Summary
Målet med denne protokol er at beskrive en ny brystkræft modellering tilgang baseret på med injektion af CRE-udtrykker adenovirus i mus brystkirtler. Denne fremgangsmåde muliggør både celletype-og organspecifik manipulation af onkogene hændelser på en timeligt kontrolleret måde.
Abstract
Brystkræft er en heterogen sygdom, muligvis på grund af komplekse interaktioner mellem forskellige celler af oprindelse og onkogene begivenheder. Musemodeller er medvirkende til at få indsigt i disse komplekse processer. Selv om mange musemodeller er blevet udviklet til at studere bidrag af forskellige onkogene hændelser og celler af oprindelse til brysttumor, disse modeller er ofte ikke celle-type eller Organspecifikke eller kan ikke inducere initiering af brysttumor i en på en tidsmæssigt kontrolleret måde. Her beskriver vi en protokol til at generere en ny type brystkræft musemodeller baseret på med injektion af CRE-udtrykker adenovirus (ad-CRE) i mus brystkirtler (MGS). På grund af den direkte injektion af ad-CRE i mælkekanaler, denne fremgangsmåde er MG specifik, uden nogen uønsket kræft induktion i andre organer. Den med injektion procedure kan udføres i mus på forskellige stadier af deres mg udvikling (således, det tillader tidsmæssig kontrol af kræft induktion, startende fra ~ 3-4 uger af alder). Den celle-type specificitet kan opnås ved hjælp af forskellige celle-type-specifikke initiativtagere til at drive CRE udtryk i adenovirale vektor. Vi viser, at luminale og basal bryst epitelceller (mecs) kan være stramt målrettet til CRE/loxp-baseret genetisk manipulation via en med injektion af ad-CRE under kontrol af keratin 8 eller Keratin 5 Promoter, hhv. Ved at indarbejde en betinget CRE reporter (f. eks CRE/loxp-inducible Rosa26-yfp reporter), viser vi, at mecs målrettet af ad-CRE, og tumorceller afledt af dem, kan spores ved at følge de reporter-positive celler efter med injektion.
Introduction
Det overordnede mål for denne metode er at udvikle en ny brystkræft modellering tilgang baseret på en med injektion af ad-CRE i mus mg. Den CRE/loxP rekombinationbaserede genetiske tilgang har været meget anvendt til at modellere human brystkræft i mus. Den første generation af CRE/loxP-baserede brystkræft musemodeller genereres ved hjælp af CRE-ekspression af Transgene mus under kontrol af MEC-specifikke promotorer (f. eks., MMTV-CRE for luminale mecs og en del af basal mecs, WAP-CRE og Blg-CRE til luminale progenitorer og alveolære luminalmecs, K14-CRE til basal og en del af luminale mecs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. selv om disse CRE-transgene linjer muliggør rumlig kontrol af CRE-ekspression (dvs. i forskellige undergrupper af mecs), tillader de dog ikke tidsmæssig kontrol af CRE-ekspression og CRE/loxp-medieret genetisk manipulation. Anden generation af CRE/loxP-baserede brystkræft musemodeller udnytter inducerbare CRE aktivitet/ekspression tilgange (f. eks brug af CRE-østrogen receptor fusion [CreER], som kun kan inducere CRE/loxP rekombination efter administration af Tamoxifen), og som følge heraf tillader disse genetiske værktøjer både rumlig og tidsmæssig kontrol af aktiveringen af onkogene hændelser i mecs (f. eks. K8-creer-og K5-creer-baserede modeller)10,11,12 . I begge generationer af brystkræft musemodeller, som initiativtagere, der anvendes til at drive CRE eller CreER udtryk (f. eks, Krt8, Krt5) kan også være aktive i epitelceller i andre organer (dvs., de er celle-type-specifikke, men ikke organ-specifikke) eller har et utætte udtryk i andre celletyper end epitelceller (f. eks. MMTV, som har utætte aktiviteter i knoglemarvs hæmatopoietiske celler), kan disse tilgange føre til udvikling af uønskede kræft (er) i andre organer. Hvis disse uventede kræftformer forårsage dødelighed i de berørte mus, det oprindelige formål med modellering brystkræft i disse mus kan være forbudt (f. eks., MMTV-CRE-drevet onkogene hændelser kan føre til hæmatopoietiske maligniteter og tidlig død af musene , på grund af udæthed af MMTV -promotoren i hæmatopoietiske celler)4.
Her rapporterer vi en brystkræft modellering tilgang i mus, der tillader både celle-type-og organ-specifikke manipulation af onkogene begivenheder i en timeligt kontrolleret måde. Denne fremgangsmåde er baseret på en intraductalinjektion af ad-CRE i muse MGs (og er således organspecifik). CRE udtryk kan styres ved hjælp af forskellige MEC subpopulation-specifikke initiativtagere indlejret i adenovirale vektor (f. eks, Krt8 for luminale mecs, Krt5 for basal mecs, således at opnå celle-type specificitet). Kræft induktion i MGs kan tidsmæssigt kontrolleres ved en injektion af ad-CRE til mus i forskellige aldre, startende fra 3-4 uger af alder (puberteten) til voksenstadiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) på Brigham and Women's Hospital.
1. generering og vedligeholdelse af floxed mus
- Få brystcancer-relevant floxed betinget udskæring (f. eks .Trp53 tm1Brn [omtalt som Trp53l/l], Brca1tm1Aash [Brca1l/l]) eller betingede Knock-in-muse linjer (f. eks. Gt (Rosa) 26SorTm1 (PIK3CA * H1047R) Egan) fra Jackson Laboratory (JAX) eller NCI Mouse modeller af human Cancer Consortium (MMHCC) repository. For at lette jagten på MECs, der gennemgår CRE-medieret rekombination, kan der også fås en betinget CRE-reporter-linje fra JAX (f. eks. gt (Rosa) 26SorTM1 (Eyfp) cos [omtalt som R26Y]).
- Race Trp53L/l homozygot mus med R26Y homozygot reporter mus eller med homozygot mus, der bærer R26Y reporter alleler og eventuelle yderligere floxed betingede knockout eller Knock-in alleler til forskellige musemodeller, at få heterozygot F1 mandlige og kvindelige afkom.
- Intercross heterozygot F1 mandlige og hunmus for at opnå F2 sammensatte hunmus, der er homozygot for hver allel (som eksperimentelle mus), samt R26Y-kun homozygot hunner (som kontrol mus). Genotype F2-mus baseret på PCR-primere-og cykelforholdene anført nedenfor ved at opsætte to standard 20 μl PCR-reaktioner (ved brug af Taq 5x Master Mix) i to forskellige PCR-rør, en med R26Y primere og den anden med Trp53L primere. Brug voksne mus (typisk omkring 2 – 4 måneders alderen) til alle avl.
- For R26Y, Udfør PCR ved 94 °c i 3 min, derefter ved 94 °c i 30 s, 60 °c i 30 s og 72 °c i 1 min for 35 cyklusser, efterfulgt af 72 °c i 3 min, og vedligeholdelse ved 14 °c. Brug primere (i) R26YFP-1: AAA GTC gct CTG agt TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
Bemærk: et enkelt PCR-bånd på 250 BP indikerer en R26Y homozygote, et enkelt PCR-bånd på 500 BP indikerer en vildtype (WT), og to PCR-bånd (R26Y: 250 bp, WT: 500 BP) indikerer en R26Y heterozygote (figur 1a).
For Trp53L, Udfør PCR ved 94 °c i 3 min, derefter ved 94 °c i 30 s, 60 °c i 30 s og 72 °c i 1 min for 35 cyklusser, efterfulgt af 72 °c i 3 min, og vedligeholdelse ved 14 °c. Brug primere (i) p53F2-10 1f: CAC AAA AAC agg TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
Bemærk: et enkelt PCR-bånd på 370 BP indikerer en Trp53L/l homozygote, et enkelt PCR-bånd på 288 BP indikerer en Trp53+/+ WT, og to PCR-bånd (WT: 288 BP, Trp53L: 370 BP) indikerer en Trp53L /+ heterozygote (figur 1b).
- For R26Y, Udfør PCR ved 94 °c i 3 min, derefter ved 94 °c i 30 s, 60 °c i 30 s og 72 °c i 1 min for 35 cyklusser, efterfulgt af 72 °c i 3 min, og vedligeholdelse ved 14 °c. Brug primere (i) R26YFP-1: AAA GTC gct CTG agt TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. præoperativt præparat
- Autoklave alle kirurgiske værktøjer 1 dag før operationen.
- Forbered 0,1% bromphenolblåt blåt i fosfat-bufferet saltvand (PBS) og opbevar det ved 4 °c. Den ad-CRE, der vil blive anvendt til med injektion i DMEM medium med 0,01 M CaCl2 og bromphenolblåt blå i et forhold på 1:10 (dvs. injektions blandingen), fortyndes.
Bemærk: ad-CRE brugt her blev hentet fra University of Iowa viral vektor kerne, med en bestand viral titer af ~ 1010– 1011 PFU/ml. - Bedøve den kvindelige mus (F2 generation som beskrevet i trin 1,2, alder spænder fra 3 – 4 uger af alder til voksen) ved hjælp af en isofluran kammer og anvende øjensalve. Under proceduren, bedøve musen kontinuerligt ved at sikre det inhalerer 1% – 2.5% isofluran i ilt. Kontroller dybden af anæstesi mindst hver 15 min ved at udføre en tå knivspids. Omhyggeligt overvåge musen for enhver ændring i respiratorisk hastighed, justere niveauet af isofluran i overensstemmelse hermed, hvis det er nødvendigt.
- Injicerer meloxicam som analgesi subkutant i en dosis på 5 mg/kg, før den kirurgiske procedure.
- Udsætte brystvorten operationsstedet ved at anvende flere dråber hårfjerning creme; Fjern overdreven fløde og løst hår ved hjælp af bløde papirhåndklæder.
Bemærk: Udfør dette trin i et område, der er adskilt fra det sted, hvor operationen skal udføres. Barbering anbefales ikke for at undgå beskadigelse af brystvorter. Vær forsigtig med at fjerne kemisk depilatory agent i tide. Hvis du lader agenten blive ved for længe, kan det resultere i kemisk forbrænding på huden - Desinficer det kirurgiske sted med iodophorer først, efterfulgt af 70% alkohol, og med en endelig anvendelse af krat-iodophorer. Gør dette i en cirkulær bevægelse fra midten af arbejdsområdet mod periferien ved hjælp af en gaze svamp eller bomuld-tippet applikator. Gentag cyklussen 3x – 4X.
3. intraductal injektion
- Brug aseptisk teknik under hele operationen.
- Lav en incisionside på huden med en længde på ~ 1 cm mellem de to fjerde lyske MGS (figur 2). Omhyggeligt adskille huden flap (med mg) fra parietal bughinden for at visualisere den bryst duktalt træ.
- Hold forsigtigt brystvorten med urmager pincet og fjern den udvendige nippel uden at skære i nærheden af huden ved hjælp af en mikro-Dissection Scissor.
- Læg ~ 3 – 5 μL ad-CRE-injektions blandingen i en 25 μL Hamilton-sprøjte med en 33 G metal navnål påsat. Beregn mængden af injektions blandingen i sprøjten baseret på det blå farvestof, der indgår i blandingen.
Bemærk: Brug en mindre mængde (f. eks. 3 μL) ved injektion i MGs på 3 – 4 uger gamle hunner og et større volumen (f. eks. 10 μL), når der injiceres i MGs hos diegivende hunner. - Hold forsigtigt kanten af huden flap med en fin buet pincet og Injicer ad-CRE injektion blandingen langsomt ind i brystvorten, i mellemtiden overvåge spredningen af blå farvestof i bryst duktalt træet. Oprethold injektionshastigheden så lavt som muligt for at undgå beskadigelse af duktalt lumen.
Bemærk: injiceret væske (som illustreret ved det medfølgende bromphenolblåt blå farvestof), der spreder sig gennem hele duktalt-træet uden at lække ind i stromale rum indikerer en vellykket med injektion. - Træk forsigtigt nålen ud af brystvorten for at undgå lækage af den injicerede væske.
- Undersøg den distale side (dvs. væk fra brystvorten) af MG eller det omgivende område af den injicerede brystvorte. Bemærk, at hævelse blå farve (dvs., farvestof sprede i nærheden stroma) indikerer en bryst fedt pad injektion snarere end en vellykket med injektion.
- Luk de kirurgiske sår (fra trin 3,2) i huden med sårclips.
4. postoperative pleje
- Fjern musen fra anæstesi og placere den på en varmepude inde i en ren bur til nyttiggørelse.
- Meloxicam administreres subkutant ved 5 mg/kg igen, 24 timer efter operationen.
- Overvåge de generelle betingelser for dyret og se efter tegn på infektion på incisionsstedet i 5 dage.
- Sår klip fjernes ~ 7-10 dage efter operationen.
5. overvågning af udviklingen af brysttumor
- Overvåg de injicerede mus to gange ugentligt ved palpering for ethvert tegn på brysttumor udvikling.
- Når tumoren er håndgribelig, overvåge musen dagligt og måle tumorstørrelse, indtil det når det eksperimentelle endepunkt, som bestemmes af størrelsen (f. eks, nå 10%-15% af musens kropsvægt) eller tilstand (f. eks, ulcererede eller nekrotiske) af tumoren, eller ved generel helbredstilstand af musen (f. eks, comatose, moribund).
- Euthanize musen ved kuldioxid kvælning, efterfulgt af en sekundær metode (f. eks, cervikal dislokation).
- Isoler pattedyrs tumor væv og analysér dem ved flow cytometri, immunofluorescens eller udtryks profilering (f. eks. ved RNA-sekvensering [RNAseq] eller microarray), som beskrevet tidligere12.
- Udfør flow cytometrisk analyse ved at gating for Lineage-negative celler (Lin-: negativ for Lineage markører CD45 [leukocyt markør], CD31 [Endothelial cellemarkør], og TER119 [erythrocyt markør]), og analysere cellerne i tumoren baseret på deres udtryk for YFP, CD24 og CD29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative PCR-genotype resultater for R26Y og Trp53L alleler er vist i figur 1.
Selv om alle 10 Mg'er principielt kan underkastes den intraductale injektionsprocedure, udvælges de to fjerde inginal MGs typisk til injektion på grund af deres lettere tilgængelighed og større MG-størrelser (figur 2). Under operationen er det vigtigt at vedligeholde et desinficeret og overskueligt arbejdsområde og udføre proceduren med sterile værktøjer (figur 3). Under den intraductale injektion bidrager optagelsen af et blåt farvestof (f. eks. bromphenolblåt blå) i injektions blandingen til visualisering af en vellykket injektion af ad-CRE i hele duktalt-træet (figur 4). De yngste hunmus, hvor med injektion (med en mindre mængde af injektions blandingen) kan udføres med succes er dem på ~ 3 uger af alder (figur 4a), selv for de fleste brysttumor induktions eksperimenter, unge voksne hunmus (f. eks. 2 måneders alderen) anvendes typisk (figur 4b). Desuden kan med injektion (med en større mængde af injektions blandingen) også udføres hos hunmus under tidlig/midgestation for at målrette alveolære celler (figur 4c).
I vores erfaring, i mus med R26Y reporter og Trp53L/l (med eller uden yderligere betingede alleler), CRE-medieret rekombination forstyrret Trp53 betingede knockout alleler (og eventuelle yderligere betinget udskæring alleler, hvis brugt) og i mellemtiden, tændt YFP reporter (fra R26Y allele, samt fra eventuelle yderligere betinget Knock-in allele, hvis de anvendes). Til at målrette forskellige MEC subpopulationer for brystkræft tumor induktion, ad-CRE vira under kontrol af forskellige MEC delmængde-specifikke promotorer blev anvendt til injektion (figur 5). For eksempel blev ad-CRE under kontrol af keratin 8 (Krt8) Promoter (ad-K8-CRE) anvendt til at målrette luminale mecs. Tidligere rapporterede vi om brugen af ad-CRE under kontrol af keratin 14 (Krt14) promotoren (ad-K14-CRE) til at målrette basal mecs13. Men, som vi rapporterede, med injektion af ad-K14-CRE ikke kun målrettede basal mecs, men også en del af luminale mecs13. Vi har for nylig testet en anden ad-CRE under kontrol af keratin 5 (Krt5) Promoter (ad-K5-CRE)14 og fandt, at det kan mere stramt målrette basal afstamning, fører til genetisk mærkning af kun basal mecs (figur 5). De typiske procentdele af YFP-mærkede MECs fra enten ad-K8-CRE eller ad-K5-CRE injektion er omkring 0,1%-1%.
For Trp53L/l; R26Y hunmus under fvb genetiske baggrund, med injektion af ad-K8-CRE, som er rettet mod deres luminale mecs, førte til udviklingen af Brystkirtler tumorer flere måneder efter injektionen (figur 6a). Mus med en anden genetisk baggrund (f. eks. C57/B6) kan udvise en længere ventetid for at udvikle brystkirtler efter injektion. På grund af optagelsen af den betingede R26Y reporter, tumor epiteliale celler var typisk mærket af yfp og kunne påvises ved flow flowcytometri (figur 6b); de kunne beriges ved flow-sortering af YFP+ celler til yderligere analyse.
Figur 1: repræsentative PCR-genotype resultater for R26Y og Trp53L alleler. WT = vildtype; Homo = homozygote. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk diagram af med injektion af ad-CRE virus i en mg. A) indsnit sted i midterlinjen mellem de to fjerde MGS.B) intraductal injektion af ad-CRE med et blåt farvestof (for bedre visualisering) i en af de fjerde MGS.C) lukning af snittet i huden ved hjælp af sårclips. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: oversigt over aseptisk opsætning af gnaver kirurgi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: visualisering af en vellykket med injektion i hele bryst duktalt-træet. A) et eksempel på med injektion af 3 μl injektions blanding (med bromphenolblåt blåt) til en mg af en 3-ugers-gammel kvindelig mus. B) intraductal injektion af 5 μl injektions blanding i en mg af en ung voksen kvindelig mus. C) intraductal injektion af 10 μl injektions blanding i en mg kvindelig mus ved tidlig/midgestation. D) et eksempel på injektion af en bryst fedt pude i stedet for en vellykket med injektion. Intraductal injektion af 5 μL injektions blanding i en MG af en ung voksen kvindelig mus. a) hudområdet omkring den injicerede brystvorte b) den anden side af hudklappen, der viser mælke fedtpuden gul cirkel indikerer farvestof diffvant i fat pad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative observationsområder for strømnings cytometrisk analyse af yfp-mærkede celler ved med injektion. Yfp+ populationer fra MGS af R26Y jomfru kvinder 3 dage efter en med injektion af ad-K8-CRE (venstre, injektion på en titer af 7 x 109 PFU/ml) eller ad-K5-CRE (højre, injektion ved en titer på 7,86 x 109 PFU/ mL) vira. Parceller er baseret på en analyse af CD24 og CD29 farvning i Lineage-negative (Lin-, dvs., negativ for CD45, CD31, og TER119 udtryk) yfp+ celler. Lu = Lin-CD24højCD29lav luminale MEC Gate; BA = Lin-CD24lavCD29høj basal MEC Gate; gating-strategien for luminale og basal MECs er baseret på Shackleton et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: tumor udvikling i Trp53L/l; R26Y hunmus intraductally injiceres med ad-K8-CRE. (A) en repræsentativ mus viser tumorvækst (pile) flere måneder efter en injektion med ad-K8-CRE. (B) omkring 8,8% af levende celler (baseret på dapi-farvning) fra en repræsentativ tumor var positive for yfp-ekspression baseret på flow cytometrisk analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesen med denne tilgang til at inducere brysttumorer fra forskellige delpopulationer af mecs afhænger ikke kun af at vælge passende celle-type-specifikke promotorer (for at drive CRE-ekspression), men også af den med injektionsprocedure selv. Ideen bag denne fremgangsmåde er, at de injicerede ad-CRE vira bevares i duktalt træet, som er en skjult struktur med lumen, og derfor er kun mecs udsat for virus og er inficeret af ad-CRE. På grund af den begrænsede lumen plads i mælkekanalerne, er det vigtigt kun at injicere en lille mængde af injektion blandingen til hver MG (dvs., ~ 3-5 μL). Den injicerede mængde bør også justeres ud fra musene alder (dvs. en mindre mængde bør anvendes, når den injiceres i 3-til 4-ugers-gamle mus). Når mængden af den injicerede væske er overdreven på grund af trykket fra injektionen og den begrænsede duktalt lumen rum, kan væsken være "skubbet ud" gennem epiteliale lag i stroma, fører til en uønsket viral infektion i stromale celler.
Da den celletype specificitet opnås ved arrangøren anvendes i adenovirale vektor til at drive CRE udtryk, en begrænsning af denne tilgang er den potentielle mangel på en passende promotor at målrette CRE udtryk til en bestemt MEC subpopulation. Vi har tidligere rapporteret brugen af Pan-luminale ad-K8-CRE virus til at målrette luminale mecs12,13 og brugen af ad-WAP-CRE virus til at målrette alveolære luminale forfædre5. I denne undersøgelse, vi viste brugen af ad-K5-CRE virus til at målrette basal mecs (figur 5). Vi mangler stadig evnen til at bruge denne tilgang til at målrette østrogen receptor-positive luminale MEC subpopulation. Den adenovirale vektor vi brugte her kunne rumme en indsats på op til 8 KB. For at udvikle MEC-delmængde-specifik ad-CRE, kan arrangøren, der bruges til at drive CRE-ekspression, kun være mindre end 7 KB. Praktisk, en stor promotor fragment, selv om mindre end 7 KB i størrelse, kan være vanskeligt at subclone. For at passe ind i adenovirale vektor, selv om en trunkeret promotor kan anvendes, kan det ikke trofast rekapitulere udtryks mønstret af dets tilsvarende gen, når under kontrol af den endogene, fuld promotor.
Den R26Y betingede reporter inkluderet i musemodellen her gav en måde at markere cellerne i oprindelsen og spore deres progression til kræftceller. Af note, den procentdel af YFP-mærkede cancerceller i den resulterende tumor syntes at være forholdsvis lav (figur 6b). Dette kunne være på grund af en mulighed for, at, ud over de YFP-mærkede tumor epiteliale celler, tumoren også inkluderet mange immunceller og stromale celler, som udgjorde hovedparten af tumormassen.
Sammenlignet med andre musemodeller af brystkræft, denne tilgang fører til brysttumor initiering fra et lille antal mecs kun (f. eks luminale mecs når ad-K8-CRE injiceres), ofte på et klonal niveau12. Da initiering af human tumor sandsynligvis vil være klonal, denne tilgang rekapitulerer dette aspekt af menneskelig kræft udvikling mere trofast. Desuden, selv når P53 er forstyrret i kun et lille antal MECs, tab af P53 fører til deres klonal ekspansion, fører til produktion af en større pulje af muterede MECs; Dette ville muliggøre yderligere klonal evolution fra P53-mangelfulde MECs (ved erhvervelse af yderligere somatiske mutationer)12. Da TP53 er det mest almindeligt muterede gen i human brystkræft 16 og som TP53 mutation er en tidlig begivenhed i human Breast tumor17,18, ved at kombinere Trp53 floxed musemodel med mus modeller for andre onkogene begivenheder, vi kan studere, hvordan disse onkogene begivenheder samarbejder med P53 tab, og hvordan de i fællesskab bidrager til brystkræft tumor udvikling fra en defineret cellulær oprindelse. Hertil kommer, som mindre avl er nødvendig for at sætte flere alleler sammen, denne fremgangsmåde vil minimere avl omkostninger og tid, som bør lette brystkræft modellering undersøgelser på en større skala, i en kortere periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Grant R01 CA222560 og af Department of Defense gennembrud Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
