Analyse af kombinatorisk miRNA behandlinger til at regulere cellecyklus og angiogenese
Summary
miRNA therapeutics har betydeligt potentiale i at regulere kræft progression. Vist her er analytiske tilgange bruges til identifikation af aktiviteten af en kombinatoriske miRNA behandling standse cellecyklus og angiogenese.
Abstract
Lungekræft (LC) er den hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan. I lighed med andre kræftceller, et grundlæggende kendetegn ved LC celler er uregulerede spredning og celledeling. Hæmning af spredning af standse cellecyklus progression har vist sig at være en lovende tilgang til kræftbehandling, herunder LC.
miRNA therapeutics er dukket op som vigtige post-transcriptional gen regulatorer og er i stigende grad ved at blive undersøgt til brug i kræftbehandling. I de seneste arbejde udnyttede vi to miRNAs, miR-143 og miR-506, at regulere cellecyklus progression. A549 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) kræftceller var transfekteret, gene expression ændringer blev analyseret og apoptotiske aktivitet på grund af behandlingen blev sidst analyseret. Downregulation af cyclin-afhængig kinaser (CDKs) blev fundet (dvs., CDK1, CDK4 og CDK6), og celle cyklus standset ved faseovergange G1/S og G2/M. Sti analyse viste potentielle antiangiogenic aktivitet af den behandling, der forlener tilgangen med mangefacetteret aktivitet. Her beskrives er de metoder, der anvendes til at identificere miRNA aktivitet vedrørende cellecyklus hæmning, induktion af apoptose og virkninger af behandlingen på endotelceller ved hæmning af angiogenese. Det er håbet, at de metoder, der præsenteres her vil støtte fremtidige forskning på miRNA therapeutics og tilsvarende aktivitet og at den repræsentative data vil guide andre forskere under eksperimentelle analyser.
Introduction
Cellecyklus er en kombination af flere regulerende begivenheder, der tillader kopiering af DNA og celle spredning gennem mitotiske proces1. Cyclin-afhængig kinaser (CDKs) regulere og fremme celle cyklus2. Blandt dem har den mitotiske CDK (CDK1) og interphase CDKs (CDK2, CDK4 og CDK6) en central rolle i celle cyklus progression3. Retinoblastom protein (Rb) er fosforyleret af den CDK4/CDK6 komplekse at tillade cellecyklus progression4, og CDK1 aktivering er afgørende for vellykket celledeling5. Talrige CDK hæmmere er blevet udviklet og evalueret i kliniske forsøg i de sidste par årtier, med angivelse af potentialet i rettet mod CDKs i kræftbehandling. Faktisk tre CDK hæmmere er blevet godkendt til behandling af brystkræft for nylig6,7,8,9,10. Således er CDKs, og især CDK1 og CDK4/6, er af stor interesse i at regulere kræft celle progression.
miRNAs (miRs) er lille, ikke-kodende RNA’er og post-transcriptional regulatorer af genekspression, regulere ca 30% af alle menneskelige gener11. Deres aktivitet er baseret på translationel undertrykkelse eller forringelse af messenger RNA’er (mRNAs)12. Illustrerende for deres biologiske betydning, mere end 5.000 miRNAs er blevet identificeret og en enkelt miRNA molekyle kan regulere flere gener11,13. Endnu vigtigere, har miRNA udtryk været forbundet med forskellige sygdomme og sygdom statusser, herunder kræft13. Faktisk miRNAs er blevet karakteriseret som mutationer eller tumor undertrykkere, at være i stand til at enten fremme eller undertrykke tumor udvikling og progression14,15. Den relative udtryk for miRNAs i syge væv kan regulere sygdomsprogression; således har eksogene levering af miRNAs terapeutiske potentiale.
Lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald og mere end 60% af alle maligne sygdomme lunge er ikke-small cell lunge kræft16,17, med en 5-års overlevelse på mindre end 20%18. Brugen af miR-143-3 p og miR-506-3 p blev for nylig vurderet målretning celle cyklusser i lunge kræft celler11. miR-143 og miR 506 har sekvenser, der er til CDK1 og CDK4/CDK6, og virkningerne af disse to miRs på A549 celler blev analyseret. De eksperimentelle detaljer præsenteres og drøftes i dette dokument. Gen-ekspression, celle cyklus progression og apoptose blev evalueret ved hjælp af forskellige eksperimentelle design og timepoints efter Transfektion. Vi brugte real-time kvantitativ PCR (RT-qPCR) metoder sammen med microarray analyse for at måle specifikke genekspression, og næste generation RNA sekventering blev brugt til at bestemme globale gen dysregulering11. Sidstnævnte metode identificerer den relative forekomst af hvert gen udskrift med høj følsomhed og reproducerbarhed, mens tusindvis af gener, der kan analyseres fra en enkelt eksperimentel analyse. Derudover apoptotiske analyse på grund af miRNA behandling blev udført og er beskrevet her. Bioinformatik suppleret pathway analyse. Præsenteres her er protokoller bruges til analyse af det terapeutiske potentiale i den kombinatoriske miR-143 og miR 506.
Hovedformålet med denne protokol er at identificere virkningerne af miRNAs i celler, med fokus på den celle cyklus. Forskellige teknikker præsenteres her spændvidde fra gen expression analyse præoversættelse (bruger qPCR) til at uddybe og roman teknikker til gen analyser på protein, såsom microarray analyse. Det er håbet, at denne rapport er nyttig for forskere interesseret i at arbejde med miRNAs. Derudover præsenteres metodologi for flow cytometric analyse af cellecyklus og apoptose af celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs kan fungere som målrettede behandlinger til kræftbehandling, anerkende dysregulering af udtryk niveauer i syge vs normale væv. Denne undersøgelse havde til formål at bestemme miRNAs, der potentielt standse cellecyklus progression i flere faser. Det blev konstateret, at miR-143 og miR 506 standse cellecyklus af kræftceller, og de præsenterede protokoller har til formål at forstå aktiviteten af denne kombinatorisk miRNA behandling.
De beskrevne metoder giver en overordnet forstå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen interessekonflikter er erklæret.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
- Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
- Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
- Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
- Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
- Mullard, A. FDA approves Novartis’s CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
- Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
- Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
- Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
- Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
- Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
- Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. . Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
- Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
- Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
- Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
- Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, 21 (2013).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).
