Analys av kombinatoriska miRNA behandlingar för att reglera cellcykeln och angiogenes
Summary
miRNA therapeutics har betydande potential i regleringen cancer progression. Visat här används analytiska metoder för att identifiera aktiviteten av en kombinatorisk miRNA behandling i att stoppa cellcykeln och angiogenes.
Abstract
Lungcancer (LC) är den vanligaste orsaken till cancer-relaterade dödsfall i världen. Liknar andra cancerceller, en grundläggande egenskap hos LC celler är oreglerad proliferation och celldelning. Hämning av spridning genom att stoppa cellcykelns förlopp har visat sig vara en lovande strategi för cancerbehandling, inklusive LC.
miRNA therapeutics har dykt upp som viktiga post-transcriptional gen regulatorer och studeras allt för användning i behandling av cancer. I senaste arbete utnyttjade vi två microRNA, miR-143 och miR-506, att reglera cellcykelns förlopp. A549 Icke-småcellig lungcancer (NSCLC) cancerceller var transfekterade, gen uttryck förändringar analyserades och apoptotiska aktivitet på grund av behandlingen var slutligen analyseras. Nedreglering av cyklin-beroende kinaser (CDKs) upptäcktes (dvs. CDK1, CDK4 och CDK6), och cellen cyklar stoppas på de G1/S och G2/M fasövergångar. Väg analys indikerar potentiell antiangiogenetisk aktivitet av behandlingen, som begåvar metoden med mångfacetterad verksamhet. Här beskrivs de metoder som används för att identifiera miRNA verksamhet angående cellcykeln hämning, induktion av apoptos, och effekterna av behandling på endotelceller genom hämning av angiogenes. Förhoppningen är att de metoder som presenteras här kommer att stödja framtida forskning på miRNA therapeutics och motsvarande aktivitet och att den representativa uppgifter kommer att vägleda andra forskare under experimentella analyser.
Introduction
Cellcykeln är en kombination av flera rättsliga händelser som Tillåt duplicering av DNA och cell spridning genom mitotiska process1. Cyklin-beroende kinaser (CDKs) reglera och främja den cellcykeln2. Bland dem har den mitotiska CDK (CDK1) och interphase CDKs (CDK2, CDK4 och CDK6) en nyckelroll i cellcykeln progression3. Retinoblastom protein (Rb) är fosforyleras av den CDK4/CDK6 komplexa att tillåta cellcykeln progression4, och CDK1 aktiveringen är avgörande för framgångsrik cell division5. Talrika CDK-hämmare har utvecklats och utvärderats i kliniska studier under de senaste decennierna, som anger risken för att rikta CDKs i cancerbehandling. I själva verket tre CDK-hämmare har godkänts för behandling av bröstcancer nyligen6,7,8,9,10. Således, CDKs, och i synnerhet CDK1 och CDK4/6, är av stort intresse att reglera cancer cell progression.
microRNA (miRs) är små, icke-kodande RNAs och post-transcriptional regulatorer av genuttryck, reglera cirka 30% av alla mänskliga gener11. Deras verksamhet bygger på translationell förtryck eller nedbrytning av messenger RNA (mRNA)12. Belysande av deras biologiska betydelse, mer än 5.000 microRNA har identifierats och en enda miRNA molekyl kan reglera flera gener11,13. Viktigare, har miRNA uttryck associerats med olika sjukdomar och sjukdomar status, inklusive cancer13. I själva verket microRNA har karaktäriserats som onkogena eller tumör dämpning, att vara kapabel att antingen främja eller hämma tumör utveckling och progression14,15. Det relativa uttrycket för microRNA i sjuk vävnad kan reglera sjukdomsprogression; Således har exogen leverans av microRNA terapeutisk potential.
Lungcancer är den ledande orsaken till dödsfall och större än 60% av alla lung maligniteter är icke-small cell lung cancer16,17, med en 5-års överlevnad på mindre än 20%18. Användning av miR-143-3 p och miR-506-3 p utvärderades nyligen för att rikta de cell cyklerna i lung cancer celler11. miR-143 och miR-506 har sekvenser som är komplementaritet till CDK1 och CDK4/CDK6, och effekterna av dessa två miRs på A549 celler analyserades. De experimentella detaljerna presenteras och diskuteras i detta dokument. Genuttryck, cellcykelprogression och apoptos utvärderades med hjälp av olika experimentella designer och tidpunkter efter transfection. Vi använde realtid kvantitativ PCR (RT-qPCR) metoder tillsammans med microarray analys för att mäta specifika genuttryck och nästa generations RNA-sekvensering användes för att fastställa globala gen Dysreglering11. Den senare metoden identifierar det relativa överflödet av varje genens transkription med hög känslighet och reproducerbarhet, medan tusentals gener kan analyseras från ett enda experimentell analys. Dessutom apoptotiska analys på grund av miRNA behandling utfördes och beskrivs här. Bioinformatik kompletterat den väg analysen. Presenteras här är protokoll som används för analys av den terapeutiska potentialen av den kombinatoriska miR-143 och miR-506.
Det huvudsakliga syftet med detta protokoll är att identifiera effekterna av microRNA i celler, med fokus på cellcykeln. Mängden tekniker presenteras här sträcker sig från gen uttryck analys Föröversättning (med qPCR) att utarbeta och nya tekniker för gen analys på proteinnivå, såsom microarray analys. Förhoppningen är att detta betänkande är till hjälp för forskare som är intresserade av att arbeta med microRNA. Dessutom presenteras metodik för flöde flödescytometrisk analys av cellcykeln och apoptos celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
microRNA kan fungera som riktade terapier för behandling av cancer, erkänner Dysreglering av uttrycksnivåerna i sjuka vs normal vävnad. Denna studie syftade till att fastställa microRNA som potentiellt stoppa cellcykelns förlopp under flera etapper. Det identifierades att miR-143 och miR-506 stoppa cellcykeln av cancerceller, och protokollen presenteras syftar till att förstå aktiviteten av denna kombinatoriska miRNA behandling.
De beskrivna metoderna ger en övergripande förståelse …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
- Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
- Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
- Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
- Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
- Mullard, A. FDA approves Novartis’s CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
- Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
- Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
- Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
- Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
- Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
- Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. . Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
- Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
- Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
- Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
- Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, 21 (2013).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).
