Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en ny brystkreft modellering tilnærming basert på intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker adenovirus inn mus melkekjertler. Denne tilnærmingen gjør at både celle-type-og organ-spesifikk manipulering av kreftfremkallende hendelser i en timelig kontrollert måte.
Abstract
Brystkreft er en heterogen sykdom, muligens på grunn av komplekse interaksjoner mellom ulike celler av opprinnelse og kreftfremkallende hendelser. Musemodeller er medvirkende til å få innsikt i disse komplekse prosessene. Selv om mange musemodeller har blitt utviklet for å studere bidrag av ulike kreftfremkallende hendelser og Opprinnelses celler til bryst tumorigenesis, er disse modellene ofte ikke celle-type eller organ spesifikk eller kan ikke indusere initiering av bryst tumorigenesis i en midlertidig kontrollert måte. Her beskriver vi en protokoll for å generere en ny type brystkreft mus modeller basert på intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker adenovirus (ad-grobunn) i mus melkekjertler (MGs). På grunn av direkte injeksjon av ad-grobunn i melke kanaler, denne tilnærmingen er MG spesifikk, uten uønsket kreft induksjon i andre organer. Den intraductal injeksjon prosedyren kan utføres i mus på ulike stadier av deres MG utvikling (dermed tillater det Temporal kontroll av kreft induksjon, fra ~ 3-4 ukers alder). Den celle-type spesifisitet kan oppnås ved å bruke ulike celle-type-spesifikke arrangører til å drive grobunn uttrykk i adenoviral vektor. Vi viser at luminal og basal melke epitelceller (MECs) kan være tett målrettet for grobunn/loxP-basert genetisk manipulasjon via en intraductal injeksjon av ad-grobunn under kontroll av keratin 8 eller keratin 5 promoter, henholdsvis. Ved å innlemme en betinget grobunn reporter (f. eks grobunn/loxP-induserbart Rosa26-YFP reporter), viser vi at MECs målrettet av ad-grobunn, og tumorceller avledet fra dem, kan spores ved å følge reporter-positive celler etter intraductal injeksjon.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle en ny brystkreft modellering tilnærming basert på en intraductal injeksjon av ad-grobunn i musen MG. Den grobunn/loxP rekombinasjon genetiske tilnærmingen har vært mye brukt til å modellere menneskelig brystkreft hos mus. Den første generasjonen av grobunn/loxP-baserte brystkreft mus modeller er generert ved hjelp av grobunn-uttrykker transgene mus under kontroll av MEC-spesifikke arrangører (f. eks MMTV-grobunn for luminal MECs og en del av basal MECs, WAP-grobunn og Blg-grobunn for luminal forfedre og alveolære Luminal MECs, K14-grobunn for basal og en del av luminal MECs1,2,3,4,5)6, 7 andre er , 8 på alle , 9. men selv om disse grobunn transgene Lines muliggjør romlig kontroll av grobunn uttrykk (dvs. i ulike delsett av MECs), de ikke tillater timelig kontroll av grobunn uttrykk og grobunn/loxP-mediert genetisk manipulasjon. Den andre generasjonen av grobunn/loxP-baserte brystkreft mus modeller benytte induserbart grobunn aktivitet/uttrykk tilnærminger (f. eks bruk av grobunn-østrogen reseptor fusjon [CreER], som bare kan indusere grobunn/loxP rekombinasjon ved administrering av Tamoxifen), og som et resultat, disse genetiske verktøyene tillater både romlige og timelige kontroller av aktiveringen av kreftfremkallende hendelser i MECs (f. eks, K8-CreER-og K5-CreER-baserte modeller)10,11,12 . I begge generasjoner av brystkreft mus modeller, som arrangører brukes til å drive grobunn eller CreER uttrykk (f. eks Krt8, Krt5) kan også være aktiv i epitelceller i andre organer (dvs. de er celle-type-spesifikke, men ikke organ-spesifikk) eller har en lekk uttrykk i celletyper enn epitelceller (f. eks, MMTV, som har Leaky aktivitet i benmarg blodkreft celler), kan disse tilnærmingene føre til utvikling av uønsket kreft (s) i andre organ (s). Hvis disse uventede kreft forårsaker dødelighet i de berørte mus, det opprinnelige formålet med modellering brystkreft i disse musene kan være forbudt (f. eks, MMTV-grobunn-drevet kreftfremkallende hendelser kan føre til blodkreft ondartet og tidlig død av mus , på grunn av leakiness av MMTV arrangøren i blodkreft celler)4.
Her rapporterer vi en brystkreft modellering tilnærming i mus som gjør at både celle-type-og organ-spesifikk manipulering av kreftfremkallende hendelser i en timelig kontrollert måte. Denne tilnærmingen er basert på en intraductal injeksjon av ad-grobunn i musen MGs (og er dermed organ-spesifikke). Grobunn uttrykket kan styres ved hjelp av ulike MEC pasientpopulasjonen-spesifikke arrangører innebygd i adenoviral vektor (f. eks Krt8 for luminal MECs, Krt5 for basal MECs, og dermed oppnå Cell-type spesifisitet). Kreft induksjon i MGs kan være timelig styrt av en injeksjon av ad-grobunn i mus på ulike aldre, fra 3-4 ukers alder (pubertale) til voksen scenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Brigham og Women ' s Hospital.
1. generering og vedlikehold av floxed mus
- Få brystkreft-relevant floxed betinget knockout (f. eks Trp53tm1Brn [referert til som Trp53L/l], Brca1tm1Aash [Brca1L/l]) eller betingede knock-in muse linjer (f. eks Gt (rosa) 26SorTm1 (PIK3CA * H1047R) Egan) fra The Jackson Laboratory (JAX) eller NCI Mouse modeller av Human Cancer Consortium (MMHCC) depotet. I tillegg, for å lette jakten på MECs som gjennomgår grobunn-mediert rekombinasjon, en betinget grobunn-reporter linje kan også fås fra JAX (f. eks gt (rosa) 26SorTM1 (EYFP) cos [referert til som R26Y]).
- Breed Trp53L/l homozygote mus med R26Y homozygote reporter mus eller med homozygote mus bærer R26Y reporter alleler og eventuelle ytterligere floxed betinget knockout eller knock-in alleler for ulike musemodeller, for å få heterozygot F1 mannlige og kvinnelige avkom.
- Intercross heterozygot F1 mannlige og kvinnelige mus for å få F2 sammensatte kvinnelige mus som er homozygote for hver allel (som eksperimentelle mus), så vel som R26Y-bare homozygote kvinner (som kontroll mus). Genotype F2-mus basert på PCR-primere og sykkelforhold listet nedenfor, ved å sette opp to standard 20 μL PCR-reaksjoner (ved bruk av Taq 5X Master Mix) i to forskjellige PCR-rør, en med R26Y -primere og den andre med Trp53L primere. Bruk voksen mus (vanligvis rundt 2 – 4 måneders alder) for all avl.
- For R26Y, Utfør PCR ved 94 ° c i 3 min, deretter ved 94 ° c i 30 s, 60 ° c i 30 s, og 72 ° c i 1 min for 35 sykluser, etterfulgt av 72 ° c i 3 min, og vedlikehold ved 14 ° c. Bruk primere (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA-konto; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
Merk: et enkelt PCR-band på 250 BP indikerer en R26Y homozygot, et enkelt PCR-band på 500 BP indikerer en vill-type (WT), og to PCR-band (R26Y: 250 bp, WT: 500 BP) indikerer en R26Y heterozygot (figur 1a).
For Trp53L, Utfør PCR ved 94 ° c i 3 min, deretter ved 94 ° c i 30 s, 60 ° c for 30 s, og 72 ° c i 1 min for 35 sykluser, etterfulgt av 72 ° c i 3 min, og vedlikehold ved 14 ° c. Bruk primere (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
Merk: et enkelt PCR-band på 370 BP indikerer en Trp53L/l homozygot, et enkelt PCR-band på 288 BP indikerer en Trp53+/+ WT, og to PCR-band (WT: 288 BP, Trp53L: 370 BP) indikerer en Trp53L /+ heterozygot (figur 1B).
- For R26Y, Utfør PCR ved 94 ° c i 3 min, deretter ved 94 ° c i 30 s, 60 ° c i 30 s, og 72 ° c i 1 min for 35 sykluser, etterfulgt av 72 ° c i 3 min, og vedlikehold ved 14 ° c. Bruk primere (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA-konto; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. preoperativ forberedelse
- Autoklav alle kirurgiske verktøy 1 dag før operasjonen.
- Forbered 0,1% bromophenol blå i fosfat-bufret saltvann (PBS) og oppbevar den ved 4 ° c. Fortynne ad-grobunn som skal brukes for intraductal injeksjon i DMEM medium med 0,01 M CaCl2 og bromophenol blå i forholdet 1:10 (dvs. injeksjon blanding).
Merk: Ad-grobunn brukes her ble innhentet fra University of Iowa viral Vector Core, med en aksje viral titer på ~ 1010-1011 PFU/ml. - Bedøve den kvinnelige musen (F2 generasjon som beskrevet i trinn 1,2, alder fra 3 – 4 ukers alder til voksen) ved hjelp av et isoflurane kammer og påfør øye salve. Under prosedyren, bedøve musen kontinuerlig ved å sikre det inhalerer 1%-2,5% isoflurane i oksygen. Sjekk dybden av anestesi minst hver 15 min ved å utføre en tå knipe. Nøye overvåke musen for eventuelle endringer i respirasjonsfrekvens, justere nivået av isoflurane tilsvarende, hvis nødvendig.
- Injiser meloksikam som analgesi subkutant ved en dose på 5 mg/kg, før kirurgisk inngrep.
- Utsett brystvorten operasjonsstedet ved å bruke flere dråper hårfjerning krem; fjerne overdreven fløte og løs hår ved hjelp av myke papirhåndklær.
Merk: Utfør dette trinnet i et område adskilt fra der operasjonen skal utføres. Barbering er ikke anbefalt for å unngå skade på brystvortene. Vær forsiktig med å fjerne kjemisk riktige middel i tide. Leaving agenten på for lenge kan føre til kjemiske brenne på huden - Desinfisere operasjonsstedet med iodophors først, etterfulgt av 70% alkohol, og avslutt med en endelig påføring av skrubb iodophors. Gjør dette i en sirkulær bevegelse fra midten av arbeidsområdet mot periferien ved hjelp av en gasbind svamp eller bomull-tippet applikator. Gjenta syklusen 3x – 4X.
3. intraductal injeksjon
- Bruk aseptisk teknikk gjennom hele den kirurgiske prosedyren.
- Lag et snittområde på huden i en lengde på ~ 1 cm mellom de to fjerde lysken MGs (figur 2). Forsiktig skille huden klaff (med MG) fra parietal peritoneum slik visualisere bryst ductal treet.
- Hold forsiktig brystvorten med urmaker ' s tang og fjern den utvendige brystvorten uten å kutte noen nærliggende hud, ved hjelp av en mikro-disseksjon saks.
- Load ~ 3 – 5 μL av ad-grobunn injeksjon blandingen i en 25 μL Hamilton sprøyte med en 33 G metall hub nål festet. Beregn volumet av injeksjons blandingen i sprøyten basert på det blå fargestoffet som inngår i blandingen.
Merk: Bruk et mindre volum (f.eks. 3 μL) når du injiserer på MGs-3 – 4 uker gamle hunner og et større volum (for eksempel 10 μL) når du injiserer inn i MGs of ammende kvinner. - Forsiktig holde kanten av huden klaff med en fin buet TWEEZER og injisere ad-grobunn injeksjon blandingen langsomt inn i brystvorten, i mellomtiden overvåke spredning av blått fargestoff inn i bryst ductal treet. Oppretthold injeksjons raten så lavt som mulig for å unngå skade på ductal lumen.
Merk: injisert væske (som illustrert av den med følgende bromophenol blå fargestoff) sprer seg gjennom hele ductal treet uten lekker inn i stromal kupé indikerer en vellykket intraductal injeksjon. - Trekk nålen forsiktig ut av brystvorten for å unngå lekkasje av injisert væske.
- Undersøk den fjerne siden (dvs. borte fra brystvorten) til MG eller området rundt den innsatte brystvorten. Merk at hevelse blå fargestoff (dvs. Dye spre inn i nærliggende stroma) indikerer en bryst fett pad injeksjon snarere enn en vellykket intraductal injeksjon.
- Lukk kirurgiske sår (fra trinn 3,2) i huden med sår klipp.
4. postoperativ behandling
- Fjern musen fra anestesi og plassere den på en oppvarming pad inne i et rent bur for utvinning.
- Administrer meloksikam subkutant ved 5 mg/kg igjen, 24 timer etter operasjonen.
- Overvåk de generelle vilkårene for dyret og se etter tegn på infeksjon på snittstedet i 5 dager.
- Sår klipp fjernes ~ 7-10 dager etter operasjonen.
5. overvåkning av utviklingen av melke svulsten
- Monitor injisert mus to ganger ukentlig av palpasjon for noen tegn på brystkreft utvikling.
- Når svulsten er håndgripelig, overvåke musen daglig og måle tumor størrelse til den når det eksperimentelle endepunktet, som bestemmes av størrelsen (f. eks, nå 10%-15% av musen kroppsvekt) eller tilstand (f. eks, ulcerated eller nekrotisk) av svulsten, eller av generell helsetilstand av musen (f. eks, komatøs, døende).
- Euthanize musen ved karbondioksid kvelning, etterfulgt av en sekundær metode (f. eks cervical forvridning).
- Isoler brystkreft vevet og analyser dem ved å flyte flowcytometri, immunofluorescence eller uttrykks profiler (f.eks. ved RNA-sekvenser [RNAseq] eller Microarray), som beskrevet tidligere12.
- Utfør Flow analytiske analyse av gating for avstamning-negative celler (Lin-: negativt for AVSTAMNING markører CD45 [leukocytter markør], CD31 [endothelial celle markør], og TER119 [erytrocytt markør]), og analysere cellene i svulsten basert på deres uttrykk for YFP, CD24 og CD29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative PCR genotyperingteknologi resultater for R26Y og Trp53L alleler er vist i figur 1.
Selv om, i prinsippet, alle 10 MGs kan bli utsatt for intraductal injeksjon prosedyre, praktisk talt, de to fjerde lysken MGs er vanligvis valgt for injeksjon, på grunn av deres lettere tilgjengelighet og større MG størrelser (figur 2). Under operasjonen er det viktig å opprettholde et desinfiseres og ryddig arbeidsområde og utføre prosedyren med sterile verktøy (Figur 3). Under intraductal injeksjon, hjelper inkludering av et blått fargestoff (f. eks, bromophenol blå) i injeksjon blandingen visualisering av en vellykket injeksjon av ad-grobunn i hele ductal treet (Figur 4). De yngste kvinnelige mus der intraductal injeksjon (med et mindre volum av injeksjon blanding) kan utføres med hell er de på ~ 3 ukers alder (figur 4a), men for de fleste brystkreft induksjon eksperimenter, unge voksne kvinnelige mus (f.eks. 2 måneders alder) brukes vanligvis (figur 4b). I tillegg kan intraductal injeksjon (med et større volum av injeksjon blanding) også utføres i kvinnelige mus i løpet av tidlig/midten av svangerskapet for å målrette alveolære celler (figur 4c).
I vår erfaring, i mus med R26Y reporter og Trp53L/l (med eller uten noen ekstra betinget alleler), grobunn-mediert rekombinasjon forstyrret Trp53 betinget knockout alleler (og eventuelle ytterligere betinget knockout alleler, hvis brukt) og, i mellomtiden, slått på YFP reporter (fra R26Y allel, så vel som fra eventuelle ytterligere betinget knock-in allel, hvis brukt). For å målrette ulike MEC subpopulasjoner for brystkreft induksjon, Ad-grobunn virus under kontroll av ulike MEC delsett-spesifikke arrangører ble brukt til injeksjon (figur 5). For eksempel, Ad-grobunn under kontroll av keratin 8 (Krt8) promoter (Ad-K8-grobunn) ble brukt til å målrette luminal MECs. Tidligere har vi rapportert bruk av ad-grobunn under kontroll av keratin 14 (Krt14) promoter (Ad-K14-grobunn) for å målrette basal MECs13. Men som vi rapporterte, intraductal injeksjon av Ad-K14-grobunn ikke bare målrettede basal MECs men også en del av luminal MECs13. Vi har nylig testet en annen ad-grobunn under kontroll av keratin 5 (Krt5) promoter (Ad-K5-grobunn)14 og fant at det kan tettere målrette basal avstamning, som fører til genetisk merking av bare basal MECs (figur 5). De typiske prosentene av YFP-merket MECs fra enten Ad-K8-grobunn eller Ad-K5-grobunn injeksjon er om lag 0,1%-1%.
For Trp53L/l; R26Y kvinnelige mus under FVB genetiske bakgrunn, intraductal injeksjon av Ad-K8-grobunn, som er rettet mot deres luminal MECs, førte til utviklingen av melke svulster flere måneder etter injeksjonen (figur 6a). Mus med en annen genetisk bakgrunn (f. eks, C57/B6) kan vise en lengre ventetid for å utvikle melke svulster etter injeksjon. På grunn av inkluderingen av den betingede R26Y reporter, var tumor epitelceller vanligvis PREGET av YFP og kunne oppdages ved flyt flowcytometri (figur 6b); de kan bli beriket av flyt-sortering av YFP+ celler for videre analyse.
Figur 1: REPRESENTATIVE PCR-genotyperingteknologi resultater for R26Y og Trp53L alleler. WT = vill-type; Homo = homozygot. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk diagram av intraductal injeksjon av ad-grobunn virus i en mg. (A) snittområdet i midtlinjen mellom de to fjerde MGS. (B) intraductal injeksjon av ad-grobunn med et blått fargestoff (for bedre visualisering) til en av de fjerde MGS. (C) lukking av snittet i huden av såret klipp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 3: oversikt over aseptisk oppsett for gnagere kirurgi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: visualisering av en vellykket intraductal injeksjon i hele melke ductal treet. (A) et eksempel på intraductal injeksjon av 3 μL av injeksjon blanding (med bromophenol blå) til en mg av en 3-ukers-gammel kvinnelig mus. (B) intraductal injeksjon av 5 μL av injeksjon blandingen i en mg av en ung voksen kvinnelig mus. (C) intraductal injeksjon av 10 μL av injeksjon blandingen i en mg av en kvinnelig mus på tidlig/midten av svangerskapet. (D) et eksempel på en bryst fett pad injeksjon snarere enn en vellykket intraductal injeksjon. Intraductal injeksjon av 5 μL av injeksjon blandingen i en MG av en ung voksen kvinnelig mus. (a) huden området rundt injisert brystvorten; (b) den andre siden av hud klaffen som viser melkefett puten; gul sirkel indikerer Dye diffust inn i fett puten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative plott av flyten analytiske analyse av YFP-markerte celler ved intraductal injeksjon. YFP+ populasjoner fra MGS av R26Y Virgin kvinner 3 dager etter en intraductal injeksjon av Ad-K8-grobunn (venstre, injeksjon ved en titer på 7 x 109 PFU/ml) eller Ad-K5-grobunn (høyre, injeksjon ved en titer på 7,86 x 109 PFU/ mL) virus. Tomter er basert på en analyse av CD24 og CD29 farging i avstamning-negative (Lin-; dvs., negativ for CD45, CD31 og TER119 uttrykk) YFP+ celler. Lu = Lin-CD24høyCD29lav luminal MEC gate; Ba = Lin-CD24lavCD29høy basal MEC gate; gating strategien for luminal og basal MECs er basert på Shackleton et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: tumor utvikling i Trp53L/l; R26Y kvinnelige mus intraductally injisert med Ad-K8-grobunn. (A) en representant mus som viser tumor vekst (piler) flere måneder etter en injeksjon med Ad-K8-grobunn. (B) om 8,8% av levende celler (basert på DAPI farging) fra en representativ svulst var positive for YFP uttrykk, basert på flyt analytiske analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suksessen til denne tilnærmingen for inducing melke svulster fra ulike subpopulasjoner av MECs stoler ikke bare på å velge riktig celle-type-spesifikke arrangører (for å drive grobunn uttrykk), men også på intraductal injeksjon prosedyren selv. Ideen bak denne tilnærmingen er at injisert ad-grobunn virus beholdes i ductal treet, som er en skjult struktur med lumen, og derfor bare MECs er eksponert for virus og er infisert av ad-grobunn. På grunn av den begrensede lumen i melke kanalene, er det viktig å bare injisere et lite volum av injeksjons blandingen til hver MG (dvs. ~ 3-5 μL). Det innsatte volumet bør også justeres basert på mus alderen (dvs. et mindre volum bør brukes når det injiseres i 3-til 4-ukers-gamle mus). Når volumet av injisert væsken er overdreven på grunn av trykket fra injeksjon og begrenset ductal lumen plass, kan væsken være "skjøvet ut" gjennom epitel lag i stroma, fører til en uønsket viral infeksjon i stromal celler.
Siden celle-type spesifisitet oppnås ved arrangøren brukes i adenoviral vektor å kjøre grobunn uttrykk, en begrensning av denne tilnærmingen er den potensielle mangelen på en hensiktsmessig promoter å målrette grobunn uttrykk til en bestemt MEC pasientpopulasjonen. Vi har tidligere rapportert bruk av Pan-luminal Ad-K8-grobunn virus å målrette luminal MECs12,13 og bruk av Ad-WAP-grobunn virus å målrette alveolære luminal forfedre5. I denne studien, viste vi bruk av Ad-K5-grobunn virus å målrette basal MECs (figur 5). Vi mangler fortsatt muligheten til å bruke denne tilnærmingen til å målrette østrogen reseptor-positive luminal MEC pasientpopulasjonen. Det adenoviral vektor vi anvendt her over kunne huse en innsette av til 8 KB. Derfor, for å utvikle MEC-delsett-spesifikke ad-grobunn, arrangøren brukes til å kjøre grobunn uttrykket kan bare være mindre enn 7 kB. Praktisk talt, en stor promoter fragment, selv om mindre enn 7 KB i størrelse, kan være vanskelig å subclone. For å passe inn i adenoviral vektor, selv om en avkortet promoter kan brukes, kan det ikke trofast recapitulate uttrykket mønster av den tilsvarende genet når under kontroll av den endogene, full promoter.
Den R26Y betinget reporter inkludert i muse modellen her gitt en måte å markere celler opprinnelse og spore deres progresjon til kreftceller. Av notatet, andelen YFP-markerte kreftceller i den resulterende svulsten så ut til å være ganske lav (figur 6b). Dette kan skyldes en mulighet for at, i tillegg til YFP-merket tumor epitelceller, svulsten også inkludert mange immunceller og stromal celler, som utgjorde mesteparten av tumor massen.
Sammenlignet med andre musemodeller av brystkreft, denne tilnærmingen fører til brystkreft initiering fra et lite antall MECs bare (f. eks, luminal MECs når Ad-K8-grobunn injiseres), ofte på et klonal nivå12. Som initiering av menneskelig tumorigenesis vil trolig bli klonal, denne tilnærmingen viser at aspektet av menneskelig kreftutvikling mer trofast. I tillegg, selv når p53 er forstyrret i bare et lite antall MECs, tap av p53 fører til deres klonal ekspansjon, som fører til produksjon av en større pool av mutert MECs; Dette ville tillate ytterligere klonal evolusjon fra p53-mangelfull MECs (ved oppkjøp av ytterligere somatiske mutasjoner)12. Som TP53 er det mest muterte genet i menneskelig brystkreft16 og som TP53 mutasjon er en tidlig hendelse i menneskets bryst tumorigenesis17,18, ved å kombinere Trp53 floxed musemodell med mus modeller for andre kreftfremkallende hendelser, kan vi studere hvordan disse kreftfremkallende hendelser samarbeide med p53 tap og hvordan de i fellesskap bidra til bryst tumor utvikling fra en definert cellulær opprinnelse. I tillegg, som mindre avl er nødvendig for å sette flere alleler sammen, ville denne tilnærmingen minimere avl kostnader og tid, noe som bør legge til rette for brystkreft modellering studier på en større skala, i en kortere periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) stipend R01 CA222560 og ved Department of Defense gjennombrudd Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
