Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य माउस स्तन ग्रंथियों में क्रे-सब्सक्राइफिंग एडेनोवायरस के इंट्राडक्टल इंजेक्शन के आधार पर एक नए स्तन कैंसर मॉडलिंग दृष्टिकोण का वर्णन करना है। यह दृष्टिकोण दोनों सेल प्रकार की अनुमति देता है- और एक लौकिक नियंत्रित तरीके से oncogenic घटनाओं के अंग विशेष हेरफेर.
Abstract
स्तन कैंसर एक विषमांगी रोग है, संभवतः मूल और oncogenic घटनाओं के विभिन्न कोशिकाओं के बीच जटिल बातचीत के कारण. माउस मॉडल इन जटिल प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. हालांकि कई माउस मॉडल विभिन्न oncogenic घटनाओं और स्तन tumorigenesis के लिए मूल की कोशिकाओं के योगदान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, इन मॉडलों अक्सर सेल प्रकार या अंग विशिष्ट नहीं हैं या एक में स्तन tumorigenesis की दीक्षा प्रेरित नहीं कर सकते लौकिक रूप से नियंत्रित तरीके से। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए स्तन कैंसर माउस मॉडल के एक नए प्रकार के आधार पर Cre-expressing एडेनोवायरस (विज्ञापन-Cre) माउस स्तन ग्रंथियों (MGs) में intraductal इंजेक्शन उत्पन्न करने के लिए. स्तन नलिकाओं में विज्ञापन-क्री के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के कारण, इस दृष्टिकोण एमजी विशिष्ट है, अन्य अंगों में किसी भी अवांछित कैंसर प्रेरण के बिना. इंट्राडकटल इंजेक्शन प्रक्रिया चूहों में उनके एमजी विकास के विभिन्न चरणों में किया जा सकता है (इस प्रकार, यह कैंसर प्रेरण के अस्थायी नियंत्रण की अनुमति देता है, उम्र के 3-4 सप्ताह से शुरू). सेल-प्रकार की विशिष्टता एडेनोवायरल वेक्टर में क्रे एक्सप्रेशन को ड्राइव करने के लिए विभिन्न सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। हम बताते हैं कि luminal और बेसल स्तन उपकला कोशिकाओं (MECs) कसकर Cre/loxP के लिए लक्षित किया जा सकता है आधारित आनुवंशिक हेरफेर के नियंत्रण में विज्ञापन-Cre के एक intraductal इंजेक्शन के माध्यम से 8 या Keratin 5 प्रमोटर, क्रमशः. एक सशर्त क्रे रिपोर्टर को शामिल करके (जैसे, Cre/loxP-प्रेरित Rosa26-YFP रिपोर्टर), हम बताते हैं कि एमईसी विज्ञापन-Cre द्वारा लक्षित है, और ट्यूमर कोशिकाओं उन से व्युत्पन्न, इंट्रासेटल इंजेक्शन के बाद रिपोर्टर सकारात्मक कोशिकाओं का पालन करके पता लगाया जा सकता है।
Introduction
इस विधि का समग्र लक्ष्य माउस एमजी में विज्ञापन-क्री के एक इंट्राडकल इंजेक्शन के आधार पर एक नया स्तन कैंसर मॉडलिंग दृष्टिकोण विकसित करने के लिए है। Cre/loxP पुनर्संयोजन आधारित आनुवंशिक दृष्टिकोण व्यापक रूप से चूहों में मानव स्तन कैंसर मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है. Cre/loxP आधारित स्तन कैंसर माउस मॉडल की पहली पीढ़ी MEC-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में Cre-expressing ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके उत्पन्न कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, MMTV-Cre luminal MECs के लिए और बेसल MECs के एक हिस्से, Wap-Cre और Blg-Cre के लिए luminal संतति और कूपिका luminal MECs, K14-Cre के लिए बेसल और luminal MECs के एक हिस्से1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9.हालांकि, जबकि ये क्रे ट्रांसजेनिक लाइनें क्रे अभिव्यक्ति के स्थानिक नियंत्रण को सक्षम करती हैं (यानी, एमईसी के विभिन्न सबसेटों में), वे क्रे अभिव्यक्ति और क्रे/लोक्सपी-मध्यस्थ आनुवंशिक हेरफेर के अस्थायी नियंत्रण की अनुमति नहीं देते हैं। Cre/loxP-आधारित स्तन कैंसर माउस मॉडल की दूसरी पीढ़ी inducible Cre activity/expression दृष्टिकोण का उपयोग (जैसे, Cre-एस्ट्रोजन रिसेप्टर संलयन [CreER] का उपयोग, जो केवल tamoxifen के प्रशासन पर Cre/loxP पुनर्संयोजन प्रेरित कर सकते हैं), और एक परिणाम के रूप में, इन आनुवंशिक उपकरण MECs में oncogenic घटनाओं के सक्रियण के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण दोनों की अनुमति (जैसे, K8-Creer- और K5-Creerआधारित मॉडल)10,11,12 . स्तन कैंसर माउस मॉडल की दोनों पीढ़ियों में, के रूप में प्रमोटरों Cre या CreER अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया (जैसे, Krt8, Krt5) भी अन्य अंगों के उपकला कोशिकाओं में सक्रिय हो सकता है (यानी, वे सेल-प्रकार के हैं विशिष्ट लेकिन अंग विशिष्ट नहीं) या उपकला कोशिकाओं के अलावा अन्य प्रकार के सेल प्रकार में एक लीक अभिव्यक्ति है (उदा., MMTV, जो अस्थि मज्जा hematopoietic कोशिकाओं में लीक गतिविधि है), इन दृष्टिकोण अन्य अंगों में अवांछित कैंसर (ओं) के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यदि इन अप्रत्याशित कैंसर प्रभावित चूहों में घातक कारण, इन चूहों में स्तन कैंसर मॉडलिंग का मूल उद्देश्य निषिद्ध किया जा सकता है (जैसे, MMTV-Creसंचालित oncogenic घटनाओं hematopoietic द्रोह और चूहों की जल्दी मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं , हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं में एमएमटीवी प्रमोटर के रिसाव के कारण)4.
यहाँ हम चूहों में एक स्तन कैंसर मॉडलिंग दृष्टिकोण है कि दोनों सेल प्रकार की अनुमति देता है रिपोर्ट- और एक लौकिक नियंत्रित तरीके से oncogenic घटनाओं के अंग विशेष हेरफेर. यह दृष्टिकोण माउस MGs में विज्ञापन-Cre के एक intraductal इंजेक्शन पर आधारित है (और है, इस प्रकार, अंग विशिष्ट). क्रे अभिव्यक्ति को एडेनोवायरल वेक्टर में एम्बेड किए गए विभिन्न एमईसी उप-जनसंख्या-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एल्मिनल एमईसी के लिए Krt8, बेसल एमईसी के लिए Krt5, इस प्रकार सेल-प्रकार विशिष्टता प्राप्त करना)। MGs में कैंसर प्रेरण अस्थायी रूप से अलग अलग उम्र में चूहों में विज्ञापन-क्रे के एक इंजेक्शन द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, उम्र के 3-4 सप्ताह से शुरू (pubertal) वयस्क चरण के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को ब्रिघम और महिला अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. floxed चूहों की पीढ़ी और रखरखाव
- स्तन कैंसर से संबंधित floxed सशर्त नॉकआउट प्राप्त (जैसे, Trp53tm1Brn [Trp53L/Lके रूप में संदर्भित ], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) या सशर्त दस्तक में माउस लाइनों (जैसे, Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)एगन) जैक्सन प्रयोगशाला (JAX) या मानव कैंसर कंसोर्टियम (MMHCC) भंडार के NCI माउस मॉडल से. इसके अलावा, Cre-mediated पुनर्संयोजन से गुजरना है कि एमईसी का पीछा करते हुए की सुविधा के लिए, एक सशर्त क्रे-रिपोर्टर लाइन भी JAX से प्राप्त किया जा सकता है (जैसे, Gt(ROSA)26Sortm1 (EYFP)Cos [R26Y के रूप में संदर्भित ]).
- नस्ल Trp53L/L समयुग्मज चूहों R26Y समयुग्मज रिपोर्टर चूहों के साथ या समयुग्मज चूहों के साथ R26Y रिपोर्टर alleles और किसी भी अतिरिक्त floxed सशर्त नॉकआउट या दस्तक में alleles ले जाने के लिए अलग अलग माउस मॉडल, heterozygous F1 पुरुष और महिला संतान प्राप्त करने के लिए.
- Intercross heterozygous F1 पुरुष और महिला चूहों F2 यौगिक महिला चूहों कि प्रत्येक allele के लिए समयुग्मज हैं प्राप्त करने के लिए (प्रयोगात्मक चूहों के रूप में), साथ ही R26Y-केवल समयुग्मज महिलाओं (नियंत्रण चूहों के रूप में). नीचे सूचीबद्ध पीसीआर प्राइमर और साइकिल िंग शर्तों के आधार पर जीनोटाइप F2 चूहे, दो अलग-अलग PCR ट्यूबों में दो मानक 20 डिग्री एल पीसीआर प्रतिक्रियाओं (टाक 5X मास्टर मिक्स का उपयोग करके) की स्थापना करके, एक R26Y प्राइमर के साथ और अन्य Trp53L के साथ प्राइमर. वयस्क चूहों का प्रयोग करें (आमतौर पर उम्र के 2-4 महीने के आसपास) सभी प्रजनन के लिए.
- R26Yके लिए, 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रदर्शन, फिर 30 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर, 30 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 35 चक्रों के लिए 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के बाद, और 14 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने। प्राइमर का उपयोग करें (i) R26YFP-1: एएए GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) आर 26वाईएफपी-2: जीसीजी एजी एजी टी जी टी जी टी सी टीसीए एसीसी; (iii) आर26वाईएफपी-3: जीजीए जीसीजी जीजीए जीए ए टी जी एटीजी।
नोट: 250 बीपी का एक एकल पीसीआर बैंड एक R26Y homozygote इंगित करता है, 500 बीपी का एक एकल पीसीआर बैंड एक जंगली प्रकार (WT) इंगित करता है, और दो PCR बैंड (R26Y:250 बीपी, WT: 500 bp) एक R26Y विषमयुग्मजgote इंगित करता है (चित्र 1A) एक R26Y विषमयुग्मजgote इंगित करता है।
Trp53Lके लिए, 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रदर्शन, फिर 30 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर, 30 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 72 डिग्री सेल्सियस 35 चक्र ों के लिए 1 मिनट के लिए, 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के बाद, और 14 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने. प्राइमर का उपयोग करें (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA टैग GAG GCA GAG एसी.
नोट: 370 बीपी का एक एकल पीसीआर बैंड एक Trp53L/L समयुग्मज इंगित करता है, 288 बीपी का एक एकल पीसीआर बैंड एक Trp53++/// WT इंगित करता है, और दो PCR बैंड (WT: 288 bp, Trp53L: 370 bp) एक Trp53 L इंगित करता है /+ हेटरोजोगेट (चित्र 1ख)
- R26Yके लिए, 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रदर्शन, फिर 30 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर, 30 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 35 चक्रों के लिए 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के बाद, और 14 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने। प्राइमर का उपयोग करें (i) R26YFP-1: एएए GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) आर 26वाईएफपी-2: जीसीजी एजी एजी टी जी टी जी टी सी टीसीए एसीसी; (iii) आर26वाईएफपी-3: जीजीए जीसीजी जीजीए जीए ए टी जी एटीजी।
2. पूर्वक्रिया त्मक तैयारी
- सर्जरी से 1 दिन पहले सभी सर्जिकल उपकरण ऑटोक्लेव करें।
- फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) में 0-1% ब्रोमोफेनोल ब्लू तैयार की और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर की। DmEM माध्यम में इंट्राडकटल इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि विज्ञापन-क्री को पतला 0.01 एम CaCl2 और ब्रोमोफेनोल नीले रंग के साथ 1:10 के अनुपात में (यानी, इंजेक्शन मिश्रण).
नोट: विज्ञापन क्रे यहाँ इस्तेमाल किया आयोवा वायरल वेक्टर कोर के विश्वविद्यालय से प्राप्त किया गया था, $ 1010 -1011 pfu/ - मादा माउस (F2 पीढ़ी के रूप में कदम 1.2 में वर्णित, उम्र 3 से 4 वयस्क करने के लिए उम्र) एक isoflurane कक्ष का उपयोग कर और आंख मरहम लागू होते हैं. प्रक्रिया के दौरान, यह सुनिश्चित करने के द्वारा लगातार माउस anesthetize 1%-2.5% ऑक्सीजन में isoflurane. एक अंगुली चुटकी प्रदर्शन करके कम से कम हर 15 मिनट संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें. सावधानी से श्वसन दर में किसी भी परिवर्तन के लिए माउस की निगरानी, isoflurane के स्तर को समायोजित तदनुसार, यदि आवश्यक हो.
- शल्य प्रक्रिया से पहले, 5 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर एनेल्जेसिया के साथ-साथ मेलोक्सीकैम को इंजेक्ट करें।
- बालों को हटाने क्रीम के कई बूँदें लागू करने से निपल सर्जिकल साइट को उजागर; अत्यधिक क्रीम और ढीले बालों को मुलायम कागज तौलिए का उपयोग कर हटा दें।
नोट: सर्जरी किया जा करने के लिए है, जहां से अलग एक क्षेत्र में इस कदम को निष्पादित करें। निपल्स को नुकसान से बचने के लिए शेविंग की सिफारिश नहीं की जाती है। एक समय पर फैशन में रासायनिक depilatory एजेंट को दूर करने के लिए सावधानी का प्रयोग करें. बहुत लंबे समय के लिए एजेंट को छोड़कर त्वचा के लिए रासायनिक जला में परिणाम हो सकता है - पहले iodophors के साथ शल्य साइट को संक्रमित, 70% शराब के बाद, और स्क्रब iodophors के एक अंतिम आवेदन के साथ अंत. एक जाली स्पंज या कपास से लिपटी applicator का उपयोग परिधि की ओर काम क्षेत्र के केंद्र से एक परिपत्र गति में यह मत करो. चक्र 3x-4x दोहराएँ.
3. इंट्राडकियल इंजेक्शन
- शल्य प्रक्रिया के दौरान aseptic तकनीक का प्रयोग करें.
- दो चौथाई वानुकरण एमजी (चित्र 2) के बीच 1 बउकी लंबाई में त्वचा पर चीरा स्थल बनाइए। ध्यान से त्वचा फ्लैप (एमजी के साथ) पार्श्विक peritoneum से अलग इतना के रूप में स्तन वाहिनी के पेड़ कल्पना करने के लिए.
- ध्यान से वॉचमेकर के संदंश के साथ निप्पल पकड़ और किसी भी पास की त्वचा को काटने के बिना बाहरी निप्पल को हटा दें, एक माइक्रो विच्छेदन कैंची का उपयोग कर.
- एक 33 जी धातु हब सुई चिपका के साथ एक 25 $L हैमिल्टन सिरिंज में विज्ञापन-Cre इंजेक्शन मिश्रण के 3-5 डिग्री सेल्सियस लोड करें। मिश्रण में शामिल नीले रंग के आधार पर सिरिंज में इंजेक्शन मिश्रण की मात्रा का अनुमान लगाएं।
नोट: एक छोटी मात्रा का उपयोग करें (उदा., 3 डिग्री सेल्सियस) जब 3-4 सप्ताह पुराने महिलाओं के MGs में इंजेक्शन और एक बड़ा मात्रा (उदा. 10 डिग्री सेल्सियस) जब स्तनपान कराने वाली महिलाओं के MGs में इंजेक्शन. - धीरे से एक ठीक घुमावदार चिमटी के साथ त्वचा फ्लैप के किनारे पकड़ और निप्पल में धीरे धीरे विज्ञापन-क्रे इंजेक्शन मिश्रण इंजेक्ट, इस बीच स्तन नलिका के पेड़ में नीले रंग के प्रसार की निगरानी. नलिका लुमेन को नुकसान से बचने के लिए संभव के रूप में कम के रूप में इंजेक्शन दर बनाए रखें।
नोट: इंजेक्शन तरल पदार्थ (के रूप में शामिल ब्रोमोफीनोल नीले रंग से सचित्र) stromal डिब्बे में लीक के बिना पूरे नलिका पेड़ भर में फैल एक सफल intraductal इंजेक्शन इंगित करता है. - इंजेक्शन तरल पदार्थ के किसी भी रिसाव से बचने के लिए धीरे से निप्पल से सुई को वापस ले लें।
- एमजी या इंजेक्शन निप्पल के आसपास के क्षेत्र के दूरस्थ पक्ष (यानी, निप्पल से दूर) की जांच करें। ध्यान दें कि सूजन नीले रंग (यानी, पास के stroma में diffusing डाई) एक सफल intraductal इंजेक्शन के बजाय एक स्तन वसा पैड इंजेक्शन इंगित करता है.
- घाव क्लिप के साथ त्वचा में सर्जिकल घावों (चरण 3.2 से) को बंद करें।
4. पोस्टऑपरेटिव देखभाल
- संज्ञाहरण से माउस निकालें और वसूली के लिए एक साफ पिंजरे के अंदर एक हीटिंग पैड पर जगह है।
- सर्जरी के बाद 24 एच फिर से 5 मिलीग्राम/किग्रा पर मधुरता को कम करना।
- जानवर की सामान्य स्थितियों की निगरानी करें और 5 दिनों के लिए चीरा साइट पर संक्रमण के लक्षण खोजें।
- घाव क्लिप सर्जरी के बाद 7-10 दिनों के बाद हटा रहे हैं।
5. स्तन ट्यूमर के विकास की निगरानी
- स्तन ट्यूमर के विकास के किसी भी संकेत के लिए palpation द्वारा दो बार साप्ताहिक इंजेक्शन चूहों की निगरानी करें।
- एक बार ट्यूमर स्पष्ट है, माउस दैनिक निगरानी और ट्यूमर के आकार को मापने जब तक यह प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक पहुँच जाता है, के रूप में आकार द्वारा निर्धारित (जैसे, माउस के शरीर के वजन के 10%-15%) या हालत (जैसे, अल्सरेट या नेक्रोटिक) ट्यूमर के द्वारा, या द्वारा माउस की सामान्य स्वास्थ्य स्थिति (उदा., कोमाटोस, मरणासन्न)।
- कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation, एक माध्यमिक विधि (जैसे, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था) द्वारा पीछा द्वारा माउस euthanize.
- स्तन ट्यूमर के ऊतकों को अलग करें और प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, या अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग (जैसे, आरएनए अनुक्रमण द्वारा[RNAse] या microarray द्वारा उनका विश्लेषण करें, जैसा कि पहले 12 में वर्णित किया गया था।
- वंश-नकारात्मक कोशिकाओं के लिए gating द्वारा प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण प्रदर्शन (लिन-: वंश मार्करों CD45 [ल्यूकोसाइट मार्कर के लिए नकारात्मक], CD31 [एंडोथेलियल सेल मार्कर], और TER119 [एरिथ्रोसाइट मार्कर], और उनके आधार पर ट्यूमर में कोशिकाओं का विश्लेषण YFP, CD24, और CD29 की अभिव्यक्ति.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
R26Y और Trp53एल एललीज़ के लिए प्रतिनिधि पीसीआर जीनोटाइपिंग परिणाम चित्र 1में दिखाए गए हैं।
हालांकि, सिद्धांत रूप में, सभी 10 MGs intraductal इंजेक्शन प्रक्रिया के अधीन किया जा सकता है, व्यावहारिक रूप से, दो चौथे वंताMGs आम तौर पर इंजेक्शन के लिए चुना जाता है, उनके आसान पहुँच और बड़े एमजी आकार के कारण (चित्र 2). शल्य चिकित्सा के दौरान, एक कीटाणुरहित और अव्यवस्थित कार्य क्षेत्र को बनाएरखना और बाँझ उपकरणों के साथ प्रक्रिया करना महत्वपूर्ण है (चित्र 3)। इंट्राडक्टल इंजेक्शन के दौरान, इंजेक्शन मिश्रण में एक नीले रंग (उदा., ब्रोमोफेनोल ब्लू) को शामिल करने से पूरे वाहिनी के पेड़ में विज्ञापन-क्री के सफल इंजेक्शन के दृश्य में मदद मिलती है (चित्र 4)। सबसे कम उम्र के मादा चूहों जिसमें intraductal इंजेक्शन (इंजेक्शन मिश्रण की एक छोटी मात्रा के साथ) सफलतापूर्वक किया जा सकता है उम्र के 3 सप्ताह में उन हैं (चित्र ा04ए),हालांकि सबसे स्तन ट्यूमर प्रेरण प्रयोगों के लिए, युवा वयस्क महिला चूहों (उदा., 2 माह की आयु) का उपयोग आमतौर पर किया जाता है (चित्र 4ठ)। इसके अलावा, इंट्राडक्यूल इंजेक्शन (इंजेक्शन मिश्रण की एक बड़ी मात्रा के साथ) भी महिला चूहों मेंजल्दी के दौरान किया जा सकता है /
हमारे अनुभव में, R26Y रिपोर्टर और Trp53L/L (के साथ या किसी भी अतिरिक्त सशर्त alleles के बिना) के साथ चूहों में, क्रे-मध्यस्थ पुनर्संयोजन Trp53 सशर्त नॉकआउट alleles बाधित (और किसी भी अतिरिक्त सशर्त नॉकआउट alleles, अगर इस्तेमाल किया) और, इस बीच, YFP रिपोर्टर पर दिया (R26Y allele से, साथ ही किसी भी अतिरिक्त सशर्त दस्तक से allele, अगर इस्तेमाल किया). स्तन ट्यूमर प्रेरण के लिए विभिन्न MEC subpopulations लक्ष्य करने के लिए, विभिन्न MEC सबसेट-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में विज्ञापन-Cre वायरस इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया (चित्र 5)। उदाहरण के लिए, केरातिन 8(Krt8) प्रमोटर(विज्ञापन-K8-Cre) के नियंत्रण में विज्ञापन-Cre का उपयोग luminal MECs को लक्षित करने के लिए किया गया था. पहले, हमने बेसल एमईसी13को लक्षित करने के लिए केरातिन 14 (Krt14 ) प्रमोटर (विज्ञापन-K14-Cre ) के नियंत्रण में विज्ञापन-क्री के उपयोग की सूचना दी थी . हालांकि, जैसा कि हमने बताया, विज्ञापन-K14-Cre के इंट्राड्यूल इंजेक्शन न केवल लक्षित बेसल MECs लेकिन यह भी luminal MECs13के एक हिस्से . हमने हाल ही में केराटिन 5 (Krt5) प्रमोटर (विज्ञापन-K5-Cre)14 के नियंत्रण में एक और विज्ञापन-क्री का परीक्षण किया और पाया कि यह बेसल वंश को अधिक कसकर लक्षित कर सकता है, जिससे केवल बेसल एमईसी (चित्र 5) का आनुवंशिक अंकन हो सकता है । या तो विज्ञापन-K8-Cre या विज्ञापन-K5-Cre इंजेक्शन से YFP चिह्नित MECs के विशिष्ट प्रतिशत के बारे में 0.1%-1% हैं.
Trp53L/Lके लिए ; FVB आनुवंशिक पृष्ठभूमि के तहत R26Y महिला चूहों, विज्ञापन-K8-Creके इंट्राडकटल इंजेक्शन, जो उनके luminal MECs लक्ष्य, इंजेक्शन के बाद कई महीनों स्तन ट्यूमर के विकास के लिए नेतृत्व किया (चित्र 6A). एक अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ चूहे (उदा., C57/B6) इंजेक्शन के बाद स्तन ट्यूमर के विकास की एक लंबी विलंबता प्रदर्शित कर सकते हैं. सशर्त R26Y रिपोर्टर के शामिल किए जाने के कारण, ट्यूमर उपकला कोशिकाओं को आम तौर पर YFP द्वारा चिह्नित किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया जा सकता है (चित्र 6B); वे आगे के विश्लेषण के लिए YFP+ कोशिकाओं के प्रवाह-सॉर्टिंग से समृद्ध किया जा सकता है।
चित्रा 1: R26Y और Trp53एल alleles के लिए प्रतिनिधि पीसीआर genotyping परिणाम. डब्ल्यूटी - जंगली प्रकार; होमो ] समयुग्मज। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: एक एमजी में विज्ञापन-Cre वायरस के इंट्राडकल इंजेक्शन के Schematic आरेख. (क) दो चौथे एमजी के बीच मिडलाइन में चीरा स्थल (बी) एक नीले रंग के साथ विज्ञापन-क्री का अंतनीय इंजेक्शन (बेहतर दृश्य के लिए) चौथे एमजी में से एक में (सी) घाव क्लिप द्वारा त्वचा में चीरा बंद करना. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: कृंतक सर्जरी के लिए aseptic सेटअप का अवलोकन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: पूरे स्तन नलिका के पेड़ में एक सफल इंट्राड्यूलर इंजेक्शन का दृश्य। (ए) 3 सप्ताह पुराने मादा माउस के एमजी में 3 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन मिश्रण (ब्रोमोफेनोल ब्लू के साथ) के इंट्राड्यूलर इंजेक्शन का एक उदाहरण। (बी) एक युवा वयस्क मादा माउस के एमजी में इंजेक्शन मिश्रण के 5 डिग्री एल का इंट्राडक्यूटल इंजेक्शन। (ग) एक मादा माउस के एमजी में इंजेक्शन मिश्रण के 10 डिग्री एल का इंट्राडक्यूल इंजेक्शन प्रारंभिक/मध्य-गर्भस्थान में। (डी) एक सफल इंट्राड्यूल इंजेक्शन के बजाय एक स्तन वसा पैड इंजेक्शन का एक उदाहरण है। एक युवा वयस्क महिला माउस के एक एमजी में इंजेक्शन मिश्रण के 5 डिग्री एल के इंट्राडकियल इंजेक्शन। (क) इंजेक्ट किए गए निप्पल के आस-पास का त्वचा क्षेत्र; (ख) स्तन वसा पैड दिखा त्वचा फ्लैप के दूसरे पक्ष; पीला वृत्त वसा पैड में फैलाना डाई इंगित करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: इंट्राडक्टल इंजेक्शन पर YFP चिह्नित कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के प्रतिनिधि भूखंडों। YFP+ R26Y कुंवारी महिलाओं के MGs से आबादी 3 दिन विज्ञापन-K8-Cre के एक intraductal इंजेक्शन के बाद (बाएं, 7 x 109 pfu/mL) या विज्ञापन-K5-Cre के एक titer पर इंजेक्शन (दाएं, 7.86 x 109 pfu / एमएल) वायरस. प्लॉट वंश-नकारात्मक (लिन- ;अर्थात, CD45, CD31, और TER119 अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक) YFP+ कोशिकाओं में CD24 और CD29 धुंधला के विश्लेषण पर आधारित हैं। लू लिन-CD24उच्चCD29कम luminal MEC गेट; Ba ] लिन-CD24कमCD29उच्च बेसल MEC गेट; luminal और बेसल MECs के लिए gating रणनीति Shackleton एट अल15पर आधारित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: Trp53L/Lमें ट्यूमर विकास ; R26Y महिला चूहों intraductally विज्ञापन-K8-Creके साथ इंजेक्शन | (क) एक प्रतिनिधि माउस विज्ञापन-K8-Creके साथ एक इंजेक्शन के बाद कई महीनों के ट्यूमर विकास (तीर) दिखा रहा है। (बी) एक प्रतिनिधि ट्यूमर से लाइव कोशिकाओं (डीएपीआई धुंधला के आधार पर) के बारे में 8.8% प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के आधार पर YFP अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MECs के विभिन्न subpopulations से स्तन ट्यूमर inducing के लिए इस दृष्टिकोण की सफलता न केवल उचित सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों को चुनने पर निर्भर करता है (क्रे अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए) लेकिन यह भी intraductal इंजेक्शन प्रक्रिया पर ही. इस दृष्टिकोण के पीछे विचार यह है कि इंजेक्शन विज्ञापन-Cre वायरस नलिका वृक्ष में बनाए रखा जाता है, जो लुमेन के साथ एक छुपा संरचना है, और इसलिए, केवल MECs वायरस के संपर्क में हैं और विज्ञापन-क्री से संक्रमित हैं। स्तन नलिकाओं के भीतर सीमित लुमेन अंतरिक्ष के कारण, यह केवल प्रत्येक एमजी के लिए इंजेक्शन मिश्रण की एक छोटी मात्रा इंजेक्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, $ 3-5 $L). इंजेक्शन मात्रा भी चूहों की उम्र के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए (यानी, एक छोटी मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए जब यह में इंजेक्शन है 3- करने के लिए 4 सप्ताह पुराने चूहों). इंजेक्शन और सीमित डक्टल लुमेन अंतरिक्ष से दबाव के कारण इंजेक्शन तरल पदार्थ की मात्रा अत्यधिक है, जब तरल पदार्थ stroma में उपकला परतों के माध्यम से "बाहर धक्का दिया" हो सकता है, जिससे स्ट्रॉमल कोशिकाओं में एक अवांछित वायरल संक्रमण हो सकता है।
चूंकि क्रे एक्सप्रेशन को ड्राइव करने के लिए एडेनोवायरल वेक्टर में प्रयुक्त प्रमोटर द्वारा सेल-प्रकार की विशिष्टता हासिल की जाती है, इसलिए इस दृष्टिकोण की एक सीमा एक विशिष्ट एमईसी उप-जनसंख्या के लिए क्रे अभिव्यक्ति को लक्षित करने के लिए एक उपयुक्त प्रमोटर की संभावित कमी है। हमने पहले ल्यूमिनल MECs12,13 और एड-वाप-क्री वायरस के उपयोग को लक्षित करने के लिए पैन-लुमिनल एड-K8-Cre वायरस के उपयोग की सूचना दी थी ताकि अल्वेलर ल्यूमिनल संतति5को लक्षित किया जा सके। इस अध्ययन में हमने आधारीय एमईसी को लक्षित करने के लिए विज्ञापन-K5-Cre वायरस का उपयोग दिखाया (चित्र5)। हम अभी भी एस्ट्रोजन रिसेप्टर सकारात्मक luminal MEC subpopulation लक्ष्य के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने की क्षमता की कमी है. एडेनोवायरल वेक्टर जो हम यहां इस्तेमाल करते थे, 8 केबी तक के सम्मिलित को समायोजित कर सकते हैं। इस प्रकार, एमईसी-सेट-विशिष्ट विज्ञापन-Cre विकसित करने के लिए, क्रे एक्सप्रेशन ड्राइव करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रमोटर केवल 7 kb से कम हो सकते हैं। व्यावहारिक रूप से, एक बड़े प्रमोटर टुकड़ा, भले ही आकार में कम से कम 7 केबी, subclone करने के लिए मुश्किल हो सकता है. एडेनोवायरल वेक्टर में फिट करने के लिए, हालांकि एक छोटा प्रमोटर का उपयोग किया जा सकता है, यह अंत:जात, पूर्ण प्रमोटर के नियंत्रण में होने पर अपने इसी जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न को ईमानदारी से पुन: प्राप्त नहीं कर सकता है।
यहाँ माउस मॉडल में शामिल R26Y सशर्त रिपोर्टर मूल की कोशिकाओं को चिह्नित करने और कैंसर की कोशिकाओं के लिए उनकी प्रगति का पता लगाने के लिए एक रास्ता प्रदान की. ध्यान दें, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर में YFP चिह्नित कैंसर कोशिकाओं का प्रतिशत काफी कम दिखाई दिया (चित्र 6B) . यह एक संभावना के कारण हो सकता है कि, YFP चिह्नित ट्यूमर उपकला कोशिकाओं के अलावा, ट्यूमर भी कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं, जो ट्यूमर द्रव्यमान के थोक का गठन शामिल थे.
स्तन कैंसर के अन्य माउस मॉडल की तुलना में, इस दृष्टिकोण केवल MECs की एक छोटी संख्या से स्तन ट्यूमर दीक्षा की ओर जाता है (उदाहरण के लिए, luminal MECs जब विज्ञापन-K8-Cre इंजेक्शन है), अक्सर एक क्लोन स्तर पर12. के रूप में मानव tumorigenesis की शुरुआत के लिए क्लोन होने की संभावना है, इस दृष्टिकोण मानव कैंसर के विकास के उस पहलू को और अधिक ईमानदारी से recapitulates. इसके अलावा, यहां तक कि जब p53 MECs की केवल एक छोटी संख्या में बाधित है, p53 की हानि उनके क्लोनल विस्तार की ओर जाता है, उत्परिवर्तित MECs का एक बड़ा पूल के उत्पादन के लिए अग्रणी; यह p53 कमी MECs (अतिरिक्त दैहिक उत्परिवर्तनों के अधिग्रहण पर)12से आगे क्लोनल विकास की अनुमति होगी. TP53 के रूप में मानव स्तन कैंसर में सबसे अधिक उत्परिवर्तित जीन है16 और TP53 उत्परिवर्तन के रूप में मानव स्तन tumorigenesis में एक प्रारंभिक घटना है17,18, माउस के साथ Trp53 floxed माउस मॉडल के संयोजन के द्वारा अन्य oncogenic घटनाओं के लिए मॉडल, हम अध्ययन कर सकते हैं कि कैसे इन oncogenic घटनाओं p53 हानि के साथ सहयोग और कैसे वे संयुक्त रूप से एक परिभाषित सेलुलर मूल से स्तन ट्यूमर के विकास के लिए योगदान. इसके अलावा, के रूप में कम प्रजनन के लिए कई alleles एक साथ डाल की जरूरत है, इस दृष्टिकोण प्रजनन लागत और समय है, जो एक बड़े पैमाने पर स्तन कैंसर मॉडलिंग अध्ययन की सुविधा चाहिए कम से कम होगा, एक छोटी अवधि में.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान R01 CA222560 और रक्षा निर्णायक पुरस्कार W81XWH-18-1-0037 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
