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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

组合 miRNA 治疗调节细胞周期和血管生成的分析

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA 疗法在调节癌症进展方面具有巨大的潜力。这里演示了用于鉴定组合 miRNA 治疗在停止细胞周期和血管生成方面的活性的分析方法。

Abstract

肺癌 (LC) 是全球癌症相关死亡的主要原因。与其他癌细胞类似, LC 细胞的一个基本特征是不受管制的增殖和细胞分裂。通过阻止细胞周期进展抑制增殖已被证明是一种有前途的癌症治疗方法, 包括 LC。

miRNA 疗法已成为重要的转录后基因调节剂, 并越来越多地被研究用于癌症治疗。在最近的工作中, 我们使用了两个 Mirna, Mir-143 和 Mir-506, 以调节细胞周期的进展。对 A549 非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞进行转染, 分析基因表达改变, 最后分析治疗后的凋亡活性。检测到环素依赖性激酶 (cdk) 的下行 (即 CDK1、CDK4 和 CDK6) 的下行调节, 并在 g试管和 g2m 相变时停止细胞周期。病理分析显示治疗具有潜在的抗血管生成活性, 这使得该方法具有多方面的活性。这里, 描述了用于识别 miRNA 活性有关细胞周期抑制, 诱导细胞凋亡, 以及通过抑制血管生成治疗对内皮细胞的影响的方法。希望这里介绍的方法将支持未来对 miRNA 疗法和相应活性的研究, 并希望有代表性的数据将指导其他研究人员进行实验分析。

Introduction

细胞周期是多个调控事件的组合, 允许 DNA 复制和细胞通过有丝分裂过程1增殖。环素依赖性激酶 (Cdk) 调节和促进细胞周期 2。其中有丝分裂 CDK (CDK1) 和间期 Cdk (CDK2、CDK4 和 CDK6) 在细胞周期进展3中起着举足轻重的作用。视网膜母细胞瘤蛋白 (Rb) 由 cdkk! cdk6 复合物磷酸化, 以允许细胞周期进展4, CDK1 激活是成功的细胞分裂5的关键。在过去几十年里, 在临床试验中开发并评估了许多 CDK 抑制剂, 这表明在癌症治疗中有可能以 Cdk 为目标。事实上, 最近已经批准了三种 cdk 抑制剂来治疗乳腺癌6、7、8、9、10.因此, Cdk, 特别是 CDK1 和 CDK--在调节癌细胞进展方面非常感兴趣。

Mirna (miRs) 是小型、非编码的 Rna 和转录后基因表达的调节剂, 约占所有人类基因的 30%,11。他们的活动是基于对信使 Rna (Mrna)12的翻译压制或退化。在生物意义的说明中, 已经确定了超过 5, 000个 mirna, 一个单一的 mirna 分子可以调节多个基因11,13。更重要的是, miRNA 的表达与不同的疾病和疾病状态有关, 包括癌症13。事实上, mirna 已被描述为致癌或肿瘤抑制剂, 能够促进或抑制肿瘤的发展和进展14,15。Mirna 在病变组织中的相对表达可以调节疾病的进展;因此, 外源性传递 Mirna 具有治疗潜力。

肺癌是导致癌症相关死亡的主要原因, 超过60% 的肺癌是非小细胞肺癌 16,17 例, 5年生存率不到 20%18.Mirr-143-3p 和 Mir-506-3p 的使用最近被评估为针对肺癌细胞11的细胞周期.mir-143 和 Mir-506 具有与 CDK1 和 cdkkkh/cdk6 互补的序列, 并分析了这两个 miRs 对 A549 细胞的影响。本文对实验细节进行了介绍和讨论。基因表达、细胞周期进展和凋亡的评估使用不同的实验设计和转染后的时间点。我们使用实时定量 PCR (RT-qPCR) 方法和微阵列分析来测量特定的基因表达, 并使用下一代 RNA 测序来确定全球基因失调11。后一种方法以高灵敏度和可重复性识别每个基因转录的相对丰度, 而从单一的实验分析中可以分析数千个基因。此外, 还进行了由于 miRNA 治疗引起的凋亡分析, 并在此进行了描述。生物信息学补充了路径分析。这里提出的协议用于分析组合 Mir-143 和 Mir-506 的治疗潜力。

该协议的主要目的是确定 Mirna 在细胞中的影响, 重点是细胞周期。这里介绍的各种技术从基因表达分析翻译前 (使用 qPCR) 到在蛋白质水平上详细阐述和新的基因分析技术, 如微阵列分析。希望这份报告对有兴趣与 Mirna 合作的研究人员有所帮助。此外, 还提出了细胞周期和细胞凋亡的流式细胞仪分析方法。

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Protocol

1. Mir-143 和 Mir-506 转染

注意: 在进行上述实验时, 请使用乳胶手套、防护眼镜和实验室外套。必要时, 请使用带机柜风扇的生物安全柜, 不要堵塞气道或干扰层流。如制造商所述, 始终将保护玻璃窗设置为适当的高度。

  1. 种子 NSCLC A549 细胞在 t25 厘米2 flask 96 井板在 dmm/f12k 介质中补充10% 的 fbs 和1% 的青霉素链霉素 (培养培养基) 在组织培养罩中, 在37°c 孵育, 在组织培养孵化器中培养5% 的 co2 。
  2. 将 mir-143 和 mir-506 模拟物悬浮在500μl 转染培养基和 1.5 ml 血清和不含抗生素的 Demf12k 培养基中, 或与转染剂 (2.4 微克的 miR 与14Μl 的转染剂混合; 见材料表) 中悬浮使用 Sir-143 和抗生素的 demf12k 培养基 (2.4 微克的 mir);最终 miRNA 浓度为 100 nM。miRNA 的数量可能需要对不同的细胞和浓度进行优化。适当的方法包括 Mrna 浓度增加的细胞转染 (即 50-200 nM) 和评估感兴趣的基因的表达下调。
  3. 从飞板中取出培养基, 用 1x PBS 清洗一次。
  4. 加入 mirnabusle 转染剂复合物, 在37°c 孵育, 5% co 2 6小时 (烧瓶大小决定了添加的培养体积).
  5. 将培养基替换为4毫升培养基, 孵育细胞24小时至48小时或48小时。
  6. 通过胰蛋白酶化收获转染细胞, 在每个 T25 厘米2瓶中加入1毫升的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育 5-10, 并添加3毫升培养基来收获细胞。将每个烧瓶的内容物放入一个单独的、标记为 15 mL 管中。在组织培养罩中工作。
  7. 以 751 x g离心 5分钟, 并去除上清液。
    注: 在去除上清液时需要注意, 因为搅拌管可能会导致细胞丢失。
  8. 在 751 x g 处加入2ml 的 1X PBS 和离心机5分钟.
  9. 重复步骤7和8一次, 删除任何介质和上清液的痕迹。
    注: 在此阶段, 样品管可以储存在-80°c 或可以立即使用。

2. RNA 提取

  1. 喷洒70% 异丙醇和 RNAse 去污液, 清洁工作区域。
  2. RNA 提取应使用适当的 RNA 试剂盒进行 (见材料表)。
  3. 从-80°c 中取出管, 使其解冻。加入300Μl 的裂解缓冲液和上下移液器, 打破细胞膜。
  4. 加入同等体积的100% 超纯乙醇。
  5. 在分离柱中混合好并放置。
  6. 离心11到 16 x 克之间的 30秒, 并去除流经。
  7. 加入400Μl 洗涤缓冲液和离心机以去除缓冲液。
  8. 在每个样品中加入5μl 的 Dnasse i, 加入75Μl 的 DNA 消化缓冲液, 孵育15分钟。
  9. 用400μl 的 RNA 准备缓冲液清洗样品。
  10. 用 RNA 洗涤缓冲液清洗2倍。
  11. 在柱、离心机中加入无核酸酶的水, 然后收集 RNA。
  12. 用紫外分光光度法测量总 RNA 浓度。

3. RT-qPCR

  1. 在 RT-qPCR 之前, 合成 cDNA。在 RNA 浓度定量后, 将1μg 的 RNA 放入20Μl 的最终反应体积中, 以便在 PCR 管中制备 cDNA。总是在干净的长凳上工作。
  2. 所有其他必要的成分均包含在表 1中。
成分 数量 (μL)/样品 (20μl)
5倍 cDNA 主组合 4个
Ntp 2
随机六分人 1
RT 增强剂 1
维索酶混合 1
DNase 和无 RNase 水 添加 RNA 后所需的数量可制成20Μl

表 1:从 RNA 样本中合成 cDNA 的材料.所需数量的各成分, 以准备一个样本的主混合物, 用于 cDNA 合成。

  1. 在温度条件如下的热循环中孵化: 42°c 30分钟;95°c 2分钟;4°c 直到收集样品。
  2. 立即在常规 PCR 或 qPCR 中使用, 或将 cDNA 存储在-20°c。
  3. 用 Dnasise/rnase 无水从库存底漆溶液中的10Μm 浓度制备正向和反向底漆溶液。
  4. 根据样本数量, 为每个要检测的基因准备单独的主混合物。对于每个 cDNA 样品 (qPCR 井), 根据表 2制备了反应量。
成分 数量 (μL)/样品 (20μl)
SYBR 主混音 10
前向底漆-10μm 2
反向底漆-10μm 2
DNase 和无 RNase 水 3个
cDNA 样本 3个

表 2: 用于从 cDNA 样本中提取定量实时 PCR 的材料.为一个样品准备一个样品的主要原料数量。

  1. 将每个样品放入各自的井中。
  2. 设计了96井 qPCR 板的样品布局。对于每个样本和分析的基因, 执行的反应是三分位, 或至少在重复。
  3. 用光学透明的粘合盖密封96井板。
  4. 快速旋转板, 使反应混合物到达每口井的底部。
  5. 根据以下热梯度运行 RT-qPCR:
    1) 50°c, 2分钟
    2) 95°c, 2分钟
    3) 95°c 为15秒
    4) 阅读
    5) 60°c 1.5 分钟
    6) 重复步骤 3 39次
  6. 运行以下热梯度继续上述, 以确定熔融曲线, 这表明单产品放大。
    7) 65°c 0.31 分钟
    8) + 0.5°c 循环
    9) 板材读取
    10) 重复步骤 8 60次, 直到达到95°c
    11) 72°c, 2分钟

4. 琼脂糖凝胶电泳确认单基因扩增

  1. 在 1x TBE 缓冲液中制备1% 琼脂糖凝胶。
  2. 在温暖 (~ 50°c) 凝胶中加入溴化乙酯 (EtBr), 直到最终浓度约为 0.2-0.5Μg/ml。EtBR 与 DNA 结合, 并允许它在紫外线下在凝胶成像仪中进行可视化。
  3. 将温热凝胶倒在配有电泳凝胶盒的凝胶托盘中。将所提供的梳子紧紧地连接在均匀的井上。
  4. 让凝胶冷却至室温 (RT) 约30分钟。
  5. 凝胶凝固后, 将凝胶和托盘放入凝胶盒中。
  6. 在凝胶盒中填充 1x TBE 缓冲液, 直到凝胶完全覆盖。
  7. 使用紫外光谱仪测量 PCR 扩增过程中 DNA 的浓度。
  8. 在一个小的 PCR 管中提取 ~ 15 纳克的 DNA, 加入5Μl 染料, 并加入所需数量的无核酸酶水, 以达到15μl 的总体积。
  9. 把 DNA 梯子装进井里取样
  10. 在 100 V 处运行凝胶, 直到染料线在凝胶下大约 75%-80%。
    注: 确保凝胶从负电荷运行到正电荷。
  11. 取出凝胶并将其放置在凝胶成像仪中, 以显示 DNA。

5. 细胞周期分析

  1. 种子 5 x 10 5 细胞为每个样本在 t25 厘米2瓶, 并执行转染根据第1节, 步骤1-5 描述的协议。
  2. 24小时和48小时后, 然后通过胰蛋白酶化收获细胞。
  3. 将细胞悬浮液转移到15毫升的无菌管, 并正确地贴上标签。
  4. 以 751 x g离心样品 5分钟, 并丢弃上清液。
  5. 在 751 x g 处加入2毫升冰凉 1x PBS、涡流和离心机 5分钟.
  6. 用 1x PBS 重复清洗步骤, 以去除残留的介质。
  7. 通过移液加入200μl 的冰凉 1x PBS, 重新填充和破坏颗粒。
  8. 在轻轻涡流的同时, 将70% 的冷冻乙醇滴入试管中, 将细胞固定在一起。
  9. 在 RT 处加氢管 30分钟, 并将管材置于4°c 下1小时。
  10. 从4°c 中取出管道, 在 751 x g的温度下离心5分钟。
  11. 在 751 x g 处加入2毫升冰凉 1x PBS、涡流和离心机 5分钟.
  12. 加入500Μl 的 1x PBS, 配碘化物 (50μg/ml) 和核糖核酸 a (200μg/ml)
  13. 在 RT 中孵化 30分钟, 同时保护样品不受光线影响。
  14. 获取流式细胞仪的数据。使用正向与侧向散射 (FSC vs. SSC) 选择细胞的主要群体, 不包括 FSC 左下角的碎片与 FSC 的顶部到右上角的细胞团簇与 SSC 密度图。
  15. 使用适当的软件分析数据, 以确定每个细胞周期阶段的细胞群。

6. 细胞凋亡检测

  1. 种子 5 x 10 5 细胞为每个样本在 t25 厘米2瓶, 并执行转染根据第1节, 步骤1-5 描述的协议。
  2. 24小时和48小时后, 通过胰蛋白酶化收获细胞。
  3. 将细胞悬浮液转移到15毫升的无菌管, 并正确地贴上标签。
  4. 以 751 x克离心 5分钟, 并丢弃上清液。
  5. 在 751 x g 处加入2毫升冰凉 1x PBS、涡流和离心机 5分钟.
  6. 用 1x PBS 重复清洗步骤, 以去除残留的介质。
  7. 稀释10倍附件 v 结合缓冲液1x 与冰凉 dh 2o.
  8. 在每个样品管中加入1毫升的1x 附件 v 结合缓冲液, 然后轻轻重新悬浮。
  9. 将96μl 细胞悬浮液放置在 1.5 mL 微离心管中。
  10. 在含有细胞悬浮液的试管中加入1Μl 的亚克辛 v-fitc 共轭和12μl 碘化物 (PI)。
  11. 在黑暗中的冰上培养细胞悬浮液10分钟。
  12. 在每个样品管中加入250μl 冰凉1x 附件 v 结合缓冲液进行稀释。
  13. 立即用流式细胞仪分析样品。

7. 抗体细胞周期微阵列对蛋白质的表达

  1. 种子 5 x 10 5 细胞为每个样本在 t25 厘米2瓶, 并执行转染根据第1节, 步骤1-5 描述的协议。
  2. 24小时和48小时后, 通过胰蛋白酶收获细胞。
  3. 将细胞悬浮液转移到15毫升管, 并相应地贴上标签。
  4. 以 751 x克离心 5分钟, 并丢弃上清液。
  5. 在 751 x g 处加入2毫升冰凉 1x PBS、涡流和离心机 5分钟 。
  6. 用 1x PBS 重复清洗步骤。
  7. 加入150Μl 的裂解缓冲液, 辅以蛋白酶抑制剂。轻轻向上和向下移开, 以破坏细胞膜。
  8. 为防止任何裂解缓冲干扰, 请使用制造商的溶剂交换柱, 执行缓冲交换, 将裂解缓冲液替换为标签缓冲液。
  9. 用 BCA 法定量总蛋白。
  10. 取70μg 的蛋白质样品, 并添加标签缓冲液, 以达到75μl 的最终体积。
  11. 在1毫克的生物素试剂 (Biotin\ DMF) 中加入100μl 的二甲基甲酰。
  12. 在每个蛋白质样品 (生物素化蛋白样品) 中加入3μl 的 biotin/DMF, 并在 RT 孵育2小时。
  13. 加入35Μl 的停止试剂, 并通过涡流混合。
  14. 在 RT 进行30分钟的孵化样品。
  15. 从冰箱中取出微阵列幻灯片, 以便在使用前将其加热到 RT 1小时。
  16. 在 Rt 连续晃动45分钟的培养皿中, 用3% 的干牛奶溶液 (制造商提供的阻滞剂) 孵育幻灯片, 对非特异性结合进行阻滞。
  17. 用 ddH 2o 水清洗幻灯片 (除非另有说明, 请使用 ddh 2o清洗)。
  18. 重复清洗步骤 ~ 10倍, 从滑动表面完全去除堵塞液。这对于实现统一和低背景非常重要。
  19. 从幻灯片表面中取出过多的水, 然后继续执行下一步, 而不会让滑块干燥。
  20. 通过将3% 的干牛奶溶解在偶联试剂中, 制备偶联溶液。
  21. 加入6毫升的偶联溶液和从步骤7.12 中制备的生物素化蛋白样品的全部数量。
  22. 将一张幻灯片放入供应商提供的耦合室的一井中, 并在其中添加 ~ 6 毫升的蛋白质偶联混合物。
    注: 确保滑块完全淹没在蛋白质偶联混合溶液中。
  23. 在轨道振动台中连续搅拌, 覆盖耦合室并在 RT 孵育2小时。
  24. 将幻灯片转移到培养皿中, 加入30倍洗涤缓冲液。将培养皿放在轨道振动台中, 摇 10分钟, 然后丢弃溶液。
  25. 重复步骤 7.24 2x。
  26. 如步骤7.17 和 7.17中所述, 用 ddh2o 水广泛冲洗滑块, 然后立即进入下一步, 以避免干燥。
  27. 在检测缓冲液的30毫升中加入30μl 的 Cy3-streptavidin (0.5 Mg/ml)。
  28. 将幻灯片放入培养皿中, 加入含有环磷酰胺的检测缓冲液30毫升。
  29. 在轨道振动台中孵化 20分钟, 连续晃动不受光线影响。
    注: Cy-3 是一种荧光染料。盖上铝箔或在黑暗条件下工作, 以保持荧光强度。
  30. 执行步骤 7.24-7.26, 并允许幻灯片干燥使用温和的空气流或将幻灯片放置在一个50毫升锥形管和离心机在 1300 x g 为 5-10.
  31. 将滑块放在滑块支架上, 并用铝箔覆盖。
  32. 使用适当的激发和发射波长在微阵列扫描仪中扫描幻灯片。在 Cy3 的情况下, 激发波长峰值在 ~ 550 nm, 发射峰值在 ~ 570 nm。
  33. 分析数据 (请参阅所用软件的材料表)。

8. RNA 测序

  1. 种子 5 x 10 5 细胞为每个样本在 t25 厘米2瓶, 并执行转染根据第1节, 步骤1-5 描述的协议。
  2. 24小时和48小时后, 通过胰蛋白酶化收获细胞。
  3. 将细胞悬浮液转移到15毫升管, 并相应地贴上标签。
  4. 根据第2节, 步骤1-6 提取 RNA。
  5. 用生物分析仪检查 RNA 质量和浓度。8以上的 RNA 完整性评分 (RIN) 和适当的直方图是必要的, 以确认 RNA 质量。
  6. 从总 RNA, 使用 ~ 2μg 的样本进行 RNA 测序 (信使 RNA 来自总 RNA)
  7. 使用下一代排序器11的序列。
  8. 运行质量修剪和映射与参考基因组从fastq 文件生成的 rna 测序机11。
  9. 上传 FASTQ 文件, 并按照 < 的指示, 将计数数据读给 Genebank://www.ncbi.nlm.nih.gov/> 网站。
    注: 有关以前的结果, 请参见加入号 SRP133420。

9. 管形成分析

  1. 如第1节第1步第1步-5 所述, 使用 huvec 细胞而不是 a549 细胞, 评估 mirna 转染的人脐静脉内皮细胞 (Huvec) 在转染后36小时的血管生成潜力。
  2. 在37°c 和5% 的 Co2 时, 使用 M199 饥饿介质4小时的饥饿 Huvec.
  3. 从-80°c 中去除还原生长因子基底膜基体, 并在4°c 下过夜, 从而逐渐解冻, 避免气泡形成和聚合。
  4. 小心、缓慢地覆盖96井板的井, 含 0.04 ml 的还原生长因子基底膜基质, 避免气泡形成。在层流罩下执行整个过程。
  5. 用0.1 毫升的 PBS 填充96井板的相邻井, 以保持湿度和保持温度。
  6. 在37°c 下将96孔板培养至少 20分钟, 实现基底膜萃取物的聚合。孵育时间不要超过1小时。
  7. 胰蛋白酶转染每个组的 Huvec, 并在培养基 M199 中重新悬浮, 浓度为 1 x10 5 细胞。
  8. 在96井板中含有聚合基底膜基质的井中加入0.1 毫升的每个细胞悬浮液。
  9. 在制备生长因子的同时, 在37°C 下, 用5% 的 co2 对96孔板进行培育。生长因子的制备也发生在层流罩下。
  10. 将生长因子 (VEGF) 在最终所需浓度的 2倍 (4 ngml 浓度为 2 ngml 最终浓度) 中重组, 并在与细胞的 M199 饥饿介质 0.1 mL 之上添加 0.1 mL 的生长因子 (m199 饥饿介质)。对于非 vegf 处理的井, 在 ML 饥饿介质 0.1 mL 的顶部与细胞一起添加 0.1 mL 的 ML 饥饿介质。
  11. 用5% 的 CO2 在37°c 下将96孔板培养 6小时.
  12. 在潜伏期结束时, 使用与数码相机连接的明亮场显微镜, 用4倍放大的放大倍率获取每口井的图像。
  13. 处理图像与软件配备了 "血管生成分析仪" 插件19。使用三个参数, 节点数、连接点数和总芽长度, 比较 mirna 治疗对血管生成的影响。

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Representative Results

RT-qPCR 和凝胶电泳基因表达分析

利用 RT-qPCR 进行的差异基因表达分析显示, 靶向基因 CDK1、CDK4 和 CDK6 有显著下调。CDK1 和 cdkk 6 分别有助于 g2m 和 GN.S 的过渡。所进行的分析可以直接比较单个 miRs 和组合 MiRs 活动。利用对检测到的基因下调过程中的任何干扰进行检测, 使其与转染剂的制备, 是最小的。使用双尾学生的t测试对数据进行统计分析,p < 0.05 被认为具有统计意义 (图 1)。在 qPCR 之前, 使用引物-blast < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> 用于单基因扩增, 对引物序列进行了评估。通过凝胶电泳分析扩增产物也证实了这一点。每个分析的基因检测到单波段 DNA 产物 (图 1d), 证实单基因扩增。CDK6 单扩增得到证实 (数据未显示)。

Figure 1
图 1qPCR 检测到的 cdk1、CDK4 和 CDK6 基因的相对表达, 以及 dna 扩增产物的凝胶电泳分析。a549 细胞的 Mir-143 和 Mir-506 转染导致 CDK1 (A)、CDK4 (B) 和 CDK6 (C) 在转染后24小时和48小时的下调。用凝胶电泳 (D) 对 DNA 扩增产物进行评价, 以确认单基因扩增。以 GAPDH 为参考基因。平均±SEM, * p < 0.05;* * p < 0.01, 双尾t-测试。这个数字已从 Hossian 等人的报告 11中修改,请点击这里查看这个数字的更大版本.

流式细胞仪的细胞周期分布

细胞核酸碘化丙二酸染色是通过定量 DNA 含量来显示细胞周期不同阶段细胞群的标准方法。如流式细胞仪分析所示, 对 Mir-143 和 Mir-506 的组合治疗使 g过来胶1和 G2/M 这两个检查站的细胞周期停止了 (图 2)。

Figure 2
图 2: 用 mir-143 和 Mir-506 转染 A549 细胞的细胞周期分析, 在24小时和48小时转染后。通过流式细胞仪和 dna 结合碘化物测定每个细胞周期的细胞数量百分比。平均±SEM。这个图是重新打印从 Hossian 等人11请点击这里查看这个数字的更大版本.

流式细胞术检测环素 vp/pi 凋亡

经 mir-143 和 Mir-506 转染 A549 细胞后, 采用环素 V 和 PI 染色及流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果表明, 组合治疗在24小时和48小时内诱导明显凋亡。与阴性对照相比, 由于 miR 处理如图 3所示, 由附件素 v 阳性细胞检测到凋亡细胞的百分比变化。

Figure 3
图 3: 凋亡细胞的图解分析.与 Mir-143 和 Mir-506 的横截面增加了亚克辛 v 阳性 A549 细胞的百分比。平均±sem. * p < 0.05, * * p < 0.01, 双尾t试验。这个数字已从 Hossian 等人的报告 11中修改,请点击这里查看这个数字的更大版本.

细胞周期抗体芯片

机械对治疗的反应可以通过蛋白质表达的变化来确定。差异表达是在与细胞周期途径相关的基因的蛋白质水平上使用路径特异性抗体芯片进行评估的。用蛋白质提取物对 miR-143/506 转染的细胞进行了分析。微阵列分析允许对 ~ 60个细胞周期相关蛋白进行半定量分析, 每个特定抗体有6个复制。该方法允许在特定路径中更广泛地观察机械行为, 确定分子目标以进行进一步评估, 并在翻译后层面进行分析。由于该方法的半定量原理, 任何特定基因的结果都需要通过西方印迹来确认。在这一分析中, 检测到与细胞周期进展相关的蛋白质表达减少。这包括 qPCR 检测到的转染后24小时和48小时的目标 CDK1 和 CDK4 (图 4a)。

Figure 4
图 4: 通过微阵列和 rna 测序分析检测到的基因失调.(A) 经微阵列分析检测到的用 mir-143 和 Mir-506 转染的 A549 细胞蛋白质提取物的细胞周期通路基因表达的热图, 在转染后24小时和48小时。(B) 用 Mir-143 和 mir-506 转染的 A549 细胞的细胞周期通路基因表达的折叠变化, 这些变化在转染后24小时内被 rna 测序检测出。(C) 通过从 RNA 测序中获得的数据的路径分析软件分析路径活动。这一数字已从 Hossian 等人的报告中修改.11请点击这里查看此图的较大版本.

利用路径分析软件进行 RNA 测序和路径分析

下一代测序准确地分析了 RNA 水平的基因表达。该方法允许通过单一分析识别多种基因变化 (在本协议中, 分析检测了 & gt;18,000 基因的表达)。由于检测到大量基因, 生物信息学分析被用于有效地确定路径行为 (图 4b)。然后使用软件 (见材料表) 来预测 gqurs 和 g2m 阶段逮捕和 s 相启动的下调 (图 4c)。此外, RNA 测序结果可与 qPCR 数据进行比较。在这项研究中, RNA 测序证实了 qPCR 分析的结果, 表明 CDK1 (48%, p < 0.001, fdr < 0.001)、CDK4 (68%, p < 0.001, fdr < 0.001) 和 cdk6 (71%, < 0.001, 罗斯福 < 0.001) 下调。组合 Mir-143 和 Mir-506 活动。统计分析是由 edger软件进行的, 用于计算相对基因表达, 计算 p 值使用负二项式 20,21。生物信息学分析可用于 miRNA 活性的功能评估和潜在分子靶标的预测, 如图 5所示。

Figure 5
图 5* 通过路径分析软件提出的图解路径和力学分析.利用转染后的路径分析软件, 并确定了具有最低 (A) 或最高 (B) 激活得分的规范途径, 对经 mir-143 和 mir-506、24小时转染的 a549 细胞的 RNA 测序数据进行了分析。该软件还提供了预测函数 (C) 和潜在的上游调节器目标 (D)。这一数字是由 Hossian 等人转载的.11请点击这里查看此图的较大版本.

内皮管形成试验

体外内皮管的形成试验广泛应用于血管生成的研究, 是可靠的、自动化的、可量化的22。血管内皮生长因子 (vegf) 是著名的血管生成生长因子23,24和内皮管形成促进子。本研究发现, Mir-143 和 Mir-506 的组合治疗使 vegf 诱导的血管生成。管形成的指示性图像和处理效果如图 6所示。

Figure 6
图 6: vegf 治疗的内皮芽与未经处理的 huvec 的代表性图像, 经炒 miRNA、mirna-143、Mirna-506 或其组合转染.在配备了4倍放大倍率数码相机的明亮场显微镜下获得了照片。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

Mirna 可以作为癌症治疗的靶向疗法, 认识到患病组织与正常组织表达水平的失调。这项研究旨在确定在多个阶段可能阻止细胞周期进展的 Mirna。经证实, Mir-143 和 Mir-506 停止了癌细胞的细胞周期, 并提出了旨在了解这种组合 miRNA 治疗的活性的协议。

所述方法为 Mirna 的功能提供了全面的理解。研究 Mirna 的挑战与它们针对多个基因的能力有关, 因此影响多个途径。所描述的 qPCR 分析可以识别感兴趣的特定基因的表达, 如果在治疗前确定了特定的目标。例如, 这里的主要重点是 CDK1 和 cdk 的表达以及细胞周期。

因此, 使用碘化丙基和流式细胞仪协议进行细胞周期分析是根据细胞周期中细胞群的阶段来检测细胞群变化的可靠方法。该方法依赖于与 DNA 结合的 pi 对荧光信号的比例增加, 与细胞周期的阶段相对应。简单地说, S 相的细胞合成 DNA, 诱导比 g？ g1 相的细胞更高的信号, G2 相的细胞复制了它们的 DNA, 产生了最强烈的信号。

积累的证据表明损伤与细胞周期和细胞凋亡的触发25的联系.环素 viepi 的流式细胞仪方法一直用于鉴别化疗诱导细胞凋亡。在指示性上, 由于组合 miRNA 治疗, 确定了强烈的凋亡反应, 与单个 Mirna 相比, 这种治疗更有效。

半定量蛋白质抗体芯片是识别与特定生物反应相关的蛋白质表达改变的一种敏感可靠的方法 26,27。该协议使用了细胞周期路径特异性抗体芯片, 检测经治疗的细胞和未治疗细胞之间 ~ 60个基因的表达变化。在清洗过程中需要小心, 以确保该过程已完全完成, 并最大限度地减少背景信号。此外, 在实验完成之前, 幻灯片不应干燥。

相反, RNA 测序提供了多个基因的定量基因表达分析, 在转录后的水平。rna seq 的大量分析基因 (& gt;18,000 与微阵列的 60) 允许同时分析多种途径和分子目标, 并提高了准确性。如此广泛的分析是重要的, 因为一个单一的 miRNA 可以绑定到不同的 Mrna 并针对不同的 Rna。相反, 大量基因失调的路径分析本质上具有挑战性。例如, 尽管 RNA 测序证实了我们关于 CDK1 和 cdkk! 由于 miRNA 治疗而下调的 qPCR 数据, 但分析也提供了数千个基因的数据, 这些基因也被下调或上调。为了给这些众多的基因异常提供背景, 路径分析软件被用来确定治疗对不同途径和细胞功能的总体影响。在指示上, 软件提供了具有激活 (正 z 分数) 或不激活 (负 z 分数) 特定功能或路径的分数, 以及分析的统计意义 (图 5)28。

总之, 对 miRNA 活性的研究是一个具有挑战性的过程。Mirna 影响多个基因的内在能力要求使用多种复杂的分析方法来识别潜在的活性。毫不奇怪, 需要进一步开展工作, 以充分理解 mir-143 和 Mir-506 在肺癌中的活动。

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Disclosures

作者希望感谢路易斯安那州立大学的约翰·卡斯基在 RNA 测序数据的路径分析方面提供的协助, 并感谢德克萨斯大学西南医学中心麦克德莫特中心下一代测序核心。执行 RNA 测序和数据分析。这项研究得到了路易斯安那州梦露大学药学院启动资金的支持, 以及国家卫生研究院 (NIH) 通过国家普通医学科学研究所的赠款 5 P20 GM103424-15、3 P20 GM103424-15S1 提供的支持。

Acknowledgments

不申报利益冲突。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

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References

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Tags

癌症研究 第145期 转染 miRNA 肺癌 细胞周期 凋亡 血管生成 RNA 测序

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

组合 miRNA 治疗调节细胞周期和血管生成的分析
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Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

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