comportementaux. Les intensités de crise des souris traitées par KA ont été publiées à l’origine dans Post et al.13Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Taux de lipides du cerveau et des tissus périphériques à l’état épileptique aigu. Les changements du taux de lipides présentés comme une valeur moyenne ± SEM à l’intensité maximale de la crise (p. ex., 1 h après l’injection de KA) dans six régions du cerveau (n = 9) : cortex cérébral (cCTX), striatum (STR), région thalamique (THL), hippocampe (HC), hypothalamus (HYP), cervelet (CER), ainsi que tissu cardiaque et pulmonaire chez les souris épileptiques induites par KA (valeur supérieure) et les témoins (valeur inférieure). Les taux de lipides basaux dans les tissus sont représentés en gris. Les valeurs des PL, 2-AG et AA sont données en nmol/g. et les valeurs des NAE, eiCs et AEA en pmol/g, respectivement. Tous les niveaux de lipides sont normalisés au poids des tissus. Pour mettre en évidence les changements moléculaires spécifiques, les taux de lipides des souris traitées par KA sont représentés en pourcentage de la solution saline injectée (KA / sal) dans une carte thermique affichant des valeurs diminuées à l’intensité de crise aiguë par rapport au témoin sont représentés en bleu clair et les niveaux accrus par rapport au contrôle en rouge, respectivement. Ils sont considérés comme significatifs à une valeur p <0,05. Ces données ont été publiées à l’origine dans Lerner et al.2Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Double extraction des eCB/PL et de l’ARN pour le profilage quantitatif des coups de poing cérébraux de souris. (A) Distribution quantitative de PL et d’eCB sélectionnés dans : 1) une sous-région de l’hypothalamus (HYP) ; 2) l’amygdale basolatérale (BLA); et 3) les sous-régions ventrales (vHC) et dorsales (dHC) de l’hippocampe, des souris épileptiques induites par l’AC (valeur supérieure) par rapport aux témoins (valeur inférieure) (n = 10). Les concentrations sont normalisées en fonction du poids tissulaire (les poinçons correspondent à environ 0,5−1,5 mg) et exprimées en nmol/g. Seule l’AEA est exprimée en pmol/g. Les taux de lipides sont présentés comme une valeur moyenne ± SEM. La variation moyenne par région cérébrale perforée (SEM en pourcentage de la moyenne, moyenne sur l’ensemble des lipides) est: HYP = 7,83%; BLA = 7,80 %; vHC = 6,28 %; et dHC = 7,90 %, respectivement. (B) Niveaux d’expression relatifs des enzymes et des récepteurs endogènes impliqués dans la signalisation lipidique, ainsi que des marqueurs de l’activité cérébrale étudiés au niveau de l’ARNm dans différentes régions/sous-régions du cerveau chez des souris soumises à une crise d’épilepsie induite par KA (rouge) et des témoins (gris clair). Des analyses statistiques de la différence entre les moyennes de groupe ont été effectuées à l’aide du test t de Student non apparié à deux queues et considérées comme significatives à une valeur p <0,05 (n = 10). Ces données ont été publiées à l’origine dans Lerner et al.7Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : NeuN immunohistochimique et double coloration CASP3. Cinq jours après l’injection de KA, l’immunohistochimie a été réalisée sur des coupes cérébrales de souris non traitées injectées de solution saline (à gauche), de souris prétraitées par PEA subchroniquement (au milieu) et de souris épileptiques sans prétraitement (à droite). Le prétraitement au PEA montre des effets neuroprotecteurs par rapport aux souris épileptiques non traitées (n = 3). Ces données ont été publiées à l’origine dans Post et. al.13Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthodologie neurolipidomique et transcriptomique décrite ici est un moyen viable d’étudier toute maladie ou développement sain à haute et basse résolution spatiale dans le cerveau et les organes périphériques. Grâce aux procédures optimisées d’échantillonnage et de manipulation du plasma, l’analyse lipidomique plasmatique peut également être effectuée à partir des mêmes animaux sacrifiés pour la lipidomique tissulaire et la transcriptomique, améliorant ainsi la fiabilité des corrélats moléculaires du sang tissulaire et de la découverte de biomarqueurs. La fourniture d’un large ensemble de données par application de l’un ou l’autre des trois protocoles ou de combinaisons de ceux-ci est utile pour étudier non seulement une maladie neurologique dans un contexte (expérience sur un modèle animal), mais aussi à travers et entre les contextes de modèles expérimentaux. De plus, un haut niveau de normalisation de l’échantillonnage, du traitement et de l’analyse moléculaire facilite une reproductibilité élevée des données moléculaires, référençant ainsi de manière fiable les changements moléculaires entre et au sein des études et des laboratoires.
Cependant, pour y parvenir, la mise en place d’un plan expérimental offrant le potentiel de lecture maximal pour l’objectif de l’étude défini est essentielle. Pour obtenir une comparaison fiable des changements moléculaires entre les groupes expérimentaux, il est recommandé d’utiliser un minimum de dix animaux pour compenser la variabilité animale et la gamme biologique des niveaux de lipides. Lorsque l’approvisionnement en animaux et/ou la logistique de la manipulation des animaux sont restrictifs, l’utilisation d’un minimum de six animaux par groupe est impérative pour permettre une analyse statistique fiable. Les calculs de la taille des groupes doivent compenser les taux de mortalité liés au modèle (c.-à-d. un minimum de six, idéalement dix, animaux par groupe sont requis pour l’étude malgré le taux de mortalité possible du modèle). Une condition essentielle est de s’assurer que les animaux correspondent à l’âge, au sexe et à la souche par groupe expérimental. Pour la phase de découverte, il est essentiel d’utiliser le même fournisseur pour les animaux d’expérimentation pour toutes les études et le même lot animal si possible, afin d’éviter le biais des résultats en raison d’éventuelles différences de phénotype comportemental et moléculaire entre les lots d’animaux. Pour assurer la fiabilité et la reproductibilité du phénotype moléculaire et comportemental déterminé dans les études, il est essentiel d’effectuer une analyse de réplication biologique dans la mesure du possible.
Une autre étape cruciale consiste à mettre en place un travail expérimental standardisé et programmé avec des groupes d’animaux. Il est impératif de traiter les animaux dans la même fenêtre horaire de la journée pour contourner la variabilité moléculaire circadienne. L’heure de la journée doit être fixée en fonction de l’impact connu du rythme circadien sur la synthèse et la dégradation des molécules cibles ou maintenue cohérente pour tous les groupes expérimentaux lorsqu’aucune information sur les effets du rythme circadien n’est disponible. De même, les conditions de logement et d’alimentation avant le sacrifice des animaux doivent être maintenues cohérentes et strictement contrôlées dans tous les modèles expérimentaux. Ceci est particulièrement pertinent pour le profilage lipidomique en raison de l’influence de la nutrition sur le métabolisme du plasma lipidique et des tissus. L’administration de médicaments thérapeutiques ou pathogènes doit invariablement être effectuée parallèlement à l’administration du véhicule dans des groupes témoins, le véhicule devant être le même que celui utilisé pour l’administration du médicament. Afin de choisir la souche et/ou les sous-souches de rongeurs les plus appropriées aux fins de l’étude, les stratégies de traitement médicamenteuses doivent être mises en œuvre en fonction de la spécificité du médicament en termes de temps et de fréquence d’administration, de doses et de voie d’administration, et des susceptibilités spécifiques aux médicaments de différentes souches déduites de la littérature et/ou de l’expérience antérieure. Une enquête temporelle d’une maladie et d’une réponse au traitement impliquant de grands groupes de cohortes ou plusieurs groupes d’animaux est impossible à effectuer en une journée en termes de traitement, de sacrifice et d’échantillonnage. Dans de tels cas, le traitement des groupes d’animaux doit être programmé et effectué en jours consécutifs, mais en maintenant les mêmes conditions en termes d’heure de la journée, de conception expérimentale, de temps de traitement, de chercheurs, etc. La préparation des injections chimiques est une autre étape critique. Les composés pathogènes ou pathogènes doivent être fraîchement préparés avant l’administration et conformément aux spécifications du médicament. L’utilisation du même lot de production du médicament est recommandée pour toutes les cohortes à comparer. Ceci est particulièrement important dans le cas de formulations de composés naturels tels que l’acide kaïnique (KA) utilisé dans cette étude pour l’induction de l’épilepsie.
Pour permettre un profilage lipidomique et/ou transcriptomique fiable, la procédure de sacrifice d’animaux doit être effectuée de manière cohérente dans tous les groupes d’animaux dans un délai de 5 minutes. Si le sang est recueilli après la décapitation, il est important de maintenir une quantité constante d’isoflurane dans la chambre de verre. À cette fin, tremper fréquemment (après cinq utilisations) avec de l’isoflurane et ne pas dépasser 10 s pendant la durée de l’anesthésie à l’aide d’isoflurane, afin d’éviter l’apparition d’arythmie et de palpitations et d’assurer une pression artérielle appropriée pour le prélèvement plasmatique.
Les conditions d’échantillonnage et de manipulation du matériel biologique (p. ex., la fenêtre temporelle et l’ordre d’échantillonnage et de manipulation du matériel biologique) doivent être strictement respectées et maintenues identiques pour tous les groupes. Pour éviter des degrés variables de décongélation tissulaire et donc des changements tissulaires ex vivo incohérents des niveaux de lipides et/ou d’ARNm, il est essentiel de maintenir des conditions de temps et de température strictement contrôlées pour le post-échantillonnage.
stockage. dissection ou poinçonnage tissulaire, et traitement et analyse ultérieurs des échantillons (voir rubriques 3 et 4). Les cerveaux entiers fraîchement échantillonnés peuvent être immédiatement disséqués sur une plaque métallique prérefroidie (4 °C) sans congélation préalable, si la taille des groupes d’animaux expérimentaux permet le sacrifice, l’enlèvement et la dissection d’animaux sans modifier le délai indiqué ici pour chacune de ces procédures. Si la taille des groupes expérimentaux n’est pas pratique pour ces procédures, la congélation instantanée du cerveau et la dissection ultérieure sont recommandées pour permettre un temps de traitement comparable et contrôlé. En suivant strictement les protocoles et les lignes directrices de chronologie indiqués ici, aucune divergence n’a été observée entre les niveaux moléculaires obtenus par extraction de régions cérébrales fraîchement disséquées et de régions cérébrales disséquées à partir de cerveaux gelés.
Un aspect critique pour atteindre une variabilité reproductible et minimale des niveaux de lipides au sein et entre les groupes, en dehors du traitement des échantillons dans des conditions de température strictement contrôlées, est la fourniture d’antioxydants (voir rubriques 2 et 3). Éviter tout facteur de stress (par exemple, l’odeur du sang) des animaux avant de se sacrifier est d’une importance primordiale, car de nombreux lipides impliqués dans l’activité neuronale tels que les eCB peuvent changer rapidement en réponse au stress.
Pour l’extraction et l’analyse des lipides, il est essentiel de préparer à nouveau les étalons internes, les solutions d’étalonnage et les solvants d’extraction le jour de l’extraction. La même source d’étalons internes doit être utilisée à la fois pour la préparation de la courbe d’étalonnage et pour les extractions d’échantillons. En outre, il est primordial de respecter des conditions de température strictement contrôlées pour l’extraction, le stockage et l’analyse des échantillons afin de minimiser et de contrôler les altérations enzymatiques ou chimiques ex vivo des molécules. Pour l’analyse LC/MRM, l’ensemble des lipides ciblés peut être adapté à l’objectif de l’étude en ajoutant ou en supprimant des cibles et des étalons internes et des calibrants correspondants, à condition que la séparation, la détection et les transitions MRM pour un nouvel ensemble de lipides soient optimisées. Les protocoles d’extraction présentés permettent de fournir deux réplications LC/MRM pour les eCB et les eiC, ce qui est déterminant pour les cas de défaillance technique ou lorsque l’analyse de réplication est importante pour l’étude. Les protocoles d’extraction PL rendent les quantités d’échantillons/extraits appropriées pour au moins 10 analyses par extrait (par exemple, plusieurs expériences de balayage basées sur l’ion précurseur et le balayage à perte neutre2, respectivement; analyses LC / MRM supplémentaires; ou répliques LC / MRM pour compenser une défaillance technique au cours d’une exécution). L’analyse des lipides ne se limite pas à la LC/MRM; en fait, les extraits lipidiques obtenus avec l’un de ces protocoles se prêtent à une analyse de spectrométrie de masse haut de gamme non ciblée. À l’exception des coups de poing cérébraux ou de la quantité infime de tissus obtenus à partir de régions discrètes (moins de 3 mg), les tissus pulvérisés congelés de régions supérieures à 2−3 mg peuvent être alicités et utilisés pour plusieurs modules d’extraction comme décrit ici pour l’analyse répliquée et / ou pour d’autres investigations susceptibles d’être utilisées dans de la poudre de tissu.
Un avantage général des protocoles décrits ici par rapport à ceux couramment utilisés est l’augmentation de l’efficacité globale en termes de temps et de sensibilité pour l’extraction et l’analyse multicomposées avec une réduction des dépenses en ressources animales, en consommables et en coûts d’analyse. Il est important de noter que le protocole d’extraction à double lipides/ARNm offre également une efficacité supérieure de l’extraction de l’ARNm20,21 et l’intégrité de l’ARNm par rapport aux protocoles standard disponibles correspondants, tout en augmentant simultanément l’efficacité de l’extraction des lipides7. Cela est probablement également dû à la diminution de l’effet de matrice pour chacune des fractions lipidiques et ARNm lors de l’extraction double. Pour cette raison, la méthode est facilement applicable pour le profilage à haute résolution spatiale, comme dans les coups de poing cérébraux.
Cependant, une limitation actuelle du protocole est que les lipides inflammatoires ne se prêtent pas à l’analyse et à la quantification à l’aide de la double extraction lipide/ARNm. Ainsi, le protocole est susceptible d’être affiné. À cette fin, les lipides inflammatoires tissulaires et plasmatiques et les endocannabinoïdes peuvent être co-extraits et co-analysés, ce qui est un outil optimisé pour étudier simultanément les processus neuroinflammatoires et l’activité neuronale modulée par les endocannabinoïdes (voir coextraction des EIC et des eCB). L’inclusion de phospholipides dans ce dernier essai devrait être réalisable.
Compte tenu des approches multi-omiques prospectives pour les maladies neurologiques, l’analyse protéomique des fractions protéiques obtenues après le protocole d’extraction des lipides (c.-à-d. la co-extraction des eCB et des EIC, ainsi que la co-extraction des PL et des eCB) devrait être réalisable. Cependant, cela n’est pas encore possible lors de l’utilisation du protocole double lipide/ARNm. Pour ces derniers, l’environnement chimique de l’extraction empêche même la détermination de la quantité de protéines à l’aide de tests protéiques standard tels que le test de l’acide bicinchoninique (BCA). D’autres développements visant à surmonter cette limitation et à accélérer l’inclusion du profilage protéomique dans ces protocoles sont prévus.
En utilisant le protocole modulaire décrit ici, il a été possible d’obtenir une carte régionale du cerveau des EIC, des eCB et des PL dans un modèle animal de crises d’épilepsie aiguës (Figure 4). Le protocole a montré la modulation hippocampique des processus inflammatoires par les EIC et de la modulation de l’activité neuronale par les eCB chez des souris traitées et non traitées présentant des crises aiguës induites par KA13. Une localisation sous-régionale du cerveau des changements de phospholipides, d’endocannabinoïdes et d’ARNm aux états épileptiques aigus, respectivement, a également été observée (figure 5). Ces résultats mettent en évidence la valeur et l’applicabilité des méthodes décrites ici pour faire progresser les connaissances sur un large spectre de lipides impliqués dans la modulation d’une maladie neurologique complexe telle que l’épilepsie dans les régions et sous-régions du cerveau. Ces protocoles sont d’application générale dans l’investigation des maladies neurologiques et au-delà, tandis que le développement des protocoles et des applications pour les populations cellulaires se poursuit.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous dédions cet article au Dr Ermelinda Lomazzo. Lors de la finalisation de ce manuscrit, le Dr Ermelinda Lomazzo est décédée. Elle est l’incarnation de la passion pour la science et de l’engagement désintéressé dans le travail d’équipe pour atteindre un objectif de recherche significatif. Elle a toujours rêvé de contribuer de manière significative au plus grand bien-être des humains. Sa nature bienveillante n’a jamais été compromise par les routes pénibles de la science et de la vie. Elle restera inestimable, et pour toujours, dans nos cœurs.
Julia M. Post a été financée par le programme Focus pour les neurosciences translationnelles (FTN) au Centre médical universitaire de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence et est actuellement financée par le projet SPP-2225 EXIT à LB. Raissa Lerner a été partiellement financée par le projet DZHK 81X2600250 à LB et Lipidomics Core Facility. Un financement partiel pour ces études a été fourni par le Lipidomics Core Facility, l’Institut de chimie physiologique et des fonds intra-muros (à LB) du Centre médical universitaire de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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