Мирна терапии имеют значительный потенциал в регулировании прогрессии рака. Продемонстрировали здесь аналитические подходы используются для идентификации деятельности комбинаторной Мирна лечения в прекращение клеточного цикла и ангиогенеза.
Рак легких (LC) является ведущая причина рак родственных смертей во всем мире. Другие раковые клетки, фундаментальной характеристикой LC клеток является Нерегулируемое распространение и деление клеток. Было показано, что ингибирование распространения путем прекращения клеточного цикла прогрессии быть перспективным подходом для лечения рака, в том числе LC.
Мирна терапии появились как важный post-transcriptional генов регуляторов и все чаще в настоящее время изучаются для использования в лечении рака. В недавней работе мы использовали два адаптивной, мир-143 и мир-506, регулировать клеточный цикл прогрессии. A549 легких немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) клетки были transfected, были проанализированы изменения выражения гена, и наконец была проанализирована apoptotic активности из-за лечения. Даунрегуляция циклин зависимых киназ (CDKs) были обнаружены (то есть, CDK1, CDK4 и CDK6), и клеточного цикла в G1 (Ы) и G2/М фазовых переходов. Путь анализ свидетельствует о потенциальной деятельности антиангиогенных лечения, который наделяет подход с многогранной деятельности. Описанные здесь методологии, используемые для идентификации Мирна деятельности относительно ингибированием клеточного цикла, индукции апоптоза и эффекты лечения на эндотелиальных клеток торможение ангиогенеза. Предполагается, что представленные здесь методы будут поддерживать будущие исследования Мирна терапии и соответствующей деятельности и что репрезентативных данных будет руководствоваться другие исследователи в ходе экспериментальных анализов.
Клеточный цикл представляет собой сочетание нескольких регулирования событий, которые позволяют дублирования ДНК и клеток распространения через mitotic процессов1. Циклин зависимых киназ (CDKs) регулирования и содействия клеточного цикла2. Среди них митотическая CDK (CDK1) и межфазных CDKs (CDK2, CDK4 и CDK6) имеют ключевую роль в клеточный цикл прогрессия3. Белка ретинобластомы (Rb) фосфорилированных, комплекс CDK4/CDK6 разрешить клеточного цикла прогрессии4, и CDK1 активация необходима для успешного клеточного деления5. Многочисленные CDK ингибиторы были разработаны и оценены в клинических испытаниях за последние несколько десятилетий, что свидетельствует о возможности таргетинга CDKs в лечении рака. В самом деле, три CDK ингибиторы были одобрены для лечения рака молочной железы недавно6,,78,9,10. Таким образом, CDKs, и в частности, CDK1 и CDK4/6, представляют большой интерес в регулировании прогрессии рака клеток.
небольшие, некодирующих РНК и post-transcriptional регуляторы экспрессии генов, регулирующих примерно 30% всех человеческих генов11интерферирующим (Мирс). Их деятельность основана на поступательной репрессий или деградации messenger РНК (мРНК)12. Характеризует их биологическое значение, были определены более чем 5000 адаптивной и один Мирна молекула может регулировать несколько генов11,13. Что еще более важно Мирна выражение был связан с различными заболеваниями и статусов болезней, включая рак13. В самом деле, адаптивной характеризовались как онкогенных или супрессоров, способного содействовать или подавлять опухоли и развитие14,15. Относительное выражение интерферирующим в пораженной ткани можно регулировать прогрессирования заболевания; Таким образом экзогенных доставки интерферирующим имеет терапевтический потенциал.
Рак легких является ведущая причина рак родственных смертей и более чем 60% всех злокачественных опухолей легких немелкоклеточного клетки легких Рак16,17, с 5-летняя выживаемость менее чем 20%18. Использование мир-143-3 p и мир-506-3 p недавно была проведена оценка для ориентации клетки циклов в легких рак клеток11. Мир-143 и мир-506, последовательности, взаимодополняемости, CDK1 и CDK4/CDK6, и были проанализированы последствия этих двух Мирс на A549 клетки. Экспериментальные данные представляются и обсуждаются в настоящем документе. Экспрессии генов, клеточный цикл прогрессии и апоптоз были оценены с использованием различных экспериментальных образцов и после transfection timepoints. Мы использовали реального времени количественные методы PCR (RT-ПЦР) наряду с microarray анализ для оценки экспрессии определенных генов, и следующего поколения РНК последовательности был использован для определения глобальных гена dysregulation11. Последний метод определяет относительное обилие транскрипт каждого гена с высокой чувствительностью и воспроизводимости результатов, в то время как тысячи генов могут быть проанализированы из одного экспериментального анализа. Кроме того анализ apoptotic вследствие обращения Мирна была выполнена и описан здесь. Биоинформатика дополнены путь анализа. Здесь представлены протоколы используются для анализа терапевтический потенциал комбинаторной мир-143 и мир-506.
Основная цель настоящего Протокола заключается в идентификации эффекты интерферирующим в клетках, с акцентом на клеточный цикл. Разнообразие методов представлены здесь диапазон из анализа выражения гена предварительный перевод (с помощью ПЦР) для разработки и новые методы для анализа гена на уровне белков, таких как microarray анализ. Остается надеяться, что этот доклад является полезным для исследователей, заинтересованных в работе с адаптивной. Кроме того представлена методология анализа потока гранулярных клеточного цикла и апоптоз клеток.
интерферирующим могут действовать в качестве целевой терапии для лечения рака, признавая dysregulation уровни выражения в больной против нормальных тканей. Это исследование стремились определить адаптивной, что потенциально остановить прогрессирование клеточного цикла в течение нескольк…
The authors have nothing to disclose.
Отсутствие конфликта интересов объявляются.
-80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
Agarose | VWR | 0710-25G | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |