Summary
Este artigo apresenta um protocolo modular para lipidômica tecidual e transcriptômica, e lipidomias plasmáticas em modelos de camundongos de doenças neurológicas que visam lipídios subjacentes à inflamação e atividade neuronal, lipídios de membrana, mensageiros a jusante e enzimas/receptores de codificação de mRNA. São delineados procedimentos de amostragem, processamento de amostras, extração e quantificação.
Abstract
Os lipídios servem como a interface primária para insultos cerebrais ou estímulos propícios a doenças neurológicas e são um reservatório para a síntese de lipídios com várias sinalizações ou função de ligantes que podem ressaltar o aparecimento e progressão de doenças. Muitas vezes mudando no nível pré-attomático, lipídios são uma fonte emergente de alvos de drogas e biomarcadores. Muitas doenças neurológicas exibem neuroinflamação, neurodegeneração e excitabilidade neuronal como marcas comuns, parcialmente moduladas por sistemas específicos de sinalização lipídica. A interdependência e inter-relação da síntese de vários lipídios leva a uma análise multilímida, multinzimida e multirreceptora, a fim de derivar as semelhanças e especificidades dos contextos neurológicos e acelerar o desenrolar de aspectos mecanicistas do início e da progressão da doença. Atribuir papéis lipídes a regiões cerebrais distintas avança na determinação do fenótipo molecular lipídeto e da morfologia associados a uma doença neurológica.
Apresentado aqui é um protocolo modular adequado para a análise de lipídios de membrana e sinais lipídes a jusante, juntamente com mRNA de enzimas e mediadores subjacentes à sua funcionalidade, extraídos de regiões cerebrais discretas que são relevantes para uma determinada doença neurológica e/ou condição. Para garantir um perfil lipidômico comparativo preciso, os fluxos de trabalho e os critérios operacionais foram otimizados e padronizados para: i) amostragem cerebral e dissecção de regiões de interesse, ii) co-extração de múltiplos sinais lipídicos e lipídios de membrana, iii) extração lipídica/mRNA dupla, iv) quantificação por monitoramento de reação múltipla de cromatografia líquida (LC/MRM) e v) perfil de mRNA padrão. Este fluxo de trabalho é favorável às baixas quantidades teciduais obtidas pela amostragem das sub-regiões cerebrais funcionalmente discretas (ou seja, por perfuração cerebral), impedindo assim o viés na análise multimolecular devido à heterogeneidade tecidual e/ou variabilidade animal. Revelar consequências periféricas de doenças neurológicas e estabelecer leituras moleculares translacionais de estados de doenças neurológicas, amostragem de órgãos periféricos, processamento e sua análise lipidómica subsequente, bem como lipidómica plasmática, também são perseguidos e descritos. O protocolo é demonstrado em um modelo agudo de camundongos de epilepsia.
Introduction
Avanços recentes na função dos lipídios e seu papel no surgimento e progressão de doenças neurológicas abrem novos locais de pesquisa e desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e elucidação de mecanismos de doença1. Diferenças documentadas na composição lipídica em diferentes regiões cerebrais, enfatizadas por técnicas modernas de imagem molecular, como imagem de espectrometria de massa e perfil avançado de espectrometria de massa, muda o paradigma da investigação lipídica de todo o cérebro para regiões cerebrais funcionalmente distintas e discretas. O fato de que a composição lipídica varia em diferentes regiões cerebrais leva a nova conceituação tanto da sensibilidade lipídica da membrana quanto da sinalização lipídica a jusante em resposta a um insulto cerebral ou estímulos através das regiões cerebrais funcionalmente distintas. Assim, os protocolos lipídes exigem novos desenvolvimentos para enfrentar o desafio de baixas quantidades teciduais para maior detecção e quantificação de resolução espacial, e, simultaneamente, análise de múltiplos componentes lipídides de membranas celulares e vias de sinalização. Além disso, a determinação de enzimas, ligantes lipídicos e receptores envolvidos na regulação de seus níveis e funções é primordial para elucidar as vias de sinalização afetadas em uma doença neurológica e orientar novas investigações mecanicistas em um contexto fisioterológico.
Além do aumento da resolução espacial cerebral, há duas grandes dificuldades que desafiam o desenvolvimento de novas abordagens neurolipdómicas. Primeiro, as moléculas de sinalização lipídica são tipicamente de baixa abundância em comparação com lipídios constitutivos de membrana. Em segundo lugar, o lipidome apresenta uma alta heterogeneidade estrutural, difícil de dissecar usando uma única abordagem analítica. Assim, os métodos de extração e analítica são adaptados a diferentes categorias lipídicas e comumente realizados em amostras de tecidos distintos2. Métodos lipídmicos de espingarda3 são excelentes ferramentas para revelar rapidamente um amplo perfil de lipídios de membrana, enquanto o aumento da sensibilidade e seletividade proporcionados pela descoberta e quantificação de massa spectrométricas são capitalizados para a investigação de lipídios de sinalização de baixa oferta, incluindo: i) lipídios inflamatórios e ii) lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como endocanabinóides (eCBs), lipídios ligados a amino- etc.4,5. Para abranger alterações lipídicas tanto na membrana celular quanto no nível de sinalização ocorrendo em regiões cerebrais de modelos de doenças neurológicas, tipicamente a extração e análise lipídica são realizadas em amostras de tecidos distintos, obtidas de diferentes lotes animais ou de diferentes hemisférios, ou dissecando uma região de tecido maior em múltiplos pedaços. Quando os níveis de mRNA de receptores enzimáticos também são de interesse, sua investigação normalmente requer a aquisição de uma amostra de tecido distinta. Por exemplo, a investigação de lipídios de membrana, canabinoides endógenos e mRNA exigiria três amostras diferentes de tecido, (por exemplo, duas amostras para os dois métodos de extração lipídica-lipídios-lipídios e lipídios de sinalização - e subsequentes dois métodos de análise lipídica - e uma amostra para análise mRNA). A investigação de lipídios inflamatórios e canabinoides endógenos requerem duas amostras de tecido distintas, métodos de extração e métodos de análise, respectivamente. Outro exemplo é a investigação de mRNA e de qualquer categoria lipídica em uma amostra de perfuração cerebral ou microdissecção a laser que, consequentemente, requer dois animais distintos para obter duas amostras por cérebro (sub)região. Uma extensão substancial de variabilidade e/ou baixa reprodutibilidade dos resultados ocorre frequentemente nesses casos, originária de variabilidade biológica e/ou heterogeneidade tecidual. Guiado por essas limitações práticas da análise multimolecular, ocorrendo particularmente em alta resolução espacial no cérebro, foi projetado um protocolo de neurolipidomia de três módulos englobando: 1) coextração e co-análise por LC/MRM de lipídios inflamatórios (por exemplo, eicosanoides (EI)) e lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como eCBs2; 2) co-extração de fosfolipídios (PLs) e eCBs com análise subsequente de LC/MRM multiscan e análise de varredura de perdas precursoras/neutras2; e 3) extração dupla de membrana (fosfo)lipídios e eCBs, bem como mRNA, com análise subsequente de sequenciamento de LC/MRM e qPCR ou RNA6. Dependendo da questão biológica a ser abordada em uma doença neurológica e na região de interesse cerebral, uma combinação do primeiro e do segundo protocolo, ou o primeiro e o terceiro protocolo, podem ser aplicados na mesma amostra de tecido para tecidos que pesam cerca de 4 mg. O primeiro e o terceiro protocolos podem ser aplicados independentemente para tecidos em torno de 2 mgs. O segundo protocolo pode ser aplicado para tecidos pesando apenas 0,5 mgs. Independentemente do módulo de protocolo neurolipdidomático selecionado, a amostragem de tecidos e processamento pré-analítico, o isolamento cerebral e a dissecção da região, bem como o procedimento para o sacrifício do modelo animal são padronizados e idênticos para os três módulos do protocolo. Em nossa investigação de doenças neurológicas, órgãos periféricos relevantes para as consequências patológicas da doença também são sempre coletados e analisados por meio desses protocolos modulares. Além disso, o sangue é regularmente amostrado para lipidomia plasmática para servir como uma ferramenta de leitura de doenças neurológicas com uma visão sobre aplicações translacionais prospectivas. O protocolo de lipidomia modular aqui apresentado é muito versátil: escalável a maiores quantidades de tecido e facilmente aplicável para praticamente qualquer tipo de tecido e doença. Para a aplicação do protocolo modular (Figura 1), em doenças neurológicas, qualquer modelo padronizado de início e progressão de distúrbios neurológicos, como lesão cerebral traumática, doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou epilepsia são amenáveis.
Esses protocolos têm sido extensivamente aplicados para estudar alterações no lipidome tecidual e/ou transcriptome na fase aguda da epilepsia no modelo de camundongo induzido por ácido kainico (KA) de epilepsia2,7, um modelo amplamente utilizado em estudos pré-clínicos devido à semelhança com a epilepsia do lobo temporal humano (TLE)8,9,10,11. Utilizando esses protocolos, o potencial terapêutico de drogas como Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 foi avaliado no mesmo modelo de camundongos de epilepsia. O estudo identificou alterações lipídicas e mRNA em alta e baixa resolução espacial no cérebro e na periferia, no ponto de tempo de intensidades máximas agudas de convulsão aguda (em 60 min de indução pós-doutorado), e sobre o tratamento subcrônico e agudo com PEA em quatro pontos de tempo diferentes (20, 60, 120 e 180 min) pós-indução de convulsão ka, uma janela de tempo cobrindo a fase aguda de epilepsia. Foram coletados em cada momento os camundongos injetados por KA, camundongos tratados com PEA, agudos e subchamados, bem como camundongos de controle de veículos e veículos pea, coletados em cada ponto12,13, e investigados com essa análise molecular. Os dados moleculares foram correlacionados com fenótipos comportamentais obtidos pela pontuação de convulsões, bem como com dados derivados da imunohistoquímica em processos neurodegenerative, a fim de desvendar a progressão da fase aguda de epilepsia e o potencial do PEA para aliviá-lo.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais aqui descritos estão de acordo com a Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia de 22 de Setembro de 2010 (2010/63EU) e foram aprovados pelo comitê local de animais da Renânia-Palatinado do estado da Alemanha (referência de arquivo: 23 177-07/G16-1-075).
1. Modelo animal de epilepsia induzida por KA aguda e profilaticamente tratada
- Realizar indução de convulsão, tratamento e pontuação comportamental.
- Camundongos separados (n mínimo = 6 ratos por grupo) em gaiolas simples.
- Prepare a solução de injeção de indução de convulsão e o veículo correspondente (ver Tabela 1), bem como a solução de injeção de tratamento e o veículo correspondente (ver Tabela 2).
- Injete camundongos intraperitoneal (i.p.) (massa corporal de camundongos de 10 mL/kg) sem anestesia de acordo com sua identidade de grupo: doença, tratamento ou veículo tratado (ou seja, KA, KA tratado com PEA e os dois grupos de veículos). Veja Figura 2, Tabela 1 e Tabela 2.
- Monitorar e pontuar o comportamento de acordo com a seguinte escala padronizada de intensidade de convulsão: 0 = nenhuma resposta; 1 = imobilidade e olhar; 2 = extensão de membro dianteiro e/ou cauda, postura rígida; 3 = movimentos repetitivos, balançando a cabeça; 4 = criação e queda; 5 = criação contínua e queda; 6 = convulsões clonic-tônicas graves; 7 = óbito14,15 (Figura 3).
- Realizar procedimento de sacrifício para análise lipódica e transcriômica.
- Em quatro momentos (ou seja, 20, 60, 120 e 180 min pós ka- ou injeção de veículo, respectivamente), sacrificar seis camundongos de cada um dos seguintes grupos: PEA tratado, veículo epiléptico não tratado de PEA e veículo 2, seguindo protocolos aprovados pela IACUC.
- Dez segundos após cada ponto de tempo ser atingido, anestesia os ratos usando um tecido encharcado de isoflurano em uma câmara de vidro. Confirme a anestesia pela perda do reflexo de direito, indicado pela incapacidade de se mover enquanto lentamente derruba a câmara de vidro. Decapitar camundongos usando tesouras cirúrgicas e coletar órgãos plasmádricas, cerebrais e periféricos (ver passos 2.2.2−2.2.4).
ATENÇÃO: As normas éticas para o sacrifício de procedimentos variam entre os comitês locais de animais. Certifique-se de verificar e seguir as normas emitidas pelo comitê local de animais.
- Siga o procedimento de sacrifício para análise imunohistoquímica.
- Para coloração imunohistoquímica13, escore comportamentalmente três camundongos de cada um dos seguintes grupos: TRATADO COM ERVILHA, epilepsia não tratada de ERVILHA e grupos de veículos, durante todo o curso de tempo (180 min).
- Sacrifício e persuso ratos 5 dias depois. Camundongos profundamente anestesiados (ver passo 1.3.1 para os grupos de camundongos) por injeção de i.p. de pentobarbital (100 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) como drogas entorpecentes. Confirme anestesia profunda pela perda de reflexo entre os dedo dos dedo.
- Fixar o mouse em uma placa de poliestireno e abra imediatamente o tórax usando tesouras finas e fórceps padrão. Coloque a borboleta no ventrículo do coração esquerdo e corte o átrio direito usando uma tesoura fina.
- Ajuste a velocidade e a pressão da bomba para um fluxo peristáltico constante com uma taxa de 2-3 mL/min. Perfuse com salina tamponada de fosfato gelado (PBS) por ~5 min. Se necessário, substitua a borboleta.
NOTA: Com a perfusão adequada, os órgãos internos (exceto o baço) começam a clarear dentro de 1-2 min. - Troque a perfusão para a solução de paraformaldeído (PFA) por ~5 min. Isole cérebros inteiros como descrito na etapa 2.2.2 e fixe por 24 h em solução PFA de 4% a 4 °C.
- Incubar cérebros em solução de sacarose de 30% por 48 h a 4 °C. Remova a sacarose restante com um papel de tecido seco e congele o cérebro em uma placa de metal (-80 °C). Armazene os cérebros a -80 °C para os procedimentos de coloração13.
2. Procedimentos amostrais para análise lipódica/transcriômica
- Preparem-se para a amostragem.
- Tubos EDTA pré-cozidos para amostragem de plasma a 4 °C. Pré-, pré-cure o aparelho centrífuga e vórtice a 4 °C. Pré-consulte a placa metálica coberta com papel alumínio (para quebrar cérebro congelado e/ou outros tecidos de interesse) em gelo seco (-80 °C). Pré-doença os tubos rotulados de 2 mL e 5 mL em gelo seco (-80 °C) para alíquotas de plasma, tecido congelado e coleta cerebral, respectivamente. Use tubos âmbar para proteger moléculas sensíveis à luz, como os EICs.
- Limpe o equipamento de amostragem e isolamento de tecidos (tesoura cirúrgica, tesoura fina e reta, fórceps lisos e lisos, fórceps finos com acabamento espelho, fórceps e espátula curvas, placa de espuma de poliestireno e agulhas para fixação) com um desinfetante (por exemplo, 70% de etanol).
- Protocolos de amostragem
- Determine a ordem de amostragem.
- Coletar sangue imediatamente após a decapitação em tubos EDTA pré-cozidos de 1 mL (ver passo 2.2.3).
- Remova todo o cérebro e estoize imediatamente após a remoção. Este passo levará 1-2 min. Armazene cérebros congelados a -80 °C para processamento posterior (ver etapa 2.2.2).
- Remova órgãos periféricos de interesse (por exemplo, pulmão, coração, fígado), dentro de 5 minutos após a remoção cerebral, e congele e armazene a -80 °C para processamento posterior (ver passo 2.2.4).
- Remova o cérebro para dissecção ou procedimentos de perfuração. Este procedimento leva 1-2 min/cérebro.
- Após a decapitação (ver passo 1.2), comece a fazer uma incisão midline na pele usando uma tesoura fina. Liberte o crânio virando a pele sobre os olhos. Alcance o topo do crânio e faça uma pequena incisão caudal começando ao nível do osso intraparietal. Evite cortar o cérebro.
- Corte firmemente através da parte mais anterior do crânio entre os olhos para facilitar a remoção cerebral. Incline um lado do osso parietal usando fórceps de padrão estreito curvo e roma. Repita o último passo para o outro lado.
- Remova as meninges cerebrais. Deslize uma espátula sob a parte anterior do cérebro (ou seja, a lâmpada olfativa) e incline o cérebro suavemente para cima. Deslize a espátula mais para baixo para quebrar a óptica e outros nervos cranianos.
- Levante o cérebro do crânio e encaixe congelar todo o cérebro imediatamente em uma placa de metal pré-córquica (-80 °C) com o lado ventral voltado para a placa metálica (dorsal para cima).
- Permita que os cérebros congelem completamente e transfiram em tubos pré-cozidos de 5 mL e armazene a -80 °C até a dissecação das regiões cerebrais ou o procedimento de perfuração (ver passos 3.1. e 3.2).
- Realize a amostragem de plasma.
- Pico pré-cozido EDTA-tubos com 10 μL de indometacina-diluição recém-preparada para uma concentração alvo de 10 μM.
- Colete o sangue do tronco imediatamente após a decapitação, apertando suavemente o corpo em tubos EDTA pré-cozidos a um volume máximo de sangue de 1 mL.
NOTA: Em caso de pressão arterial adequada, não é necessário apertar. Se o volume sanguíneo for inferior a 1 mL, diminua o tempo de incubação de isoflurane para permitir o fluxo sanguíneo adequado. - Imediatamente centrifugar tubos sanguíneos a 2.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Remova a fase plasmática superior resultante e com a finalidade de análise multilímida aliquot volumes de plasma definidos em tubos pré-cozidos de 2 mL da seguinte forma: 50 μL para análise de eCBs/eiCs, 30 μL para análise de PLs e o volume de plasma restante como a amostra de backup ou para outros tipos de análise.
- Armazene as amostras de plasma a -80 °C para extração posterior (ver etapas 4.1.2 e 4.1.4).
- Realizar amostragem periférica de órgãos.
NOTA: Use referências de anatomia do camundongo16 e documentação prevista para os cursos obrigatórios (FELASA) com a presença de pesquisadores de animais para identificar os órgãos individuais, seus tecidos conjuntivos e/ou vasos sanguíneos.- Imobilize o tronco do rato para facilitar a remoção dos órgãos usando agulhas. Faça uma incisão de linha média ventral usando uma tesoura afiada na altura do púbis. Use fórceps padrão contundentes para fixar a parede abdominal enquanto corta para abrir a cavidade abdominal.
- Imobilize a pele para permitir a remoção de órgãos abdominais usando fórceps contundentes. Para a remoção do coração ou pulmão, continue o corte medial na direção da caverna do peito. Remova o pulmão e/ou o coração usando fórceps finos.
- Abra a cavidade do peito cuidadosamente para evitar sangramento. Corte os tecidos conjuntivos e vasos sanguíneos ancorando o respectivo órgão sem cortar através do órgão.
- Transfira imediatamente peças de tecido em placas metálicas pré-identificadas (-80 °C) e deixe congelar completamente. Transfira peças de tecido para tubos pré-cozidos e armazene a -80 °C para processamento posterior (ver etapa 4.1).
- Determine a ordem de amostragem.
3. Processamento de material biológico
NOTA: Para a co-extração de eCBs/eiCs use tubos âmbar de 2 mL como tubos de extração e adicione em cada tubo sete bolas de aço pré-cozidos. Para a co-extração de PLs/eCBs e para dupla extração lipídica e RNA, utilize 2 mL de tubos de extração sem RNAse cravados com contas de cerâmica (Tabela de Materiais).
- Realizar dissecção cerebral e processamento de órgãos periféricos.
NOTA: Use lâmpadas de ampliação para aumentar a visibilidade do cérebro para dissecção.- Limpe as ferramentas cirúrgicas, incluindo os fórceps com pontas super finas, 2x com 70% de etanol.
- Transfira os cérebros congelados de -80 °C para uma placa de Petri contendo tampão fisiológico pré-cozido (pH 5.5) Certifique-se de que a placa de Petri está a 4 °C. Permita que os cérebros descongelem completamente para permitir a dissecção. Teste cuidadosamente usando fórceps.
ATENÇÃO: Não mantenha os cérebros a 4 °C a mais do que o necessário para descongelar. - Pré-enrole uma placa metálica no gelo (4 °C) e cubra-a com tecidos molhados embebidos em tampão fisiológico gelado (pH 5.5) e transfira o cérebro com o lado ventral para cima cuidadosamente em uma placa de metal pré-cozido (4 °C) no gelo. Cubra-o com tecidos molhados embebidos em tampão fisiológico gelado (pH 5,5).
- Disseque regiões cerebrais dentro de um máximo de 5 minutos usando fórceps de ponta super finas. Comece com o hipotálamo (HYP) e gire o lado dorsal para continuar com o lado direito. Isolar o hipocampo (HCr), córtex pré-frontal (PFCr), estriato (STRr) e córtex cerebral (cCTXr). Em seguida, dissecar o lado esquerdo. Isolar o hipocampo (HCl), córtex pré-frontal (PFCl), estriatum (STRl) e córtex cerebral (cCTXl). Disseque o cerebelo e a região talâmica. Uso de referências anatômicas publicadas16,17 para identificação de região cerebral.
- Transfira cada peça dissecada diretamente em uma placa metálica pré-identificada coberta de papel alumínio (-80 °C). Permitir o congelamento e transferir as regiões cerebrais isoladas nos tubos de 2 mL pré-cozidos rotulados.
- Pulverize os pedaços de tecido usando um pulverizador de tecido (a -80 °C), evitando o descongelamento do tecido. Na sala fria, pó de tecido aliquot em tubos de extração rotulados e pré-cozidos contendo contas de cerâmica ou bolas de aço. Para a análise lipidômica/transcriômica dupla, pese as alíquotas de pó de tecido na sala fria. Para análise apenas lipidômica, escolha entre a normalização até o peso tecidual ou o teor de proteína. Para este último, prossiga ainda mais sem pesagem tecidual.
- Corte os tecidos do órgão periférico em pedaços com um peso máximo de 20 mgs. Prossiga com a pulverização tecidual como na etapa 3.1.6.
- Prossiga com a extração de amostras de tecido (ver etapas 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou armazenar tubos a -80 °C para extração posterior.
NOTA: A matriz cerebral também pode ser usada se o projeto do estudo permitir. No entanto, o método é mais adequado para um número discreto e limitado de regiões cerebrais, e não é prático dissecar e isolar todas as regiões cerebrais acima mencionadas dentro do prazo estabelecido.
- Faça socos cerebrais.
- Monte todo o cérebro congelado no sistema de montagem (Tabela de Materiais) no criostat. Ajuste a espessura para 50 μm e corte no modo de corte perto da região de interesse.
- Mancha de corte cerebral (18-20 μm) usando azul toluidina (0,1%-1%) como referência para localização da sub-região de interesse. Inspecione as fatias manchadas usando um microscópio para identificar as regiões de interesse a serem perfuradas. Use um atlas de rato como referência para encontrar as regiões anatômicas cerebrais apropriadas16. Leve socos com um diâmetro de 0,8−1,0 mm usando corers de amostra em tubos pré-cozidos.
- Pesar socos congelados na sala fria em tubos de extração de 2 mL pré-cozidos, com contas de cerâmica ou bolas de aço. Use tubos âmbar para eCBs e co-extração de EICs.
- Inicie a extração (ver etapas 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou armazene tubos a -80 °C para extração posterior.
- Realize o processamento de plasma.
- Coloque as amostras de plasma congelado no gelo (4 °C) e deixe-as descongelar (~20 min).
- Certifique-se de que o plasma está totalmente descongelado antes de iniciar a extração.
- Proceda com o procedimento de extração plasmática (ver etapas 4.1.2 ou 4.1.4).
NOTA: As amostras de plasma devem permanecer a -80 °C até a extração. Evite ciclos de descongelamento e recongelamento.
4. Procedimentos de extração
- Realize protocolos de co-extração lipídica líquido-líquido (LLE).
- Realize a co-extração de eCBs e EICs de pedaços cerebrais, socos ou amostras de pó de tecido.
NOTA: É necessária uma tubulação precisa durante todo o procedimento.- Coloque os tubos de extração contendo as amostras de tecido e sete bolas de aço no gelo (4 °C). Adicione 600 μL de MTBE gelado e 50 μL de ACN/H2O (1:1; v/v) contendo as normas internas. A concentração-alvo das normas internas no volume final para análise (50 μL) é a seguinte: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 e 5 ng/mL para PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 e TXB2-d4, respectivamente.
- Adicione 400 μL de ácido fórmico de 0,1 M e homogeneize com um liser tecidual (30 s-1 min). Centrifugar o homogeneizar por 15 min a 5.000 x g a 4 °C. Permita o congelamento da fase inferior aquosa por 10 min a -80 °C para facilitar a transferência da fase orgânica superior.
- Transfira a fase orgânica em novos tubos. Evaporar sob um fluxo suave de N2 a 37 °C e reconstituir em 50 μL de ACN/H2O (1:1; v/v) para análise posterior.
- Armazene a fase aquosa a -20 °C ou -80 °C para análise adicional de teor de proteínas.
- Realizar a co-extração de eCBs e EICs a partir de amostras de plasma.
- Degelo de alíquotas de plasma a 4 °C. Adicionar 800 μL de MTBE e 50 μL de ACN/H2O (1:1; v/v) contendo as normas internas (análogas às utilizadas para análise de tecidos, ver o passo 5.1.1). Otimize a concentração padrão interna para espetar usando amostras de plasma de referência.
- Adicione 600 μL de 0,1 M de ácido fórmico e amostras de vórtice a 4 °C por 2 min. Centrífuga amostras a 4.000 x g para 15 min a 4 °C.
- Transfira a fase orgânica para novos tubos, evapore sob um fluxo suave de N2 a 37 °C e reconstitua em 50 μL de ACN/H2O (1:1; v/v) para análise LC/MRM.
NOTA: Se possível, evite o armazenamento de extratos secos de eiCs e prossiga imediatamente para análise LC/MRM. Se o armazenamento não puder ser evitado, recorra ao armazenamento de curto prazo por apenas 2-3 dias a 4° C com amostras em solvente de injeção de LC.
- Realizar a co-extração de PLs e ECBs de regiões cerebrais, socos ou outras amostras de pó de tecido.
- Coloque os tubos de extração contendo as amostras de tecido e as contas cerâmicas no gelo (4 °C). Adicione 800 μL de MTBE/MeOH (10:3; v/v) e 10 μL de MeOH contendo as normas internas. A concentração alvo das normas internas no volume final para análise (100 μL) é a seguinte: 150 ng/mL para PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 e 3 ng/mL PEA-d4, respectivamente.
- Adicione 200 μL de ácido fórmico de 0,1% contendo 25 μM tetrahidrolipstatina/URB597 e 50 μg/mL BHT. Homogeneize-se com o homogeneizador de tecido (Tabela de Materiais) e centrífuga a 5.000 x g e 4 °C por 15 min.
- Recupere a fase orgânica superior em novos tubos e evapore sob um fluxo suave de N2 a 37 °C. Reconstitua em 90 μL de MeOH e armazene a -20 °C ou -80 °C ou proceda com o próximo passo.
- Adicione 10% de H2O a uma alíquota de extrato lipídudo (4.1.3.3) e injete 10 μL na LC/MS para análise de PLs. Para posterior análise do ECB proceda com a etapa 4.3.5.
- Tome uma alíquota do extrato (4.1.3.3), evaporar até o ressecamento e reconstituir em ACN/H2O (1:1; v/v). Use 20 μL para injeção de LC/MS para análise de eCB.
- Realizar a co-extração de PLs e eCBs a partir de amostras de plasma.
- Alíquotas de plasma degelo a 4 °C, adicione 1.000 μL de MTBE/metanol (10:3; v/v) e 10 μL MeOH contendo padrões internos (análogo ao passo 4.1.3) e vórtice a 4 °C por 1 min.
- Adicione 250 μL de H2O e vórtice por 45 min a 4 °C. Amostras centrífugas para 15 min a 5.000 x g e 4 °C. Recupere a fase orgânica superior, evapore sob um fluxo suave de N2 a 37 °C e reconstitua em 90 μL de metanol para posterior análise de LC/MS. Armazene a -20 °C ou -80 °C ou prossiga para a próxima etapa.
- Para análise de PLs, adicione 10% de água a uma alíquota de extrato lipíduo (4.1.2.2).
- Para análise do ECB, adicione 10% de água a uma alíquota do extrato lipídico (ver 4.1.4.3), evaporar até o ressecamento e reconstituir em 50% ACN/H2O (1:1; v/v).
- Realizar extração dupla de RNA e lipídios (co-extração de PLs e eCBs) a partir de amostras de tecido.
ATENÇÃO: Certifique-se de trabalhar em condições livres de RNA para evitar a degradação do RNA.- Descongelar alíquotas em pó de tecido ou cachos cerebrais (a 4 °C) e adicionar 600 μL de tampão RLT contendo 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL BHT, e 1% β-mercaptoetanol (para percentuais do volume final de tampão de homogeneização, ver passo 4.1) juntamente com 200 μL de clorofórmio para tubos de extração contendo socos cerebrais congelados e contas cerâmicas.
- Amostras de espeto com 10 μL de mistura padrão interna para PLs e co-extração eCB (ver passo 4.1.3) e homogeneizar via homogeneizador de tecido (alta velocidade, 20 s).
- Transfira os linfásis para novos tubos de centrífugas e centrífugas por 5 minutos a toda velocidade e 4 °C para permitir a separação da fase.
- Recuperar e utilizar a fase superior para extração de RNA utilizando kits de procedimento de extração de RNA padrão (Tabela de Materiais). Elute RNA em um volume total de 50 μL de água sem RNase e armazenar a -80 °C.
NOTA: A amostra na etapa 4.1.5.4 é favorável tanto para o sequenciamento de RNA quanto para qPCR utilizando os métodos e instrumentação apropriados. - Use a fase de contenção de clorofórmio inferior para extração lipídica. Adicione 800 μL de MTBE/metanol (10:3; v/v) e 200 μL de ácido fórmico e vórtice de 0,1% para 45 min a 4 °C. Recupere a fase orgânica superior e evapore sob um fluxo suave de N2 a 37 °C.
- Reconstituir em 90 μL de metanol para análise suplementar de LC/MS. Armazene a -20 °C ou -80 °C ou proceda à etapa 5.
- Adicione 10% de H2O a uma alíquota de extrato lipídudo (veja acima do passo 4.1.5.6) e injete 10 μL na LC/MS para análise de PLs. Para posterior análise do ECB proceda com a etapa 5.7.
- Faça uma alíquota do extrato (veja acima do passo 4.1.5.6) evaporar até o ressecamento e reconstituir em ACN/H2O (1:1; v/v). Use 20 μL para injeção de LC/MS para análise de eCB (análogo à etapa 4.3.5).
- Realize a co-extração de eCBs e EICs de pedaços cerebrais, socos ou amostras de pó de tecido.
5. Perfil qualitativo e quantitativo LC/MRM
- Prepare sistemas de solventes LC, soluções de calibração e amostras de controle de qualidade.
- Para PLs, prepare a fase móvel A: metanol/água (1:1; v/v) contendo formato de amônio de 7,5 mM e 0,1% TEA. Prepare a fase móvel B: metanol/isopropanol (2:8; v/v) contendo formato de amônio de 7,5 mM e 0,1% TEA. Armazene solventes em garrafas LC.
- Para separação eCB e eiC, prepare os seguintes solventes LC: 0,1% ácido fórmico como fase móvel A e 100% ACN contendo ácido fórmico de 0,1% como fase móvel B. Armazene solventes em garrafas LC.
- Prepare os controles de qualidade utilizando as normas de calibração e normas internas (Tabela 3) em uma concentração equimolar ou definida pelo usuário.
- Prepare curvas de calibração com sete pontos de concentração. Use o mesmo lote padrão interno para cravar na solução da curva de calibração e em amostras a serem analisadas.
- Use o método LC-MRM para perfil lipídudo qualitativo e quantitativo.
- Abra a guia Método de Aquisição de Compilação no software comercial (por exemplo, Analista) e selecione o modo LC/MRM com comutação de polaridade. Coloque no método as transições de íon (conforme dado na Tabela 3) para o perfil quantitativo. Estabeleça tempo de assentamento para 50 ms.
- Para o perfil dos PLs, defina os seguintes parâmetros de fonte de íon: gás de cortina = 40 psi; temperatura do aquecedor de origem = 550 °C; tensão de spray de íon = -4.500 V no modo íon negativo e = +5.200 V no modo íon positivo.
- Para co-análise de eCBs e eiCs, defina os seguintes parâmetros: gás de cortina = 40 psi; temperatura do aquecedor de origem = 550 °C; tensão de spray de íon = -4.500 V no modo íon negativo e = +4.500 V no modo íon positivo.
- Para análise de PL, defina o aquecimento da coluna para 45 °C e a vazão para 200 μL/min e defina o seguinte gradiente: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B, e min 52 = 40% B. Ajuste o volume de injeção para 10 μL.
- Para análise de eCBs e eiCs, defina a temperatura da coluna à temperatura ambiente e defina o seguinte gradiente: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Ajuste o volume de injeção para 20 μL.
NOTA: As condições de MRM podem variar entre plataformas instrumentais, portanto, as condições de fragmentação e MRM devem ser inferidas experimentalmente e os parâmetros de ionização devem ser testados e ajustados, se necessário, a fim de obter a máxima sensibilidade e seletividade.
- Realize a análise em lote.
- Abra o lote build acquisition e preencha os parâmetros necessários para a descrição da amostra, localização no rack de amostra do autosampler e método de aquisição (definido como etapa 5.2).
- Inclua sempre controles de qualidade no início e no final da análise e dentro do lote. Após cada 25-30 amostras, inclua pelo menos três curvas de calibração dentro do lote e inclua uma etapa de lavagem com um solvente de escolha após cada amostra de controle de qualidade, curva de calibração e no final do lote de amostra.
- Transferir amostras obtidas na etapa 4 em frascos de LC/MS. Coloque as amostras nos racks de carregamento do autosampler LC de acordo com a posição definida no lote e carregue o rack de amostra no autosampler LC.
- Envie o lote e inicie a análise da fila.
- Quantificação lipídica
- Use o software comercial (por exemplo, Analista) e o módulo de quantificação embarcada para quantificação de eCS e eiCs quantificação e software comercial (por exemplo, Multiquant) para quantificação de PLs.
NOTA: O segundo software também pode ser usado para eCBs e eiCs, especialmente quando um padrão interno é usado para a quantificação de vários analitos. - Abra o Método de Quantificação da Construção e preencha os parâmetros para analitos, normas internas, transições mrm e atribua as normas internas aos analitos a serem quantificados (Tabela 3). Ajuste a altura mínima de pico para 500 cps.
- Use os seguintes critérios ou combinações para atribuição de identidade lipídica e quantificação subsequente6: correspondência de tempo de retenção de analitos endógenos lipídes com padrões de calibração e/ou padrões internos deuterados, quando disponíveis; fragmentação do modo íon positivo e negativo para uma dada m/z de analitos lipídicos para os quais não são fornecidas normas; comportamento de elução inferido pela literatura de lipídios sob condições de LC utilizadas da mesma forma para dissecar estruturas isomericas e/ou isobáricas; e, quando disponível, análise de LC/MS e MS/MS com espectrometria de massa de alta resolução, utilizando condições semelhantes de LC como para análise direcionada (utilizando LC/MRM), para identificar com precisão o comportamento de identidade e eluição de lipídios endógenos de interesse18,19.
- Para validação da análise do lote, utilize os seguintes critérios: exatidão da quantificação ≤ ±20%; coeficiente de regressão ≥0,97 (idealmente ≥0,99).
NOTA: Siga as diretrizes para o desenvolvimento e validação de métodos bioanálíticos para garantir uma análise confiável e reprodutível das moléculas-alvo.
- Use o software comercial (por exemplo, Analista) e o módulo de quantificação embarcada para quantificação de eCS e eiCs quantificação e software comercial (por exemplo, Multiquant) para quantificação de PLs.
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Representative Results
O conjunto de protocolos descritos pode ser combinado em diferentes níveis de forma específica do objetivo, como escolha de modelo animal, rota de amostragem, método de extração e perfil (Figura 1).
A fim de determinar mudanças lipídicas no cérebro e na periferia ao longo de um curso de tempo de um estado de convulsão epiléptica aguda e para desvendar o potencial efeito antiepiléptico13 da PEA e seu impacto nas alterações lipidométicas no cérebro e na periferia, três grupos animais experimentais foram tratados com veículo, KA para induzir epilepsia aguda, e PEA como um candidato a drogas antiepilépticas. O PEA foi administrado via i.p. antes da injeção de KA (por exemplo, com uma única injeção de PEA para tratamento agudo e duas injeções de PEA para tratamento subcrático). Para fins de análise molecular múltipla e/ou coloração imunohistoquímica aos 5 dias após o tratamento, os experimentos em animais foram repetidos conforme necessário (Figura 2).
A indução de KA de convulsões epilépticas agudas leva a uma intensidade de convulsão máxima 1 h após a injeção15 (Figura 3). Para desvendar as alterações no nível lipídicos do cérebro e periféricos no estado de intensidades máximas de convulsão, os camundongos foram sacrificados a 1 h após a injeção de KA, seguidos pela amostragem de plasma, cérebro e órgãos periféricos. Cérebros congelados foram dissecados em seis regiões cerebrais (ver passo 3.1). Regiões cerebrais e tecidos de órgãos periféricos (coração e pulmão) foram pulverizados para obter amostras homogêneas de tecido e, posteriormente, aliquos para o perfil lipidomico de eCBs e EICs (Figura 4A e passo 4.1.1) e PLs e ECBs (Figura 4B e passo 4.1.3).
O protocolo de extração dupla (ver passo 4.1.5) foi aplicado para realizar PLs/eCBs e RNA em maior resolução espacial através de perfis de socos cerebrais em diferentes regiões: o hipotálamo (HYP), a amígdala basolateral (BL) e o hipocampo ventral (vHC) e dorsal (dHC) (Figura 5). Foram amostrados socos (ver passo 3.2) de camundongos epilépticos induzidos por KA e camundongos de controle no estado de apreensão máxima a 1 h de injeção pós-KA (Figura 2).
Avaliar a extensão da neurodegeneração e atribuir alterações lipídicas à extensão da neurodegeneração com epilepsia e sobre o novo tratamento de epilepsia com PEA, a coloração dupla imunohistoquímica foi realizada em seções cerebrais (ver passo 1.3) amostradas 5 dias após as convulsões epilépticas induzidas por KA (Figura 2) em camundongos sem tratamento subcrônico de PEA (médio), com tratamento de PEA subcrático (à direita) e em camundongos injetados em soro fisiológico (esquerda) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6) (Figura 6 ). O epiléptico de status induzido por KA (SE) causou perda maciça de sinal NeuN, predominantemente na região ca1, CA3 e hilus do hipocampo, acompanhado de eventos apoptóticos indicados pelo sinal caspase-3 (CASP3) (Figura 6, imagem média) em comparação com o controle (Figura 6, imagem esquerda). O tratamento subcrônico de PEA (imagem direita) notavelmente preservou o sinal de proteína neuronal (NeuN), enquanto o sinal (CASP3) é pouco detectável.
| Solução de injeção KA e SAL . |
| Solução de injeção KA (volume final de 8 mL): |
| 1. Pese 24 mg KA em tubo de 15 mL (cuidado: use glothes e máscara) |
| 2. Adicione 8 mL salino e vórtice por 10 minutos |
| 3. Mantenha-se a 4°C para armazenamento intermediado |
| 4. Recondicionamento à temperatura ambiente e vórtice antes da injeção |
| Solução de injeção do veículo 1 (volume final de 8 mL): |
| Pule a etapa 1 e prossiga com as etapas 2-4 |
Tabela 1: Preparação de aplicação de droga indutora de convulsões e veículo 1. Etapas para preparar a solução de injeção de ácido kainico (KA) para 24 injeções intraperitoneais (10 mL/kg) em uma concentração final de 30 mg/kg e a solução correspondente de injeção do veículo (veículo 1)1.
| Solução de injeção PEA e SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)). |
| Solução de injeção de PEA (volume final de 8 mL): |
| 1. Pese 32 mg de ERVILHA em tubo de 15 mL |
| 2. Adicione 0,4 mL DMSO e vórtice por 10 min |
| 3. Adicione 3,4 mL DE SAL e vórtice por 5 min. |
| 4. Mistura de sonicato por 5 min a 36°C |
| 5. Adicione 0,4 mL Cremophor e vórtice por 5 min |
| 6. Sonicate por 1 min a 36°C e adicionar 3,4 mL SAL |
| 7. Vórtice por 30 segundos e sonicato por 3 min a 36°C |
| 8. Mantenha a solução a 36°C em baixa velocidade em shaker e vórtice antes da injeção |
| Solução de injeção do veículo 2 (volume final de 8 mL): |
| Pule a etapa 1 e prossiga com as etapas 2-8 |
Tabela 2: Preparação de droga antiepiléptica e aplicação do veículo 2. Passos exemplificados para preparar a solução de injeção palmitoylethanolamide (PEA) para 24 injeções intraperitoneais (10 mL/kg) em uma concentração final de 40 mg/kg e a solução de injeção de veículo correspondente (veículo 2)1.
| Modo íon positivo | ||||||
| PLs de padrões de calibração selecionados | Padrões internos correspondentes | |||||
| Analito | Íon precursor | Íon do produto m/z | Analito | Íon precursor | Íon do produto m/z | |
| nome | m/z | nome | m/z | |||
| AEA | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| ERVILHA | 300.2 | 62.1 | PEA-d4 | 304.2 | 62.1 | |
| PC 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | PC 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| PC 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| PC 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| Modo íon negativo | ||||||
| PLs de padrões de calibração selecionados | Padrões internos correspondentes | |||||
| Analito | Íon precursor m/z | Íon do produto m/z | Analito | Íon precursor | Íon do produto m/z | |
| nome | nome | m/z | ||||
| AA | 303.05 | 259.1 | AA-d8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-HETE | 319.48 | 115 | 5(S)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-HETE | 319.48 | 155 | 12(S)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(S)-HETE | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20-HETE | 319.48 | 289 | 20-HETE-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| PGD2 | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PS 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | PS 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| PS 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| PS 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:00 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
Tabela 3: Normas lipídicas e transições de MRM para análise lipidômica direcionada. O conteúdo da tabela foi originalmente publicado em Lerner et al.2
Figura 1: Visão geral dos módulos de fluxo de trabalho. Dependendo do objetivo do estudo e de diferentes rotas de amostragem, extração e perfil podem ser combinados para possibilitar um resultado significativo para o estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Desenho experimental do modelo de convulsão epiléptica induzida por ácido kainico agudo (KA) em camundongos. Os camundongos são tratados com 1) Soro fisiológico (10 mL/kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); e/ou 3) (sub) cronicamente pré-tratada (1−2x 40 mg/kg i.p.) com o potencial composto antiepiléptico Palmitoylethanolamide (PEA). Vinte e quatro camundongos por grupo foram tratados como acima e o comportamento foi pontuado para avaliar as intensidades de convulsão. Seis camundongos por grupo foram sacrificados em cada um dos quatro pontos de tempo diferentes (T1−T4) para determinar mudanças de nível lipídico ao longo de um curso temporal de estado de convulsão epiléptica aguda no cérebro, órgãos periféricos e plasma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pontuação comportamental ao longo de um curso de tempo de epilepsia induzida por ácido kainico agudo (KA) vs. controles. Avaliação das intensidades convulsivas ao longo de um curso de tempo de 180 min pós-apreensão de KA (n = 24) ou injeção salina (n = 24) dada como escores comportamentais médios. Não foram encontradas diferenças entre o veículo 1 e os grupos injetados do veículo 2. Barras de erro = SEM. A medição repetida da ANOVA rendeu interações significativas entre os pontos de tempo das medições e os grupos de teste, indicando efeitos significativos do tratamento de KA nos escores comportamentais. As intensidades de convulsão de camundongos tratados com KA foram originalmente publicadas no Post et al.13Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Níveis lipídicos cerebrais e periféricos no estado de convulsão epiléptica aguda. Alterações de nível lipídico apresentadas como valor médio ± SEM em intensidade máxima de convulsão (por exemplo, 1 h injeção pós-KA) em seis regiões cerebrais (n = 9): córtex cerebral (cCTX), estriatum (STR), região talamica (THL), hipocampo (HC), hipotálamo (HYP), cerebelo (CER), bem como tecido cardíaco e pulmonar em camundongos epilépticos induzidos por KA (valor superior) e controles (menor valor). Os níveis lipídes de lipídios basais nos tecidos são retratados em cinza. Os valores de PLs, 2-AG e AA são dados em nmol/g. e os valores para NAEs, eiCs e AEA em pmol/g, respectivamente. Todos os níveis lipídes são normalizados para o peso do tecido. Para destacar as alterações moleculares específicas, os níveis lipídicos dos camundongos tratados com KA são representados como porcentagem do soro fisiológico injetado (KA/sal) em um mapa de calor que exibe valores reduzidos na intensidade aguda da convulsão em comparação com o controle são retratados em azul claro e os níveis aumentados em comparação com o controle em vermelho, respectivamente. Eles são considerados significativos a um valor p <0,05. Esses dados foram originalmente publicados em Lerner et al.2Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Extração dupla de eCBs/PLs e RNA para perfil quantitativo de socos cerebrais de camundongos. (A) Distribuição quantitativa de PLs e ECBs selecionados em: 1) sub-região do hipotálamo (HYP); 2) a amígdala basolateral (BLA); e 3) as sub-regiões ventral (vHC) e dorsal (dHC) do hipocampo, dos camundongos de convulsão epiléptica induzidas pelo KA (valor superior) versus os controles (menor valor) (n = 10). Os níveis são normalizados ao peso tecidual (os socos correspondem a aproximadamente 0,5-1,5 mgs) e expressos em nmol/g. Apenas a AEA é expressa em pmol/g. Os níveis lipídides são apresentados como valor médio ± SEM. Variação média por região cerebral perfurada (SEM como percentual de média, média sobre todos os lipídios) é: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; e dHC = 7,90%, respectivamente. (B) Níveis relativos de expressão de enzimas e receptores endógenos envolvidos na sinalização lipídica, bem como marcadores para atividade cerebral investigados no nível mRNA em diferentes regiões cerebrais/sub-regiões de camundongos submetidos a convulsões epilépticas induzidas por KA (vermelho) e controles (cinza claro). As análises estatísticas da diferença entre as médias de grupo foram realizadas utilizando-se o teste t do aluno não remunerado de duas caudas e consideradas significativas a um valor p <0,05 (n = 10). Esses dados foram originalmente publicados em Lerner et al.7Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mhistoquímica NeuN e CASP3 dupla mancha. Cinco dias de imunohistoquímica de injeção pós-KA foi realizada em seções cerebrais de camundongos não tratados injetados em soro fisiológico (esquerda), camundongos pré-tratados subchicamente ERVILHA (médio) e camundongos epilépticos sem pré-tratamento (à direita). O pré-tratamento do PEA mostra efeitos neuroprotetores em comparação com camundongos epilépticos não tratados (n = 3). Esses dados foram originalmente publicados no Post et. al.13Por clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A metodologia neurolipidômica e transcriômica descrita aqui é uma média viável para investigar qualquer doença ou desenvolvimento saudável em alta e baixa resolução espacial no cérebro e órgãos periféricos. Devido aos procedimentos otimizados de amostragem e manuseio de plasma, a análise lipidômica plasmática também pode ser realizada a partir dos mesmos animais sacrificados por lipidemia tecidual e transcrição, melhorando assim a confiabilidade dos correlatos moleculares do sangue tecidual e da descoberta de biomarcadores. O fornecimento de um amplo conjunto de dados por aplicação de qualquer um dos três protocolos ou combinações deles, é de valor para investigar não apenas uma doença neurológica dentro de um contexto (experimento modelo animal), mas também entre e entre contextos de modelos experimentais. Além disso, um alto nível de padronização da amostragem, processamento e análise molecular facilita a alta reprodutibilidade dos dados moleculares, fazendo referência confiável às mudanças moleculares entre e dentro de estudos e laboratórios.
No entanto, para isso, a configuração de um projeto experimental que ofereça o potencial máximo de leitura para o objetivo do estudo definido é fundamental. Para obter uma comparação confiável das mudanças moleculares entre grupos experimentais, recomenda-se usar um mínimo de dez animais para compensar a variabilidade animal e a faixa biológica de níveis lipídesticos. Quando a aquisição de animais e/ou logística de manejo animal são restritivas, o uso de um mínimo de seis animais por grupo é imperativo para permitir uma análise estatística confiante. Os cálculos de tamanho de grupo precisam compensar as taxas de mortalidade relacionadas ao modelo (ou seja, um mínimo de seis, idealmente dez, animais por grupo são necessários para o estudo, apesar da possível taxa de mortalidade do modelo). Um requisito crítico é garantir animais com idade, sexo e cepas por grupo experimental. Para a fase de descoberta, é essencial utilizar o mesmo provedor para animais experimentais para todos os estudos e o mesmo lote animal, se possível, a fim de evitar viés dos achados devido a possíveis diferenças de fenótipo comportamental e molecular entre lotes animais. Para garantir a confiabilidade e a reprodutibilidade do fenótipo molecular e comportamental determinado nos estudos, é fundamental realizar uma análise de réplica biológica sempre que possível.
Outro passo crucial é montar um trabalho experimental padronizado e programado com grupos animais. É imperativo tratar os animais na mesma janela de tempo do dia para contornar a variabilidade molecular circadiana. A hora do dia deve ser definida de acordo com o impacto conhecido do ritmo circadiano na síntese e degradação das moléculas-alvo ou mantida consistente para todos os grupos experimentais quando nenhuma informação sobre efeitos do ritmo circadiano está disponível. Da mesma forma, as condições de moradia e alimentação antes do sacrifício animal devem ser mantidas consistentes e estritamente controladas em modelos experimentais. Isso é particularmente relevante para o perfil lipidômico devido à influência da nutrição no plasma lipídico e no metabolismo tecidual. A administração de medicamentos terapêuticos ou indutores de doenças deve ser invariavelmente realizada em paralelo com a administração de veículos em grupos de controle, pelo qual o veículo deve ser o mesmo utilizado para a administração de medicamentos. Para escolher a cepa de roedores mais adequada e/ou substreinamentos para a finalidade do estudo, as estratégias de tratamento à base de medicamentos devem ser realizadas de acordo com a especificidade do medicamento em termos de tempo e frequência de administração, doses e rota de administração, e as suscetibilidades específicas a medicamentos de diferentes cepas inferidas da literatura e/ou experiência prévia. Uma investigação temporal de uma doença e uma resposta à terapia envolvendo grandes grupos de coorte ou múltiplos grupos animais é impossível de realizar em um dia em termos de tratamento, sacrifício e amostragem. Nesses casos, o processamento do grupo animal deve ser agendado e realizado em dias consecutivos, mas mantendo as mesmas condições em termos de tempo do dia, projeto experimental, tempo de processamento, pesquisadores, etc. A preparação de injeções químicas é outro passo crítico. Os compostos indutores de medicamentos ou doenças devem ser preparados recentemente antes da administração e de acordo com as especificações dos medicamentos. Recomenda-se o uso do mesmo lote de produção da droga para que todas as coortes sejam comparadas. Isso é especialmente importante no caso de formulações de compostos naturais, como o ácido kainico (KA) utilizado neste estudo para indução de epilepsia.
Para permitir perfis lipidômicos e ou transcriômicos confiáveis, o procedimento de sacrifício animal deve ser realizado de forma consistente entre os grupos animais dentro de um prazo de 5 minutos. Se o sangue for coletado após a decapitação, é importante manter uma quantidade constante de isoflurano na câmara de vidro. Para isso, mergulhe frequentemente (após cinco usos) com isoflurano e não exceda 10 s durante a duração da anestesia usando isoflurano, a fim de evitar o aparecimento de arritmia e palpitações e garantir pressão arterial adequada para amostragem de plasma.
As condições para amostragem e manuseio de materiais biológicos (por exemplo, a janela de tempo e a ordem de amostragem e manuseio de materiais biológicos) devem ser rigorosamente seguidas e mantidas idênticas para todos os grupos. Para evitar graus variáveis de descongelamento de tecidos e, portanto, alterações inconsistentes de tecido ex vivo de níveis lipídes e/ou mRNA, é essencial manter condições estritamente controladas de tempo e temperatura para pós-amostragem
armazenamento. dissecção ou perfuração de tecido, e processamento e análise subsequente da amostra (ver seções 3 e 4). Cérebros inteiros recém-amostrados podem ser imediatamente dissecados em uma placa metálica pré-medicada (4 °C) sem um snapfreezing prévio, se o tamanho dos grupos animais experimentais permitir o sacrifício, remoção e dissecção animal sem alterar o prazo indicado aqui para cada um desses procedimentos. Se o tamanho dos grupos experimentais não for prático para esses procedimentos, recomenda-se o congelamento instantâneo do cérebro e a dissecção subsequente para permitir tempo comparável e controlado para o processamento. Ao seguir rigorosamente os protocolos e diretrizes da linha do tempo aqui indicados, não foram observadas discrepâncias entre os níveis moleculares obtidos pela extração de regiões cerebrais recém-dissecadas e regiões cerebrais dissecadas de cérebros congelados.
Um aspecto crítico para alcançar a variabilidade reprodutível e mínima dos níveis lipídes, dentro e entre os grupos, além do processamento da amostra em condições de temperatura estritamente controladas, é o fornecimento de antioxidantes (ver seções 2 e 3). Evitar quaisquer fatores de estresse (por exemplo, o cheiro de sangue) dos animais antes do sacrifício é de suma importância, já que muitos lipídios envolvidos na atividade neuronal, como os ECBs, podem mudar rapidamente em resposta ao estresse.
Para extração e análise lipídica, é essencial preparar recentemente as normas internas, soluções de calibração e solventes de extração no dia da extração. A mesma fonte de normas internas deve ser utilizada tanto para a preparação da curva de calibração quanto para extrações amostrais. Além disso, seguir condições de temperatura estritamente controladas para extração, armazenamento e análise de amostras é primordial para minimizar e controlar alterações enzimáticas ou químicas ex vivo de moléculas. Para a análise de LC/MRM, o conjunto de lipídios direcionados pode ser adaptado ao objetivo do estudo, adicionando ou removendo metas e correspondentemente normas internas e calibrantes, desde que as transições de separação, detecção e MRM para um novo conjunto de lipídios sejam otimizadas. Os protocolos de extração apresentados permitem o fornecimento de duas réplicas de LC/MRM para eCBs e EICs, o que é fundamental para casos de falha técnica ou quando a análise de replicação é de significância para o estudo. Os protocolos de extração de PL tornam as quantidades de amostra/extrato adequadas para pelo menos 10 análises por extrato (por exemplo, múltiplos experimentos de varredura com base na varredura de íons precursores e perdas neutras2, respectivamente; análises adicionais de LC/MRM; ou réplicas de LC/MRM para compensar a falha técnica durante uma execução). A análise lipídica não se restringe à LC/MRM; na verdade, os extratos lipíduos obtidos com qualquer um desses protocolos são favoráveis à análise de espectrometriia de massa não retardada e de alta extremidade. Com exceção de socos cerebrais ou quantidade minuciosa de tecidos obtidos de regiões discretas (menos de 3 mg), tecidos pulverizados congelados de regiões maiores que 2-3 mgs podem ser aliquos e usados para múltiplos módulos de extração, conforme descrito aqui para análise de réplica e/ou para outras investigações favoráveis em pó de tecido.
Uma vantagem geral dos protocolos aqui descritos em comparação com os comumente utilizados é o aumento da eficácia e sensibilidade global para extração e análise multicomponíveis na diminuição dos gastos com recursos animais, consumíveis e custos de análise. É importante ressaltar que o protocolo de extração lipídio/mRNA duplo também proporciona maior eficiência da extração de mRNA20,21 e integridade do mRNA em comparação com os protocolos padrão disponíveis correspondentes e, simultaneamente, aumenta a eficiência da extração lipídica7. Isso também é provável devido à diminuição do efeito matricial para cada uma das frações lipídica e mRNA quando extraída duplamente. Devido a isso, o método é prontamente aplicável para perfis de alta resolução espacial, como em socos cerebrais.
No entanto, uma limitação atual do protocolo é que os lipídios inflamatórios não são favoráveis à análise e quantificação usando a extração lipídica/mRNA dupla. Assim, o protocolo está sujeito a mais refinamento. Para isso, lipídios inflamatórios tecidários e plasmáticos e endocanabinóides podem ser co-extraídos e co-analisados, que é uma ferramenta otimizada para investigar simultaneamente processos neuroinflamatórios e atividade neuronal modulada por endocanabinóides (ver coextração de EICs e ECBs). Espera-se que a inclusão de fosfolipídios neste último ensaio seja viável.
Tendo em vista as abordagens multimicesômicas prospectivas para doenças neurológicas, espera-se que a análise proteômica das frações proteicas obtidas após o protocolo de extração lipídica (ou seja, co-extração de ECBs e EICs, bem como a co-extração de PLs e eCBs) seja viável. No entanto, isso ainda não é possível ao usar o protocolo lipídio/mRNA duplo. Para este último, o ambiente químico da extração impede até mesmo a determinação da quantidade de proteína usando ensaios proteicos padrão, como o ensaio de ácido bicinchonínico (BCA). Estão previstos novos desenvolvimentos para superar essa limitação e agilizar a inclusão do perfil proteômico nesses protocolos.
Usando o protocolo modular descrito aqui, foi possível alcançar um mapa regional cerebral de EICs, eCBs e PLs em um modelo animal de convulsões epilépticas agudas (Figura 4). O protocolo mostrou a modulação hipocampal dos processos inflamatórios por EICs e da modulação da atividade neuronal por eCBs em camundongos tratados e não tratados com convulsões agudas induzidas pelo KA13. Também foram observadas alterações cerebrais sub-regionais de fosfolipídio, endocanabinóide e mRNA em estados de convulsão epiléptica aguda, respectivamente, (Figura 5). Esses resultados destacam o valor e a aplicabilidade dos métodos aqui descritos no avanço do conhecimento sobre um amplo espectro de lipídios envolvidos na modulação de doenças neurológicas complexas, como epilepsia em regiões cerebrais e sub-regiões. Esses protocolos são de aplicabilidade geral na investigação de doenças neurológicas e além disso, enquanto o desenvolvimento dos protocolos e aplicações para populações celulares continua.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Dedicamos este artigo à Dra. Durante a finalização deste manuscrito, a Dra. Ela é a personificação da paixão pela ciência e do engajamento altruísta no trabalho em equipe para cumprir um propósito significativo de pesquisa. Ela sempre sonhou em contribuir significativamente para o maior bem-estar dos humanos. Sua natureza de bom coração nunca foi comprometida pelas estradas extenuantes da ciência e da vida. Ela permanecerá inestimável, e para sempre, em nossos corações.
Julia M. Post foi financiada pelo Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) no University Medical Center da Johannes Gutenberg University Mainz e atualmente é financiada pelo projeto SPP-2225 EXIT para LB. Raissa Lerner foi parcialmente financiada pelo projeto DZHK 81X2600250 para LB e Lipidomics Core Facility. O financiamento parcial para esses estudos foi fornecido pelo Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry, e intramural funds (to LB) do Centro Médico Universitário da Universidade Johannes Gutenberg Mainz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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