Summary
この記事では、炎症およびニューロン活性の根底にある脂質、膜脂質、下流メッセンジャー、および脂質機能の根底にあるmRNAコード酵素/受容体を標的とする神経疾患マウスモデルにおける組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクス、および血漿リピドミクスのためのモジュラープロトコルを提示する。サンプリング、サンプル処理、抽出、および定量の手順が概説されています。
Abstract
脂質は、神経学的疾患を助長する脳の侮辱または刺激に対する主要なインターフェースとして機能し、疾患の発症および進行を強調することができる様々なシグナル伝達またはリガンド機能を有する脂質の合成のための貯蔵庫である。多くの場合、未症候性レベルで変化する脂質は、薬物標的およびバイオマーカーの新たな供給源である。多くの神経学的疾患は、神経炎症、神経変性、および神経細胞興奮性を共通の特徴として示し、部分的には特定の脂質シグナル伝達系によって調節される。様々な脂質の合成の相互依存性および相互関係は、神経学的文脈の共通性および特異性を導き出し、疾患の発症および進行の機構的側面の解明を促進するために、多脂質、多酵素、および多受容体分析を促す。脂質の役割を異なる脳領域に帰属させることは、神経学的疾患に関連する脂質分子表現型および形態の決定を前進させる。
ここでは、膜脂質および下流脂質シグナルの分析に適したモジュラープロトコルを、その機能の根底にある酵素およびメディエーターのmRNAとともに、特定の神経学的疾患および/または状態に関連する個別の脳領域から抽出する。正確な比較リピドミープロファイリングを確実にするために、ワークフローと操作基準は、i)関心領域の脳サンプリングと解剖、ii)複数の脂質シグナルと膜脂質の共抽出、iii)二重脂質/mRNA抽出、iv)液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング(LC / MRM)による定量、およびv)標準mRNAプロファイリングのために最適化され標準化されました。このワークフローは、機能的に離散的な脳サブ領域のサンプリング(すなわち、脳パンチングによる)によって得られる低組織量に対して順応性であり、したがって、組織の不均一性および/または動物の変動性による多分子分析におけるバイアスを防止する。神経疾患の末梢結果を明らかにし、神経学的疾患状態の翻訳分子読み出しを確立するために、末梢器官サンプリング、プロセシング、およびその後のリピドミクス分析、ならびに血漿リピドミクスも追求され、記述される。このプロトコルは、急性てんかんマウスモデルで実証される。
Introduction
近年の脂質の機能の進歩と神経疾患の発症・進行における脂質の役割は、新たな治療標的や疾患メカニズム解明の新たな研究開発の場を切り拓いています1。質量分析イメージングや高度な質量分析プロファイリングなどの現代の分子イメージング技術によって強調された、異なる脳領域における脂質組成の文書化された違いは、脂質調査のパラダイムを全脳から機能的に別個の脳領域へとシフトさせる。脂質組成が異なる脳領域で変化するという事実は、機能的に異なる脳領域にわたる脳の侮辱または刺激に応答して、膜脂質感受性および下流脂質シグナル伝達の両方の新しい概念化を促す。したがって、脂質プロトコルは、より高い空間分解能の検出および定量化のための低組織量の課題に対処するための新しい開発を必要とし、同時に、細胞膜およびシグナル伝達経路の複数の脂質成分の分析を必要とする。また、それらのレベルおよび機能の調節に関与する酵素、脂質リガンド、および受容体の決定は、神経学的疾患において影響を受けるシグナル伝達経路を解明し、病態生理学的文脈における新しい機構的研究を導くために最も重要である。
脳の空間分解能の向上に加えて、新しい神経リピドミーアプローチの開発に挑戦する2つの大きな困難があります。第1に、脂質シグナル伝達分子は、典型的には、膜構成脂質と比較して非常に低い存在量のものである。第2に、リピドームは高い構造的不均一性を示し、単一の分析アプローチを用いて解剖することは困難である。したがって、抽出および分析方法は、異なる脂質カテゴリーに合わせて調整され、異なる組織サンプルで一般的に実行されます。2.ショットガンリピドミクス法3 膜脂質の広範なプロファイルを迅速に明らかにするための優れたツールであり、標的化された発見および定量化質量分析法によってもたらされる感度および選択性の増加は、i)炎症性脂質およびii)エンドカンナビノイド(eCB)、アミノ酸結合脂質などのニューロン活性の調節に関与する脂質を含む、低豊富シグナル伝達脂質の調査に利用され、 等。4,5.神経学的疾患モデルの脳領域において生じる細胞膜およびシグナル伝達レベルの両方における脂質変化を包含するために、典型的には、脂質抽出および分析は、別個の組織試料において、別個の動物バッチから、または異なる半球から得られ、またはより大きな組織領域を複数の断片に解剖することによって行われる。酵素受容体のmRNAレベルも興味深い場合、それらの調査は通常、別個の組織サンプルの調達を必要とする。例えば、膜脂質、内因性カンナビノイド、およびmRNAの調査には、3つの異なる組織サンプル(例えば、2つの脂質抽出方法(膜脂質およびシグナル伝達脂質)のための2つのサンプル、およびその後の2つの脂質分析方法およびmRNA分析のための1つのサンプル)が必要である。炎症性脂質および内因性カンナビノイドの調査には、それぞれ2つの異なる組織サンプル、抽出方法、および分析方法が必要です。別の例は、脳パンチまたはレーザー微小解剖サンプル中のmRNAおよび脂質カテゴリーの調査であり、その結果、脳(サブ)領域ごとに2つのサンプルを調達するために2つの異なる動物が必要である。このような場合、結果の実質的な程度の変動性および/または再現性の悪さが、生物学的変動性および/または組織の不均一性に起因することが多い。特に脳内で高い空間分解能で起こる多分子分析のこれらの実用的な限界に導かれて、1)LC/MRMによる炎症性脂質(例えば、エイコサノイド(eiCs))およびeCBなどのニューロン活動の調節に関与する脂質の共抽出および共分析を含む3モジュールのニューロリピドミクスプロトコルが設計されました。2;2)リン脂質(PL)とeCBの共抽出とその後のマルチスキャンLC/MRMおよび前駆体/中性損失スキャン分析2;3)膜(リン)脂質およびeCBならびにmRNAの二重抽出、その後のLC/MRMおよびqPCRまたはRNAシーケンシング分析6.神経学的疾患および関心のある脳領域において対処されるべき生物学的問題に応じて、第1および第2のプロトコル、または第1および第3のプロトコルの組み合わせを、約4mgの重さの組織について同じ組織標本に適用することができる。第1および第3のプロトコールは、2mg前後の組織に対して独立して適用することができる。第2のプロトコルは、わずか0.5mgの重さの組織に適用することができる。選択された神経リピドームプロトコルモジュールに関係なく、組織サンプリングおよび前分析処理、脳単離および領域解剖、ならびに動物モデルを犠牲にする手順は、プロトコルの3つのモジュールすべてについて標準化され、同一である。神経学的疾患の調査では、疾患の病理学的結果に関連する末梢器官も常に収集され、これらのモジュラープロトコルを使用して分析されます。さらに、血漿リピドミクスのために血液が定期的にサンプリングされ、将来の翻訳アプリケーションの観点から神経学的疾患の読み出しツールとして機能します。ここで提示されたモジュラーリピドミクスプロトコルは非常に汎用性が高く、より大きな組織量に拡張可能であり、事実上あらゆる組織タイプおよび疾患に容易に適用可能である。モジュラープロトコル(図1)神経学的疾患において、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはてんかんなどの神経学的障害の発症および進行の任意の標準化されたげっ歯類モデルが許容される。
これらのプロトコルは、ヒト側頭葉てんかん(TLE)8,9,10,11に類似しているため、前臨床試験で広く使用されているてんかんのカイニン酸(KA)誘導マウスモデルにおけるてんかんの急性期における組織リピドームおよび/またはトランスクリプトームの変化の研究に広く適用されている2,7。これらのプロトコールを用いて、パルミトイルエタノールアミド(PEA)12,13などの薬物の治療可能性を、てんかんの同じマウスモデルにおいて評価した。この研究では、脳および末梢における高分解能および低空間分解能での脂質およびmRNAの変化、最大急性発作強度の時点(発作誘発後60分)、およびKA発作誘発後の4つの異なる時点(20分、60分、120分、および180分)におけるPEAによる亜慢性および急性治療時、てんかんの急性期をカバーする時間窓が同定された。未処理のKA注射マウス、急性および亜慢性PEA処置マウス、ならびにビヒクルおよびPEAビヒクル対照マウスの血漿、脳、および末梢器官を、各時点で収集し12、13、およびこの分子分析を用いて調査した。分子データは、急性てんかん期の進行およびそれを緩和するPEAの可能性を解明するために、発作スコアリングによって得られた行動表現型、ならびに神経変性プロセスに関する免疫組織化学由来のデータと相関していた。
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Protocol
ここに記載されているすべての実験手順は、2010年9月22日の欧州共同体理事会指令(2010/63EU)に準拠しており、ドイツのラインラントプファルツ州の地元の動物委員会によって承認されました(ファイル参照:23 177-07/G16-1-075)。
1. 急性および予防的に治療されたKA誘発てんかんの動物モデル
- 発作誘発、治療、および行動スコアリングを実行する。
- 別々のマウス(1群あたり最小n=6匹のマウス)を単一のケージに入れる。
- 発作誘導注射液および対応するビヒクル(表 1参照)、ならびに治療用注射液および対応するビヒクル( 表2参照)を調製する。
- マウスの腹腔内(i.p.)(10mL/kgマウス体重)を、疾患、治療済み、またはビヒクル治療済み(すなわち、KA、PEA処理KA、および2つのビヒクル群)のグループの同一性に従って麻酔なしで注射する。 図 2、表 1、および 表 2 を参照してください。
- 次の標準化された発作強度スケールに従って行動を監視し、スコアリングする:0 = 応答なし;1 = 不動と凝視;2 = 前肢および/または尾の伸展、硬い姿勢;3 = 反復的な動き、頭のボブリング。4 = 飼育と転倒;5 = 連続的な飼育と落下;6 = 重度のクローン強直性発作;7 = 死亡14,15(図3)。
- リピドミクスおよびトランスクリプトーム分析のための犠牲手順を実行します。
- 4つの時点(すなわち、KA−またはビヒクル注射後それぞれ20分、60分、120分、および180分)に、IACUC承認プロトコルに従って、PEA処置、PEA未処置てんかんビヒクル1、およびビヒクル2の各群から6匹のマウスを屠殺する。
- 各時点に到達してから10秒後に、ガラスチャンバーにイソフルラン浸漬した組織を用いてマウスを麻酔する。右反射の喪失による麻酔を確認し、ガラスチャンバをゆっくりとひっくり返しながら移動できないことによって示される。外科用はさみを使用してマウスを斬首し、血漿、脳、および末梢器官を採取する(ステップ2.2.2−2.2.4参照)。
注意: 犠牲の手続きに関する倫理規定は、地元の動物委員会によって異なります。地元の動物委員会が発行した規則を確認し、それに従ってください。
- 免疫組織化学分析のための犠牲手順に従ってください。
- 免疫組織化学染色13について、全時間経過(180分)にわたって、以下の各群から3匹のマウスを行動スコアリングした:PEA処置、PEA未処置てんかん、およびビヒクル群。
- 5日後にマウスを屠殺し、灌流する。麻薬としてペントバルビタール(100mg/kg)およびブプレノルフィン(0.1mg/kg)をip.注射することにより、マウスを深く麻酔する(マウス群についてはステップ1.3.1を参照)。つま先の間の反射の喪失によって深い麻酔を確認する。
- マウスをポリスチレンプレートに固定し、すぐに細かいはさみと標準的な鉗子を使って胸郭を開きます。蝶を左心室にセットし、細かいハサミで右心房をカットします。
- ポンプの速度と圧力を、2-3mL/minの速度で一定の蠕動流に調整します。氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で約5分間灌流する。必要に応じて、蝶を交換してください。
注:適切な灌流では、内臓(脾臓を除く)は1〜2分以内に漂白し始めます。 - 灌流を氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に約5分間切り替えます。ステップ2.2.2で説明したように脳全体を単離し、4°Cの4%PFA溶液中で24時間固定する。
- 脳を30%スクロース溶液中で4°Cで48時間インキュベートする。 残ったスクロースを乾いたティッシュペーパーで取り除き、金属板(-80°C)で脳を凍結させた。染色手順13のために脳を-80°Cで保存する。
2. リピドミクス/トランスクリプトーム解析のためのサンプリング手順
- サンプリングの準備をします。
- プラズマサンプリング用のEDTAチューブを4°Cに予冷します。 遠心分離機及びボルテックス装置を4°Cに予冷する。 アルミホイルで覆った金属板をドライアイス (-80 °C) で予冷します (凍った脳やその他の目的の組織をスナップするため)。標識した 2 mL チューブと 5 mL チューブをドライアイス (-80 °C) で予冷し、血漿アリコート、凍結組織、および脳コレクションをそれぞれ行います。琥珀色のチューブを使用して、eiCなどの光に敏感な分子を保護します。
- 組織サンプリングおよび単離装置(外科用はさみ、まっすぐな鋭い細かいはさみ、まっすぐな滑らかな標準鉗子、鏡面仕上げの細かい鉗子、湾曲した鉗子とヘラ、発泡スチロールプレート、および固定用の針)を消毒剤(例えば、70%エタノール)で洗浄する。
- サンプリングプロトコル
- サンプリングの順序を決定します。
- 断頭直後の血液を予め冷却した1mLのEDTAチューブに採取する(工程2.2.3参照)。
- 脳全体を取り外し、取り外し直後にスナップフリーズします。このステップには1〜2分かかります。凍結した脳を-80°Cで保存し、さらに処理します(ステップ2.2.2を参照)。
- 目的の末梢器官(例えば、肺、心臓、肝臓)を除去し、脳除去後5分以内に、スナップ凍結し、さらなる処理のために-80°Cで保存する(ステップ2.2.4参照)。
- 解剖またはパンチング手順のために脳を除去します。この手順は、1-2分/脳を取ります。
- 断頭後(ステップ1.2参照)、細かいはさみを使って皮膚に正中線切開を開始します。目の上の皮膚をひっくり返して頭蓋骨を解放します。頭蓋骨の上部に到達し、頭頂骨のレベルから始まる小さな尾部切開を行う。脳を切断しないでください。
- 頭蓋骨の最も前部を目の間にしっかりと切り込み、脳の除去を容易にします。湾曲した狭いパターンの鉗子を使用して頭頂骨の片側を傾け、切断します。反対側について最後の手順を繰り返します。
- 脳髄膜を除去します.脳の前部(すなわち、嗅球)の下にヘラをスライドさせ、脳を静かに上に傾ける。ヘラをさらに下にスライドさせて、視神経やその他の脳神経を壊します。
- 頭蓋骨から脳を持ち上げ、腹側が金属板に面した予冷(-80°C)金属板(背側を上)ですぐに脳全体をスナップ凍結します。
- 脳を完全に凍結させ、予冷した5mLチューブに移し、脳領域の解剖またはパンチング手順まで-80°Cで保存する(ステップ3.1および3.2を参照)。
- プラズマサンプリングを実行します。
- スパイクは、10μMの標的濃度に調製された10μLのインドメタシン希釈液でEDTAチューブを予冷した。
- 断頭直後の体幹血液を、最大血液量1mLになるまで予冷したEDTAチューブに身体を穏やかに絞って採取する。
注:適切な血圧の場合、圧搾は必要ありません。血液量が1mL未満の場合は、イソフルランのインキュベーション時間を短くして、適切な血流を有効にします。 - 直ちに血液チューブを2,000 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
- 得られた上部血漿相を除去し、多脂質分析の目的で、eCBs/eiCs分析用に50μL、PLs分析用に30μL、および残りの血漿体積をバックアップサンプルまたは他のタイプの分析用に、予冷却された2mLチューブでアリコート定義した血漿体積。
- 血漿サンプルを-80°Cで保存してさらに抽出します(ステップ4.1.2および4.1.4を参照)。
- 末梢臓器サンプリングを行う。
注:マウス解剖学の参考文献16 と、動物研究者が出席する必須コース(FELASA)に提供された文書を使用して、個々の臓器、その結合組織、および/または血管を特定します。- マウスの胴体を固定して、針を使用して臓器の除去を容易にします。恥骨の高さでまっすぐな鋭いはさみを使って腹側正中線切開を行います。鈍い標準鉗子を使用して腹壁を固定し、腹腔を開くために切断します。
- 鈍い鉗子を使用して腹部の臓器除去を可能にするために皮膚を固定化する。心臓または肺を除去するために、乳房洞の方向に内側切断を続ける。細かい鉗子を使用して肺および/または心臓を取り除きます。
- 出血を避けるために乳房腔を慎重に開きます。臓器を切断することなく、それぞれの臓器を固定する結合組織および血管を切断する。
- 組織片を直ちに予冷した金属板(-80°C)に移し、完全に凍結させる。組織片を予冷却チューブに移し、さらなる処理のために-80°Cで保存する(ステップ4.1参照)。
- サンプリングの順序を決定します。
3. 生物材料加工
注:eCB / eiCの共抽出には、抽出チューブとして2 mLのアンバーチューブを使用し、各チューブに7つの予冷鋼球を追加します。PL/eCBの共抽出、および脂質とRNAの二重共抽出には、セラミックビーズでスパイクした2 mLのRNAseフリー抽出チューブを使用してください(材料表)。
- 脳解剖および末梢器官処理を行う。
注:解剖のための脳の視認性を高めるために拡大ランプを使用してください。- 超微細な先端を持つ鉗子を含む手術器具を、70%エタノールで2倍に清掃する。
- 凍結した脳を-80°Cから予冷した生理学的緩衝液(pH5.5)を含むシャーレに移し、シャーレが4°Cであることを確認する。 解剖を可能にするために、脳が完全に凍結解除されるようにします。鉗子を使用して慎重にテストします。
注意: 脳を解凍に必要な時間を超えて 4 °C に保たないでください。 - 氷(4°C)上の金属板を予冷し、氷冷生理学的緩衝液(pH5.5)に浸した湿組織で覆い、腹側を上にして脳を氷上の予冷却(4°C)金属板上に慎重に移す。氷冷生理学的緩衝液(pH 5.5)に浸したウェットティッシュで覆う。
- 超微細先端鉗子を用いて最大5分以内に脳領域を解剖する。視床下部(HYP)から始めて、背側を上に回して右側に進みます。海馬(HCr)、前頭前野(PFCr)、線条体(STRr)、および大脳皮質(cCTXr)を単離する。次に、左側を解剖します。海馬(HCl)、前頭前野(PFCl)、線条体(STRl)、および大脳皮質(cCTXl)を単離する。小脳と視床領域を解剖する。脳領域の同定には、公表された解剖学的参考文献16,17を使用してください。
- 解剖した各片を、アルミ箔で覆われた予冷金属板(-80°C)に直接移します。凍結を可能にし、単離された脳領域を標識された予冷2mLチューブに移す。
- 組織粉砕機を用いて組織片を粉砕し(-80°Cで)、組織の融解を避ける。冷蔵室では、組織粉末をセラミックビーズまたは鋼球を含む標識された予冷抽出管にアリコートする。デュアルリピドミクス/トランスクリプトミクス分析では、低温室で組織粉末アリコートを計量します。リピドミクスのみの分析の場合は、組織重量またはタンパク質含有量への正規化のいずれかを選択します。後者の場合は、組織計量を行わずにさらに進めます。
- 末梢器官組織を最大重量20mgで細かく切断する。ステップ3.1.6のように組織粉砕を進める。
- 組織サンプルの抽出を続行するか(ステップ4.1.1、4.1.3、または4.1.5を参照)、後で抽出するためにチューブを-80°Cで保存します。
注:脳マトリックスは、研究デザインが許す限り、使用することもできます。しかしながら、この方法は、離散的で限られた数の脳領域に対してより適しており、設定された時間枠内で上記の脳領域のすべてを解剖および単離することは実用的ではない。
- 脳パンチングを行います。
- 凍結した脳全体をクライオスタットの取り付けシステム(材料表)に取り付けます。厚さを50μmに設定し、関心領域の近くでトリムモードでスライスします。
- トルイジンブルー(0.1%-1%)を基準として使用して脳スライス(18−20μm)を染色し、目的のサブ領域を局在化させる。顕微鏡を用いて染色されたスライスを検査し、打ち抜く関心のある領域を特定する。マウスアトラスを参考にして、適切な脳解剖学的領域を見つけます16。予冷チューブのサンプルコアラーを使用して、直径0.8-1.0mmのパンチを取ります。
- 冷凍パンチを、セラミックビーズまたはスチールボールを含むラベル付き、予冷された2mL抽出チューブで冷蔵室内で秤量する。eCBとeiCsの共抽出には琥珀色のチューブを使用してください。
- 抽出を開始するか(ステップ4.1.1、4.1.3、または4.1.5を参照)、またはチューブを-80°Cで保存してさらに抽出します。
- プラズマ処理を行います。
- 凍結した血漿サンプルを氷(4°C)の上に置き、それらを解凍(〜20分)させる。
- 抽出を開始する前に、プラズマが完全に凍結されていないことを確認してください。
- 血漿抽出手順を続行します(ステップ4.1.2または4.1.4を参照)。
注:血漿サンプルは、抽出まで-80°Cにとどまる必要があります。解凍と再凍結のサイクルを避けてください。
4. 抽出手順
- 液体 - 液体(LLE)脂質共抽出プロトコルを実行します。
- 脳片、パンチ、または組織粉末サンプルからeCBとeiCの共抽出を実行します。
メモ: 手順全体を通して、正確なピペッティングが必要です。- 組織サンプルと7個の鋼球を入れた抽出チューブを氷上(4°C)に置く。内部標準物質を含む600 μLの氷冷MTBEおよび50 μLのACN/H2O(1:1; v/v)を加える。分析の最終容量(50 μL)中の内部標準物質の標的濃度は以下の通りである:1 ng/mL AEA-d4、125 ng/mL 2-AG-d5、3,000 ng/mL AA-d8、2 ng/mL OEA-d4;PEA-d4, 12.5 ng/mL 1-AG-d5, 2.5 ng/mL PGF2α-d4 および 5 ng/mL (PGD2-d4 用);PGE2-d9;5(S)-HETE-d8;12(S)-HETE-d8;20-HETE-d6、およびTXB2-d4をそれぞれ示す。
- 400 μLの0.1 Mギ酸を加え、組織ライザー(30 s-1分)でホモジナイズする。ホモジネートを4°Cで5,000 x g で15分間遠心分離する。 水下相の凍結を-80°Cで10分間許可し、上部有機相の移動を容易にする。
- 有機相を新しいチューブに移す。37 °C で N2 の穏やかな流れの下で蒸発させ、さらなる分析のために 50 μL の ACN/H2O (1:1; v/v) で再構成します。
- 水相を-20°Cまたは-80°Cで保存し、さらなるタンパク質含量分析を行う。
- 血漿サンプルからeCBとeiCの共抽出を行います。
- 血漿アリコートを4°Cで融解する。 内部標準物質を含む MTBE 800 μL および ACN/H2O (1:1; v/v) を 500 μL 加えます (組織分析に使用したものに類似しています、ステップ 5.1.1 を参照)。参照血漿サンプルを使用してスパイクするための内部標準濃度を最適化します。
- 600 μLの0.1 Mギ酸とボルテックスサンプルを4°Cで2分間加える。サンプルを 4,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。
- 有機相を新しいチューブに移し、37°CでN2 の穏やかな流れの下で蒸発させ、LC/MRM分析のために50μLのACN/H2O(1:1; v/v)で再構成する。
注:可能であれば、eiCsの乾燥抽出物の保存を避け、直ちにLC/MRM分析に進んでください。保管が避けられない場合は、LC注入溶媒中のサンプルを使用して、4°Cでわずか2〜3日間の短時間保管に頼ってください。
- 脳領域、パンチ、または他の組織粉末サンプルからPLおよびeCBの共抽出を実行します。
- 組織サンプルおよびセラミックビーズを含む抽出チューブを氷上(4°C)に置く。内部標準物質を含む MTBE/MeOH 800 μL (10:3; v/v) および MeOH 10 μL を加える。分析の最終量(100 μL)中の内部標準物質の目標濃度は以下の通りである:PC 17:0/14:1、PE 17:0/14:1、PA 17:0/14:1、100 ng/mL PG 17:0/14:1;詩篇17:0/14:1;PI 17:0/14:1;LPC 17:0;LPA 17:0;SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 および 3 ng/mL PEA-d4 それぞれ。
- 25 μM テトラヒドロリプスタチン/URB597 および 50 μg/mL BHT を含む 0.1% ギ酸 200 μL を加えます。組織ホモジナイザー(材料表)で均質化し、5,000 x g および4°Cで15分間遠心分離する。
- 上部の有機相を新しいチューブで回収し、37°CでN2 の穏やかな流れの下で蒸発させる。 90 μL の MeOH で再構成し、-20 °C または -80 °C で保存するか、次のステップに進みます。
- 脂質抽出物のアリコート(4.1.3.3)に10%H2Oを加え、PLs分析のためにLC/MSに10μLを注入する。さらに eCB 分析を行うには、ステップ 4.3.5 に進みます。
- 抽出物のアリコート(4.1.3.3)を取り、蒸発して乾燥させ、ACN / H2O(1:1; v / v)で再構成する。eCB 分析用の LC/MS 注射には 20 μL を使用します。
- 血漿サンプルからPLとeCBの共抽出を行います。
- 血漿アリコートを4°Cで融解し、1,000μLのMTBE/メタノール(10:3;v/v)および内部標準物質を含む10μLのMeOH(ステップ4.1.3に類似)を加え、4°Cで1分間ボルテックスする。
- 250 μLのH2Oとボルテックスを4°Cで45分間加える。 サンプルを5,000 x g および4°Cで15分間遠心分離する。 上部の有機相を回収し、37°CでN2 の穏やかな流れ下で蒸発させ、さらにLC / MS分析のために90μLのメタノール中で再構成する。-20 °C または -80 °C で保存するか、次の手順に進みます。
- PLs分析のために、脂質抽出物のアリコート(4.1.2.2)に10%の水を加える。
- eCB分析のために、脂質抽出物のアリコートに10%の水を加え(4.1.4.3参照)、蒸発乾固させ、50%ACN/H2O(1:1;v/v)で再構成する。
- 組織サンプルからRNAと脂質の二重抽出(PLとeCBの共抽出)を実行します。
警告: RNA の分解を避けるため、必ず RNA フリーの条件下で作業してください。- 組織粉末アリコートまたは脳房を(4°Cで)解凍し、5μM THL/URB597、10μg/mL BHT、および1%βメルカプトエタノール(ホモジナイズバッファーの最終容量の百分率については、ステップ4.1を参照)を含む600μLのRLTバッファーを、凍結脳パンチおよびセラミックビーズを含む抽出チューブに200 μLのクロロホルムとともに加える。
- PLおよびeCB共抽出用の10μLの内部標準混合物でサンプルをスパイクし(ステップ4.1.3を参照)、組織ホモジナイザーを介してホモジナイズします(高速、20秒)。
- 溶解物を新しい遠沈管に移し、全速力および4°Cで5分間遠心分離して相分離を可能にする。
- 標準のRNA抽出手順キット(材料表)を使用してRNA抽出のために上相を回収し、使用する。RNaseを含まない水の全量50 μLでRNAを溶出し、-80°Cで保存する。
注: ステップ 4.1.5.4 のサンプルは、適切な方法とインストゥルメンテーションを使用した RNA シーケンシングと qPCR の両方に適しています。 - 下部クロロホルム含有相を脂質抽出に使用してください。800 μL の MTBE/メタノール (10:3; v/v) と 200 μL の 0.1% ギ酸と渦を 4 °C で 45 分間加えます。 上部の有機相を回収し、37°CでN2 の穏やかな流れ下で蒸発させる。
- 90 μL のメタノールで再構成し、さらに LC/MS 分析を行います。-20 °C または -80 °C で保管するか、手順 5 に進みます。
- 脂質抽出物のアリコートに10%H2Oを加え(上記のステップ4.1.5.6を参照)、PLs分析のためにLC/MSに10μLを注入する。さらに eCB 分析を行うには、ステップ 5.7 に進みます。
- 抽出物のアリコート(上記のステップ4.1.5.6を参照)を取り、蒸発乾固させ、ACN / H2O(1:1; v / v)で再構成する。eCB 分析用の LC/MS 注射には 20 μL を使用します(ステップ 4.3.5 に類似)。
- 脳片、パンチ、または組織粉末サンプルからeCBとeiCの共抽出を実行します。
5. LC/MRM定性的および定量的プロファイリング
- LC溶媒システム、校正溶液、および品質管理サンプルを準備します。
- PLについては、7.5mMギ酸アンモニウムおよび0.1%TEAを含むメタノール/水(1:1;v/v)の移動相Aを調製する。移動相Bを調製する:7.5mMギ酸アンモニウムおよび0.1%TEAを含むメタノール/イソプロパノール(2:8;v/v)。LCボトルに溶剤を保管してください。
- eCBおよびeiC分離のために、以下のLC溶媒を調製する:移動相Aとして0.1%ギ酸、および移動相Bとして0.1%ギ酸を含む100%ACNは、LCボトルに溶媒を保管する。
- 校正標準および内部標準物質(表3)を使用して、等モル濃度またはユーザー定義濃度で品質管理を準備します。
- 7つの濃度ポイントで検量線を作成します。同じ内部標準バッチを使用して、検量線溶液および分析対象のサンプルでスパイクします。
- 定性的および定量的な脂質プロファイリングにはLC-MRM法を使用してください。
- 商用ソフトウェア(アナリストなど)の ビルド取得方法 タブを開き、極性切り替え付きのLC/MRMモードを選択します。イオン遷移を定量的プロファイリングのために( 表3に与えられるように)本方法に設定する。セトリング時間を50ミリ秒に設定します。
- PLsプロファイリングの場合、次のイオン源パラメータを設定します:カーテンガス= 40psi;ソースヒーター温度= 550°C;イオンスプレー電圧 = マイナスイオンモードで-4,500 V、プラスイオンモードで= +5,200 V。
- eCBとeiCsの共分析のために、次のパラメータを設定します:カーテンガス= 40psi;ソースヒーター温度= 550°C;イオンスプレー電圧 = マイナスイオンモードで-4,500 V、プラスイオンモードで = +4,500 V。
- PL 分析では、カラム加熱を 45 °C、流速を 200 μL/分に設定し、次の勾配を設定します。最小3 = 40%B;最小 42 = 90% B;分43 = 99%B;最小 50 = 99% B、最小 52 = 40% B。注入量を 10 μL に設定します。
- eCBおよびeiCs分析の場合、カラム温度を室温に設定し、次の勾配を設定します:最小0 = 20%B;最小 1 = 20% B;最小 5 = 50% B、最小 12 = 50% B;最小 13 = 90% B、最小 17 = 90% B;最小 17.5 = 20% B;分20 = 20% B. 注入量を20μLに設定する。
注:MRM条件は機器プラットフォームによって異なる可能性があるため、フラグメンテーションおよびMRM条件を実験的に推測し、最大の感度と選択性を得るために必要に応じてイオン化パラメータをテストおよび調整する必要があります。
- バッチ分析を実行します。
- ビルド集録バッチを開き、サンプルの説明、オートサンプラーのサンプルラック内の位置、および取得方法(ステップ5.2として設定)に必要なパラメータを入力します。
- 分析の開始時と終了時、およびバッチ内には常に品質管理を含めます。25−30サンプルごとに、バッチ内に少なくとも3つの検量線を含め、すべての品質管理サンプル、検量線、およびサンプルバッチの最後に、選択した溶媒による洗浄ステップを含めます。
- ステップ4で得られたサンプルをLC/MSバイアルに移す。バッチで定義された位置に従ってサンプルをLCオートサンプラーのローディングラックに入れ、LCオートサンプラーにサンプルラックをロードします。
- バッチを送信し、キュー分析を開始します。
- 脂質定量
- eCBおよびeiCs定量化には商用ソフトウェア(Analystなど)と組み込み定量モジュールを使用し、PLs定量には商用ソフトウェア(Multiquantなど)を使用します。
注:2番目のソフトウェアは、特に1つの内部標準が複数の分析物の定量に使用される場合、eCBおよびeiCにも使用できます。 - ビルド定量方法を開き、分析物、内部標準、MRM 遷移のパラメータを入力し、内部標準を定量する分析種に帰属させます(表 3)。最小ピーク高さを 500 cps に設定します。
- 脂質同一性の割り当ておよびその後の定量6のために、以下の基準またはその組み合わせを使用する:脂質内因性分析物と較正標準物質、および/または重水素化内部標準物質(利用可能な場合)との保持時間マッチング;標準が提供されていない脂質分析物の所与のm / zに対する正および負のイオンモード断片化による断片イオンマッチング;異性体および/または異圧構造を解剖するために同様に採用されたLC条件下での脂質の文献推定溶出挙動;また、利用可能な場合は、標的分析(LC/MRMを使用)と同様のLC条件を使用して、高分解能質量分析によるLC/MSおよびMS/MS分析を行い、目的の内因性脂質の同一性および溶出挙動を正確に同定します18,19。
- バッチ分析の検証には、次の基準を使用します:定量化の精度≤ ±20%;回帰係数≥0.97(理想的には≥0.99)です。
注: バイオ分析法の開発と検証に関するガイドラインに従って、標的分子の信頼性と再現性のある分析を保証します。
- eCBおよびeiCs定量化には商用ソフトウェア(Analystなど)と組み込み定量モジュールを使用し、PLs定量には商用ソフトウェア(Multiquantなど)を使用します。
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Representative Results
記載されたプロトコルのセットは、動物モデルの選択、サンプリングの経路、抽出およびプロファイリングの方法など、目的に固有の方法で異なるレベルで組み合わせることができる(図1)。
急性てんかん発作状態の経時変化に伴う脳および末梢の脂質レベル変化を決定し、PEAの潜在的な抗てんかん効果13 および脳および末梢のリピドーム変化への影響を解明するために、3つの実験動物群をビヒクル、急性てんかんを誘導するKA、抗てんかん薬候補としてPEAで処理した。PEAは、KA注射の前にi.p.を介して投与された(例えば、急性治療のための単一のPEA注射および亜慢性治療のための2つのPEA注射)。治療後5日目の多重分子解析および/または免疫組織化学染色を目的として、必要に応じて動物実験を繰り返した(図2)。
急性てんかん発作のKA誘導は、注射後1時間で最大発作強度をもたらす15(図3)。最大発作強度の状態における脳および末梢脂質レベルの変化を解明するために、マウスをKA注射後1時間で屠殺し、続いて血漿、脳、および末梢器官サンプリングを行った。凍結した脳を6つの脳領域で解剖した(ステップ3.1参照)。脳領域および末梢器官(心臓および肺)組織を粉砕して均質な組織サンプルを得、続いて、eCBおよびeiC(図4Aおよびステップ4.1.1)ならびにPLおよびeCB(図4Bおよびステップ4.1.3)の2つのリピドミープロファイリングのために小分けした。
二重抽出プロトコル(ステップ4.1.5を参照)を適用して、視床下部(HYP)、側底扁桃体(BLA)、腹側(vHC)および背側(dHC)海馬(図5)の脳パンチからのプロファイリングを介して、より高い空間分解能でPL / eCBおよびRNAを実行した。KA注射後1時間で最大発作状態にあるKA誘導てんかんマウスおよび対照マウスからパンチをサンプリングした(ステップ3.2参照)(図2)。
てんかんおよびPEAによる新しいてんかん治療時の神経変性の程度および脂質変化を評価するために、亜慢性PEA治療を受けていないマウス(中央)、亜慢性PEA治療(右)、および生理食塩水注射マウス(図6)において、KA誘発てんかん発作の5日後5日間サンプリングされた脳切片(ステップ1.3を参照)に対して免疫組織化学的二重染色を行った(図2)。).KA誘発状態てんかん重積(SE)は、主に海馬のCA1、CA3、およびヒルス領域においてNeuNシグナルの大規模な損失を引き起こし、カスパーゼ−3(CASP3)シグナルによって示されるアポトーシス事象を伴った(図6、中央画像)対照(図6、左画像)。亜慢性PEA治療(右の画像)は、神経核タンパク質(NeuN)シグナルを顕著に保存したが、(CASP3)シグナルはほとんど検出できない。
| KA および SAL 注射溶液。 |
| KA注射液(最終容量8mL): |
| 1. 15 mL チューブに 24 mg KA の重量を量る (注意: グロスとマスクを着用してください) |
| 2. 8 mLの生理食塩水と渦を10分間加える |
| 3.インターデディネートストレージのために4°Cに保ちます |
| 4.注射前に室温と渦に再調整する |
| ビヒクル1注射液(最終容量8mL): |
| 手順 1 をスキップして、手順 2 ~ 4 に進みます。 |
表1:発作誘発薬の調製およびビヒクル1適用。 終濃度30mg/kgの腹腔内注射24回(10mL/kg)用のカイニン酸(KA)注射液および対応するビヒクル注射液(ビヒクル1)1を調製する工程。
| エンドウ および サル/DMSO/クレモフォア(18:2:1、(v/v/v)) 注射溶液。 |
| エンドウ豆注射溶液(最終容量8mL): |
| 1. 15 mL チューブに 32 mg PEA の重量を量る |
| 2. 0.4 mL DMSO とボルテックスを 10 分間加える |
| 3. 3.4 mL の SAL と 5 分間ボルテックスを加えます。 |
| 4. 36°Cで5分間の超音波処理混合物 |
| 5. 0.4 mLのクレモフォールとボルテックスを5分間加える |
| 6. 36°Cで1分間超音波処理し、3.4mLのSALを加える |
| 7. 30秒間の渦と36°Cで3分間超音波処理 |
| 8.注入前にシェーカーとボルテックスで低速で溶液を36°Cに保ちます |
| ビヒクル2注射液(最終容量8mL): |
| 手順 1 をスキップし、手順 2 ~ 8 に進みます。 |
表2:抗てんかん薬の調製およびビヒクル2適用。 最終濃度40mg/kgの腹腔内注射24回(10mL/kg)用のパルミトイルエタノールアミド(PEA)注射液および対応するビヒクル注射液(ビヒクル2)を調製するための例示されたステップ1。
| 陽イオンモード | ||||||
| 選択された校正標準PL | 対応する社内基準 | |||||
| 分析物 | 前駆体イオン | 製品イオン m/z | 分析物 | 前駆体イオン | 製品イオン m/z | |
| 名前 | メートル/z | 名前 | メートル/z | |||
| ティッカー | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| ティッカー | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| エンドウ | 300.2 | 62.1 | エンドウ豆-d4 | 304.2 | 62.1 | |
| パソコン 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | パソコン 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| パソコン 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| パソコン 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| マイナスイオンモード | ||||||
| 選択された校正標準PL | 対応する社内基準 | |||||
| 分析物 | 前駆体イオン m/z | 製品イオン m/z | 分析物 | 前駆体イオン | 製品イオン m/z | |
| 名前 | 名前 | メートル/z | ||||
| 単三 | 303.05 | 259.1 | AA-d8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-ヘテ | 319.48 | 115 | 5(S)-ヘテ-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-ヘテ | 319.48 | 155 | 12(S)-ヘテ-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(S)-ヘテ | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-ヘテ | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-ヘテ | 319.48 | 231 | ||||
| 20-ヘテ | 319.48 | 289 | 20-ヘテ-D6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 · | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| ティッカー | 369 | 169 | ティッカー TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| ティッカー | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| ティッカー | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| シプシズ 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | シプシズ 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| 詩篇36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| 詩篇38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
表3:標的リピドミクス分析のための脂質標準およびMRM遷移。 表の内容はもともとLernerらで公開されました。
図 1: ワークフロー モジュールの概要 研究の目的とサンプリングのさまざまなルートに応じて、抽出とプロファイリングを組み合わせて、研究の重要な結果を得ることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスにおける急性カイニン酸(KA)誘発てんかん発作モデルの実験計画。 マウスは、1)生理食塩水(10mL / kg i.p.)で処置されるかのいずれかである。2) KA (30 ミリグラム/キログラムのi.p.);および/または3)(サブ)潜在的な抗てんかん化合物パルミトイルエタノールアミド(PEA)で慢性的に前処理(1−2x 40mg / kg i.p.)された。1群あたり24匹のマウスを上記のように処置し、発作強度を評価するために行動をスコア化した。1群6匹のマウスを4つの異なる時点(T1−T4)のそれぞれで屠殺し、脳、末梢器官、および血漿における急性てんかん発作状態の経時変化にわたる脂質レベル変化を決定した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:急性カイニン酸(KA)誘発てんかん対対照の経時的経過にわたる行動スコアリング。KA発作誘発後180分(n=24)または生理食塩水注射(n=24)の経時的経過にわたる発作強度の評価を平均行動スコアとして与えた。車両1と車両2の注入群との間に差は認められなかった。ANOVA反復測定は、測定値の時点と試験群との間に有意な相互作用をもたらし、行動スコアに対するKA処理の有意な効果を示した。KA処置マウスの発作強度は、もともとPostら13に掲載されたこの図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図4:急性てんかん発作状態における脳および末梢組織の脂質レベル。脂質レベル変化は、6つの脳領域(n=9)にわたる最大発作強度(例えば、KA注射後1時間)におけるSEM±平均値として提示される:大脳皮質(cCTX)、線条体(STR)、視床領域(THL)、海馬(HC)、視床下部(HYP)、小脳(CER)、ならびにKA誘発てんかんマウスにおける心臓および肺組織(上限値)および対照(下限値)。組織中の基礎脂質レベルは灰色で描かれている。PL、2-AG、および AA の値は nmol/g で、NAE、eiC、および AEA の値はそれぞれ pmol/g で示されます。すべての脂質レベルは、組織重量に対して正規化される。特定の分子変化を強調するために、KA処置マウスの脂質レベルは、対照と比較して急性発作強度で減少した値を示すヒートマップにおいて、生理食塩水注入(KA/sal)のパーセンテージとして表され、対照と比較して増加したレベルがそれぞれ赤色で示されている。それらはp値<0.05で有意であると考えられる。これらのデータはもともとLerner et al.2に掲載されたものです.2この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図5:マウスの脳パンチからの定量的プロファイリングのためのeCB/PLおよびRNAの二重抽出。 (A)選択されたPLおよびeCBの定量的分布:1)視床下部(HYP)のサブ領域;2)基底側扁桃体(BLA);3)海馬の腹側(vHC)および背側(dHC)部分領域を、KA誘発てんかん発作マウス(上限値)対対照(下限値)から(n=10)する。レベルは組織重量(パンチは約0.5−1.5mgに相当)に正規化され、nmol/gで表される。AEA のみが pmol/g で表されます。脂質レベルはSEM±平均値として提示される。 パンチされた脳領域ごとの平均変動(SEMは平均の割合として、すべての脂質にわたって平均化される)は:HYP = 7.83%;BLA = 7.80%;vHC = 6.28%;dHC=7.90%とそれぞれである。(B)CAR誘発てんかん発作(赤色)および対照(薄い灰色)を受けたマウスの異なる脳領域/部分領域におけるmRNAレベルで調査された脂質シグナル伝達に関与する内因性酵素および受容体の相対的発現レベル、ならびに脳活動のマーカー。グループ平均間の差の統計分析は、両側不対応スチューデントのt検定を使用して実施し、p値<0.05(n = 10)で有意であると考えました。これらのデータはもともとLernerらで公開されました.7この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図6:免疫組織化学的NeuNおよびCASP3二重染色。 KA注射後5日目の免疫組織化学を、未処置生理食塩水注射マウス(左)、慢性的にPEA前処置マウス(中央)、および前処置なしのてんかんマウス(右)の脳切片について行った。PEA前処理は、未治療のてんかんマウス(n=3)と比較して神経保護効果を示す。これらのデータはもともとPostらで公開されました。al.13この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する神経リピドミーおよびトランスクリプトーム方法論は、脳および末梢器官におけるあらゆる疾患または健康な発達を高および低空間分解能で調査するための実行可能な手段である。最適化された血漿サンプリングおよび取り扱い手順により、組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクスのために屠殺されたのと同じ動物から血漿リピドミクス分析を行うこともできるため、組織血液分子相関およびバイオマーカー発見の信頼性が向上する。3つのプロトコルまたはそれらの組み合わせのいずれかの適用による広範なデータセットの提供は、文脈(動物モデル実験)内の神経学的疾患だけでなく、実験モデルコンテキスト全体および実験モデルコンテキスト間でも調査する価値がある。さらに、サンプリング、処理、分子分析の高度な標準化により、分子データの再現性が高くなり、研究や研究室内および研究や研究室内の分子変化を確実に参照できます。
しかし、これを達成するためには、定義された研究目標に対して最大の読み出し可能性を提供する実験計画のセットアップが重要です。実験群間の分子変化の信頼できる比較を達成するためには、動物の変動性と脂質レベルの生物学的範囲を補うために最低10匹の動物を使用することが推奨される。動物の調達および/または動物の取り扱いの物流が制限されている場合、信頼できる統計分析を行うためには、1グループあたり最低6匹の動物を使用することが不可欠です。グループサイズの計算は、モデル関連の死亡率を補う必要があります(すなわち、モデルの死亡率の可能性にもかかわらず、グループごとに最低6匹、理想的には10匹の動物が必要です)。重要な要件は、実験グループごとに年齢、性別、および系統が一致した動物を確実にすることです。発見段階では、動物バッチ間の行動的および分子表現型の違いの可能性による所見の偏りを避けるために、すべての研究および可能であれば同じ動物バッチに対して実験動物に同じ提供者を使用することが不可欠である。研究で決定された分子および行動表現型の信頼性および再現性を確保するためには、可能な限り生物学的複製解析を実施することが重要である。
もう一つの重要なステップは、動物群との標準化されたスケジュールされた実験作業を設定することです。概日分子変動を回避するために、その日の同じ時間枠内で動物を治療することが不可欠です。1日の時間は、標的分子の合成および分解に対する概日リズムの既知の影響に従って設定するか、概日リズム効果に関する情報が入手できない場合は、すべての実験群で一貫して維持されるべきである。同様に、動物の犠牲になる前の飼育条件と給餌条件は、実験モデル全体で一貫して維持され、厳密に管理されなければならない。これは、脂質血漿および組織代謝に対する栄養の影響によるリピドミープロファイリングに特に関連している。治療薬または疾患誘発薬の投与は、常に対照群におけるビヒクル投与と並行して実施されるべきであり、それによって、ビヒクルは、薬物投与に使用されるものと同じでなければならない。研究の目的に最も適したげっ歯類株および/または亜株を選択するために、薬物ベースの治療戦略は、投与時間および頻度、用量および投与経路、ならびに文献および/または以前の経験から推測される異なる系統の薬物に対する特定の感受性に関する薬物特異性に従って実施されるべきである。大規模なコホートグループまたは複数の動物グループを含む疾患および治療に対する反応の経時変化調査は、治療、犠牲、およびサンプリングの観点から1日で実施することは不可能です。このような場合、動物群の処理は連続した日に予定して実施する必要がありますが、時刻、実験計画、処理時間、研究者などについては同じ条件を維持してください。化学薬品注射剤の調製は、もう一つの重要なステップです。薬物または疾患誘発性化合物は、投与前に、および薬物仕様に従って新たに調製されなければならない。比較するすべてのコホートには、薬物の同じ生産バッチの使用が推奨される。これは、てんかん誘導のための本研究で使用されたカイニン酸(KA)などの天然化合物製剤の場合に特に重要である。
信頼性の高いリピドミクスおよびトランスクリプトームプロファイリングを可能にするために、動物犠牲化手順は、5分の時間枠内で動物群全体で一貫して実行されなければならない。断頭後に血液を採取する場合は、ガラスチャンバー内に一定量のイソフルランを維持することが重要です。この目的のために、不整脈および動悸の発症を避け、血漿サンプリングのための適切な血圧を確保するために、イソフルランを使用して麻酔の期間中、イソフルランで頻繁に(5回の使用後に)浸し、10秒を超えないようにしてください。
生物材料のサンプリングおよび取り扱いのための条件(例えば、生物学的材料のサンプリングおよび取り扱いの時間枠および順序)は、厳密に遵守され、すべてのグループについて同一に維持されなければならない。組織融解の程度が変動し、したがって脂質および/またはmRNAレベルのエキソビボ組織変化の一貫性のない状態を回避するには、ポストサンプリングのための厳密に制御された時間と温度条件を維持することが不可欠です。
貯蔵。組織解剖またはパンチング、ならびにその後のサンプル処理および分析(セクション3および4を参照)。実験動物群のサイズが動物の犠牲、除去、および解剖を可能にする場合、これらの手順のそれぞれについてここに示されている時間枠を変更することなく、新しくサンプリングされた全脳を、事前のスナップ凍結なしで予冷金属板(4°C)上で直ちに解剖することができる。実験群のサイズがこれらの手順で実用的でない場合は、脳のスナップ凍結とその後の解剖が推奨され、処理のための同等かつ制御された時間を可能にする。ここに示したプロトコルおよびタイムラインガイドラインに厳密に従った場合、新しく解剖された脳領域の抽出によって得られた分子レベルと凍結脳から解剖された脳領域との間に矛盾は観察されなかった。
厳密に制御された温度条件下でのサンプル処理とは別に、グループ内およびグループ間の脂質レベルの再現性および最小変動性を達成するための重要な側面は、抗酸化物質の提供である(セクション2および3を参照)。eCBなどのニューロン活動に関与する多くの脂質がストレスに応答して急速に変化する可能性があるため、犠牲にする前に動物のストレス要因(例えば、血液の匂い)を避けることが最も重要である。
脂質の抽出および分析のためには、抽出の日に内部標準物質、較正溶液、および抽出溶媒を新たに調製することが不可欠である。検量線の作成とサンプル抽出の両方に同じ内部標準物質源を使用する必要があります。また、サンプルの抽出、保存、および分析のために厳密に制御された温度条件に従うことは、分子のエクスビボ酵素的または化学的変化を最小限に抑え、制御するために最も重要です。LC/MRM分析では、新しい脂質セットの分離、検出、およびMRM遷移が最適化されていれば、ターゲットおよびそれに対応して内部標準物質およびキャリブラントを追加または削除することにより、標的脂質のセットを研究目的に合わせて調整できます。提示された抽出プロトコルは、eCBおよびeiCに対して2つのLC/MRM反復を提供することを可能にするが、これは技術的障害の場合または反復分析が研究にとって重要である場合に有用である。PL抽出プロトコルは、抽出ごとに少なくとも10回の分析に適したサンプル/抽出量を提供します(例えば、前駆体イオンおよび中性損失スキャン2に基づく複数のスキャン実験2、追加のLC/MRM分析、または実行中の技術的障害を補うためのLC/MRM複製)。脂質分析はLC/MRMに限定されません。実際、これらのプロトコルのいずれかで得られた脂質抽出物は、控えめなハイエンドの質量分析に適しています。脳パンチまたは離散領域(3mg未満)から得られた微小量の組織を除いて、2−3mgを超える領域の凍結粉砕組織は、複製分析および/または組織粉末に適合する他の調査のために、ここで説明されているように、複数の抽出モジュールに小分けして使用することができる。
一般的に使用されるものと比較して、ここで説明するプロトコルの一般的な利点は、動物資源、消耗品、および分析コストの支出を減らしながら、マルチ化合物抽出および分析の全体的な時間効率および感度が向上することです。重要なことに、二重脂質/mRNA抽出プロトコルは、対応する利用可能な標準プロトコルと比較して、mRNA抽出の効率20,21とmRNAの完全性を高め、同時に脂質抽出の効率を高めます7。これは、二重に抽出された場合に脂質およびmRNA画分のそれぞれに対するマトリックス効果が低下したためにも起因する可能性が高い。このため、この方法は、脳パンチなどの高空間分解能プロファイリングに容易に適用可能である。
しかし、プロトコルの現在の制限は、炎症性脂質が二重脂質/ mRNA抽出を用いた分析および定量に適さないことである。したがって、プロトコルはさらなる改良の対象となります。この目的のために、組織および血漿炎症性脂質およびエンドカンナビノイドを共抽出および共分析することができ、これは神経炎症過程およびエンドカンナビノイド調節ニューロン活性を同時に調査するための最適化されたツールである(eiCおよびeCBの共抽出を参照)。この後者のアッセイにおけるリン脂質の包含は、実現可能であると予想される。
神経疾患に対する前向きなマルチオミックアプローチの観点から、脂質抽出プロトコールの後に得られたタンパク質画分のプロテオミクス解析(すなわち、eCBおよびeiCsの共抽出、ならびにPLおよびeCBの共抽出)が実現可能であると予想される。しかし、これはデュアル脂質/mRNAプロトコルを使用する場合にはまだ不可能です。後者の場合、抽出の化学的環境は、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)などの標準的なタンパク質アッセイを用いたタンパク質量決定さえも妨げる。この制限を克服し、これらのプロトコルにプロテオミクスプロファイリングを含めることを早めるためのさらなる開発が計画されています。
ここで説明したモジュラープロトコルを使用して、急性てんかん発作の動物モデルにおけるeiC、eCB、およびPLの脳領域マップを達成することができました(図4)。このプロトコルは、KA誘発性急性発作を有する治療マウスおよび未治療マウスにおけるeiCsによる炎症過程の海馬調節およびeCBによるニューロン活性調節を示した13。急性てんかん発作状態におけるリン脂質、エンドカンナビノイド、およびmRNA変化の亜局所脳局在もそれぞれ観察された(図5)。これらの結果は、脳領域およびサブ領域におけるてんかんなどの複雑な神経学的疾患の調節に関与する広範囲の脂質に関する知識を進歩させる上で、ここで記載された方法の価値および適用可能性を強調する。これらのプロトコルは、神経学的疾患の調査およびそれ以降において一般的な適用性を有するが、細胞集団に対するプロトコルおよびアプリケーションのさらなる開発が継続している。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この記事は、エルメリンダ・ロマッツォ博士に捧げます。この原稿の完成中に、エルメリンダ・ロマッツォ博士が亡くなりました。彼女は科学への情熱と、有意義な研究目的を果たすためのチームワークへの無私の関与の具現化です。彼女は常に人間のより大きな幸福に有意義に貢献することを夢見ていました。彼女の善良な性質は、科学と生命の激しい道によって決して損なわれませんでした。彼女は私たちの心の中で、そして永遠に、かけがえのない存在であり続けるでしょう。
Julia M. Postは、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツの大学医療センターのFocus Program for Translational Neuroscience(FTN)から資金提供を受け、現在はLBへのSPP-2225 EXITプロジェクトから資金提供を受けています。これらの研究のための部分的な資金は、リピドミクスコアファシリティ、生理化学研究所、およびヨハネスグーテンベルク大学マインツの大学医療センターから(LBへの)壁内資金によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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