この記事では、炎症およびニューロン活性の根底にある脂質、膜脂質、下流メッセンジャー、および脂質機能の根底にあるmRNAコード酵素/受容体を標的とする神経疾患マウスモデルにおける組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクス、および血漿リピドミクスのためのモジュラープロトコルを提示する。サンプリング、サンプル処理、抽出、および定量の手順が概説されています。
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この記事について
サマリー
要約
脂質は、神経学的疾患を助長する脳の侮辱または刺激に対する主要なインターフェースとして機能し、疾患の発症および進行を強調することができる様々なシグナル伝達またはリガンド機能を有する脂質の合成のための貯蔵庫である。多くの場合、未症候性レベルで変化する脂質は、薬物標的およびバイオマーカーの新たな供給源である。多くの神経学的疾患は、神経炎症、神経変性、および神経細胞興奮性を共通の特徴として示し、部分的には特定の脂質シグナル伝達系によって調節される。様々な脂質の合成の相互依存性および相互関係は、神経学的文脈の共通性および特異性を導き出し、疾患の発症および進行の機構的側面の解明を促進するために、多脂質、多酵素、および多受容体分析を促す。脂質の役割を異なる脳領域に帰属させることは、神経学的疾患に関連する脂質分子表現型および形態の決定を前進させる。
ここでは、膜脂質および下流脂質シグナルの分析に適したモジュラープロトコルを、その機能の根底にある酵素およびメディエーターのmRNAとともに、特定の神経学的疾患および/または状態に関連する個別の脳領域から抽出する。正確な比較リピドミープロファイリングを確実にするために、ワークフローと操作基準は、i)関心領域の脳サンプリングと解剖、ii)複数の脂質シグナルと膜脂質の共抽出、iii)二重脂質/mRNA抽出、iv)液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング(LC / MRM)による定量、およびv)標準mRNAプロファイリングのために最適化され標準化されました。このワークフローは、機能的に離散的な脳サブ領域のサンプリング(すなわち、脳パンチングによる)によって得られる低組織量に対して順応性であり、したがって、組織の不均一性および/または動物の変動性による多分子分析におけるバイアスを防止する。神経疾患の末梢結果を明らかにし、神経学的疾患状態の翻訳分子読み出しを確立するために、末梢器官サンプリング、プロセシング、およびその後のリピドミクス分析、ならびに血漿リピドミクスも追求され、記述される。このプロトコルは、急性てんかんマウスモデルで実証される。
概要
近年の脂質の機能の進歩と神経疾患の発症・進行における脂質の役割は、新たな治療標的や疾患メカニズム解明の新たな研究開発の場を切り拓いています1。質量分析イメージングや高度な質量分析プロファイリングなどの現代の分子イメージング技術によって強調された、異なる脳領域における脂質組成の文書化された違いは、脂質調査のパラダイムを全脳から機能的に別個の脳領域へとシフトさせる。脂質組成が異なる脳領域で変化するという事実は、機能的に異なる脳領域にわたる脳の侮辱または刺激に応答して、膜脂質感受性および下流脂質シグナル伝達の両方の新しい概念化を促す。したがって、脂質プロトコルは、より高い空間分解能の検出および定量化のための低組織量の課題に対処するための新しい開発を必要とし、同時に、細胞膜およびシグナル伝達経路の複数の脂質成分の分析を必要とする。また、それらのレベルおよび機能の調節に関与する酵素、脂質リガンド、および受容体の決定は、神経学的疾患において影響を受けるシグナル伝達経路を解明し、病態生理学的文脈における新しい機構的研究を導くために最も重要である。
脳の空間分解能の向上に加えて、新しい神経リピドミーアプローチの開発に挑戦する2つの大きな困難があります。第1に、脂質シグナル伝達分子は、典型的には、膜構成脂質と比較して非常に低い存在量のものである。第2に、リピドームは高い構造的不均一性を示し、単一の分析アプローチを用いて解剖することは困難である。し....
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プロトコル
ここに記載されているすべての実験手順は、2010年9月22日の欧州共同体理事会指令(2010/63EU)に準拠しており、ドイツのラインラントプファルツ州の地元の動物委員会によって承認されました(ファイル参照:23 177-07/G16-1-075)。
1. 急性および予防的に治療されたKA誘発てんかんの動物モデル
- 発作誘発、治療、および行動スコアリングを実行する。
- 別々のマウス(1群あたり最小n=6匹のマウス)を単一のケージに入れる。
- 発作誘導注射液および対応するビヒクル(表 1参照)、ならびに治療用注射液および対応するビヒクル( 表2参照)を調製する。
- マウスの腹腔内(i.p.)(10mL/kgマウス体重)を、疾患、治療済み、またはビヒクル治療済み(すなわち、KA、PEA処理KA、および2つのビヒクル群)のグループの同一性に従って麻酔なしで注射する。 図 2、表 1、および 表 2 を参照してください。
- 次の標準化された発作強度スケールに従って行動を監視し、スコアリングする:0 = 応答なし;1 = 不動と凝視;2 = 前肢および/または尾の伸展、硬い姿勢;3 = 反復的な動き、頭....
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結果
記載されたプロトコルのセットは、動物モデルの選択、サンプリングの経路、抽出およびプロファイリングの方法など、目的に固有の方法で異なるレベルで組み合わせることができる(図1)。
急性てんかん発作状態の経時変化に伴う脳および末梢の脂質レベル変化を決定し、PEAの潜在的な抗てんかん効果13 および脳および末梢のリピドーム変化への影響を解明するために、3つの実験動物群をビヒクル、急性てんかんを誘導するKA、抗てんかん薬候補としてPEAで処理した。PEAは、KA注射の前にi.p.を介して投与された(例えば、急性治療のための単一のPEA注射および亜慢性治療のための2つのPEA注射)。治療後5日目の多重分子解析および/または免疫組織化学染色を目的として、必要に応じて動物実験を繰り返した(図2)。
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ディスカッション
ここで説明する神経リピドミーおよびトランスクリプトーム方法論は、脳および末梢器官におけるあらゆる疾患または健康な発達を高および低空間分解能で調査するための実行可能な手段である。最適化された血漿サンプリングおよび取り扱い手順により、組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクスのために屠殺されたのと同じ動物から血漿リピドミクス分析を行うこともできるため、組織血液分子相関およびバイオマーカー発見の信頼性が向上する。3つのプロトコルまたはそれらの組み合わせのいずれかの適用による広範なデータセットの提供は、文脈(動物モデル実験)内の神経学的疾患だけでなく、実験モデルコンテキスト全体および実験モデルコンテキスト間でも調査する価値がある。さらに、サンプリング、処理、分子分析の高度な標準化により、分子データの再現性が高くなり、研究や研究室内および研究や研究室内の分子変化を確実に参照できます。
しかし、これを達成するためには、定義された研究目標に対して最大の読み出し可能性を提供する実験計画のセットアップが重要です。実験群間の分子変化の信頼できる比較を達成するためには、動物の変動性と脂質レベルの生物学.......
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開示事項
著者らは利益相反がないと宣言しています。
謝辞
この記事は、エルメリンダ・ロマッツォ博士に捧げます。この原稿の完成中に、エルメリンダ・ロマッツォ博士が亡くなりました。彼女は科学への情熱と、有意義な研究目的を果たすためのチームワークへの無私の関与の具現化です。彼女は常に人間のより大きな幸福に有意義に貢献することを夢見ていました。彼女の善良な性質は、科学と生命の激しい道によって決して損なわれませんでした。彼女は私たちの心の中で、そして永遠に、かけがえのない存在であり続けるでしょう。
Julia M. Postは、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツの大学医療センターのFocus Program for Translational Neuroscience(FTN)から資金提供を受け、現在はLBへのSPP-2225 EXITプロジェクトから資金提供を受けています。これらの研究のための部分的な資金は、リピドミクスコアファシリティ、生理化学研究所、およびヨハネスグーテンベルク大学マインツの大学医療センターから(LBへの)壁内資金によって提供されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI7300 リアルタイム PCR サイクラー | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| アセトニトリル LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | 溶剤/LCMS |
| 琥珀色 エッペンドルフチューブ | エッペンドルフ | サンプル調製 | |
| Analyst 1.6.2 ソフトウェア | AB SCIEX, ダルムシュタット | ソフトウェア | |
| 分析天びん | メトラー・トレド | 計装/サンプル調製 | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (ブレダ、オランダ) | 装置/サンプル調製 | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy Cryostat |
| , Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL オートサンプラー | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | サンプル調製 |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | 装置/サンプル調製 |
| ファイン鉗子ミラーフィニッシュ | FST | 11412-11 | 手術器具 |
| 細かい虹彩はさみ まっすぐで鋭い | FST | 14094-11 | 手術器具 |
| 細かいはさみ 炭化タングステンストレート | FST | 14568-09 | 手術器具 |
| 虹彩へら | FST | 10094-13 | 手術器具 |
| カイニン酸 | Abcam | ab120100 | てんかん薬 |
| 脂質表示ソフトウェア | AB SCIEX, ダルムシュタット | ||
| ソフトウェア LPC 17:0 | アヴァニス ポラリス | 855676P | 脂質標準 |
| LPC 18:0 | アヴァニス ポラリス | 855775P | 脂質 |
| 標準 ルナ 2,5µm C18(2)- HAST 100A LCカラム | Phenomenex | 00D-4446-B0 | 計装/LCMS |
| 拡大ランプ | Maul GmbH | 計装/サンプル調製. | |
| メタノール LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/ |
| LCMS MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | インスツルメンテーション/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | アバニスポラリス | 840857P | 脂質標準 |
| PA 17:0-14:1 | アバニスポラリス | LM-1404 | 脂質標準 |
| パルミトイルエタノールアミド | バイオモール | Cay90350-100 | 脂質標準パル |
| ミトイルエタノールアミド-d5 | バイオモール | Cay9000573-5 | 脂質標準 |
| PC 16:0-18:1 | アバニスポラリス | 850457P | 脂質標準 |
| PC 16:0-18:1 | アバニスポラリス | 850457P | 脂質標準 |
| PC 17:0-14:1 | アバニスポラリス | LM-1004 | 標準 |
| PE 16:0-18:1 | アバニスポラリス | 850757P | 脂質標準 |
| PE 17:0-14:1 | アバニスポラリス | LM-1104 | 標準 |
| PG 16:0-18:1 | バニスポラリス | 840457P | 脂質標準 |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | 機器/サンプル調製。 | |
| Precellys Keramik-Küゲルヒェン | Peqlab | 91-pcs-ck14p | サンプル調製。 |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | サンプル調製。 |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | サンプル調製。 |
| プロスタグランジンD2 | Biomol | Cay 12010 | 脂質標準 |
| プロスタグランジンD2-d4 | Biomol | Cay 312010 | 脂質標準 |
| プロスタグランジンE2 | Biomol | Cay10007211-1 | 脂質標準 |
| プロスタグランジンE2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | 脂質標準 |
| PS 17:0-14:1 | アヴァニスポラリス | LM-1304 | 脂質標準 |
| Qトラップ5500トリプル四重極リニアイオントラップ MS | AB SCIEX | 装置/LCMS | |
| リアルタイムPCRシステム | アプリケーション バイオシステム | 装置/qPCR | |
| レゾルビン D1 | Biomol | Cay10012554-11 | 脂質標準 |
| Rneasy ミニキット - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| 警備員 プレカラム | フェノメネックス | 計装/LCMS | |
| シャンドン カバープレート | サーモフィッシャー | 72110017 | 顕微鏡 |
| シャンドン スライドラックと蓋 | サーモフィッシャー | 73310017 | 顕微鏡 |
| SM 18:0 | アヴァニス ポラリス | 860586P | 脂質標準 |
| SM d18:1/12:0 | アバニス ポラリス | LM-2312 | 脂質標準 |
| 標準鉗子ストレートスムース | FST | 11016-17 | 外科用ツール |
| 外科用はさみToughCut標準パターン | FST14130-17 | 外科用ツール | |
| T3000サーモサイクラー | バイオメトラ | インスツルメンテーション/ qPCR | |
| トロンボキサンB2 | モール | Cay19030-5 | 標準トロン |
| ボキサンB2-D4 | モル | Cay319030-25 | 脂質標準 |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | 装置/サンプル調製 |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | 検査 |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | 検査 |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | 溶剤/LCMS |
参考文献
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L.
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再版と許可
