Summary
大器内膜瘻は、両方の壁を通して下の静脈カバに尿の赤外線大腸を穿刺することによって作成され、その後、劣った静脈カバの部分的なライゲーションを介してその流出における狭窄の作成が行われた。この再現可能なモデルは、中央静脈狭窄症の研究に使用することができる。
Abstract
中枢静脈狭窄は、動脈瘻(AVF)障害に寄与する重要な実体である。マウスAVFモデルは、瘻孔の流出における劣った静脈カバ(IVC)の部分的なライゲーションを作成するために改変され、中央静脈狭窄を模倣した。このモデルの技術的な側面を紹介します。大動脈とIVCは、腹部切開後に露出する。赤外線大動脈およびIVCは近位クランプのために解剖され、遠位大動脈は穿刺のために露出される。左腎静脈と大動脈分岐の中間点にあるIVCは慎重に解剖され、8-0IVC の下に縫合します。大動脈とIVCを締め付けた後、AVFは25Gの針で両方の壁を通して赤外線大動脈をIVCに穿刺し、続いて22G静脈内(IV)カテーテルとIVCを合わせて結び付けることによって作成される。その後、カテーテルが取り外され、閉塞することなく再現可能な静脈狭窄を作り出す。大動脈とIVCは、一次止止めを確認した後、クランプ解除されます。中静脈狭窄症のこの新しいモデルは、実行しやすく、再現性があり、AVF障害に関する研究を容易にします。
Introduction
動脈静脈瘻(AVF)は血液温水症の最も一般的なアクセスであり、移植片や中央静脈カテーテルなどの他のアクセスと比較して、優れた若性および減少した感染を有する。しかし、AVFの最大60%は1、2、3を成熟に失敗する。最近の体系的なレビューは、1年の一次滞起率が60%4だけであったと報告しました。静脈流出に沿った狭窄は、主にAVF成熟5、6の障害を引き起こす。瘻孔に近い狭窄しやすい特定の特徴的な場所があります:放射線静脈瘻の並置体スイングセグメント、ブラキオケファリック瘻のcephalicアーチ領域、および以前の瘻孔の中央静脈置かれたイプシラテラルサブクラビアンまたは内部頸静脈カテーテル7、8.
中枢静脈狭窄症は、AVFを持たない患者では無症候性であることが多いが、瘻孔流動9に挑戦した場合の静脈高血圧および瘻孔成熟の障害による虚索前肢浮腫を引き起こす可能性がある。中枢静脈狭窄症の病態生理学は、デバイス配置後の炎症および活性化凝固カスケードに関連する可能性が最も高い。さらに、カテーテル先端の一定の動きと瘻孔からの流れの増加は、せん断ストレスを変化させることができ、血小板沈着および静脈壁肥厚10をもたらす。中央静脈狭窄によって引き起こされるAVF障害の基礎となる基本的なメカニズムを理解するためには、AVFを使用して中央静脈狭窄を模倣する動物モデルが必要である。
ヒトAVFの臨床経過を習得し、要約しやすいマウス大横腔瘻モデルを確立した。11静脈狭窄を伴う新しいマウスAVFモデルを作成するために、以前に確立されたいくつかのマウスモデルの概念と技術を適用しました。中枢静脈狭窄の研究に用いることができる流出瘻におけるIVC狭窄を伴うマウス大横腔瘻モデルを紹介する。
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Protocol
すべての実験は、イェール大学機関動物ケア使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。
1. 麻酔および術前の手順
- オートクレーブによってすべての外科器械および材料を殺菌する。熱サポートデバイスの電源を入れ、暖かくなることを確認します(40~42°C)。
- 9-11週齢のC57BL/6マウスをアクリル誘導室に入れ、気化した2.5%のイソルランと0.8L/分の酸素で麻酔する。麻酔誘導は約3分かかります。
- チャンバーからマウスを取り外します。つま先のピンチ、耳のピンチと尾のピンチによって麻酔の深い平面を確認します。外科区域の上の上の上の上の上の位置にマウスを置き、シリコーンマスクを使用して2.5%のイソファランを提供する。0.1 mg/kgの鎮痛薬でブプレノルフィンを提供し、眼科のointmentを目に適用します。
- ヘアリムーバーであるNairを使用して、首の腹部側から下腹部に毛皮を取り除きます。
- 10%ポビドネヨウ素と70%のイソプロパノールとの2段階のスクラブを使用して、外科部位を浄化し、消毒する。外科のドレープを適用する。
2. 手術手順
-
クランプ部位および穿刺部位の露出
- 滅菌器具を準備し、手術を通して無菌性を維持するために無菌手袋を着用してください。
- 下部肝縁のレベルからパビスのすぐ上にメスで皮膚深い中線腹部切開を行います。はさみで筋肉を切り取り、腹腔を開きます。
- 腹部にリトラクタを挿入し、右側に腸を引き出します。生理生理生のガーゼに包んでしっとりと保ちます。膀胱と精嚢(雄マウス)を取り出し、それらを側側に引き出します。直腸と後腹膜の間の腸間をマイクロニードルホルダーで解剖し、大動脈とIVCの全景を得る。
- 赤外線大動脈とIVCは、横および後食後組織の後食器組織から、それらを一緒にクロスクランプするマイクロニードルホルダーで解剖します。
- 周囲の組織を解剖して、左腎静脈から大動脈分岐までの距離の約3分の3で大動脈穿刺部位を露出させる。
-
IVC解剖
- 赤外線IVCと大腸間の解剖はすぐに左腎静脈に遠位する。左腎静脈と大動脈分岐の中間に解剖を遠方に拡張し、狭窄に対する上流と下流の両方の赤外線IVCを術後に観察できるようにする。
注:IVCと大動脈の間の鈍い解剖は、IVCと大動脈の間の結合組織が比較的緩い左腎静脈に直ちに遠位から行われるべきである。 - そのレベルで大器からIVCを分離し、周囲の組織からIVCを解剖する窓を作ります。8-0 を配置するポリアミドモノフィラメント縫合糸は、まずIVCと大通り(図1A)の下に縫合糸を配置し、次に縫合糸の端を窓から引っ張ってIVC(図1B)の下に配置します。
注:IVCは壊れやすいので、大動脈性アドベンティシアに沿って解剖することは、IVCだけでなく、小さなIVCまたは大動脈枝が損傷するのを防ぐためのウィンドウを作るのに役立ちます。出血が発生した場合、制御不能になる可能性があります。IVC に個別のサイド ブランチがある場合は、8-0 を配置します。枝に遠く縫合する。
- 赤外線IVCと大腸間の解剖はすぐに左腎静脈に遠位する。左腎静脈と大動脈分岐の中間に解剖を遠方に拡張し、狭窄に対する上流と下流の両方の赤外線IVCを術後に観察できるようにする。
-
AVF の作成
- 25Gの針を針先から45~60°の角度で45~60°の角度に曲げます。
- マイクロ外科クリップを適用することにより、赤外線大動脈およびIVCをクランプする。
- 分岐を取り巻く結合組織をつかんで、大胸部の穿刺部位をわずかに腹部側に伸ばして、大胸を中間的かつ口頭で回転させる。
- 大腸を適切な位置に保持し、調製された25G針(図1C)を用いて大腸を通してIVCに穿刺する。
- 大開を解放し、周囲の組織が大横から引き上げて穿刺部位を覆う。針を取り出し、綿の先端の綿棒を使って穿刺部を静かに押します。
-
IVC狭窄症の作成
- 22 G IV カテーテルの先端(材料の表を参照)を IVC 上に縦方向に置きます。IVカテーテルとIVCを8-0と一緒にライゲート縫合(図1D)を、IVカテーテルを取り外します。
- 一次止前症(図1E)を確認し、大動脈とIVCのクランプを解除します。穿刺部位を1分以上覆い、間方限を確保する。
注:狭窄に遠位IVC血栓症を避けるためにあまりにも長い間クランプしないでください。 - 臓器を元の位置に戻し、6-0縫合糸で腹部を閉じます。
3. 術後の手続き
- 腹部創傷の閉鎖後、イソファラン吸入を中止する。マウスを個々の寝具のないケージに入れ、低体温症を防ぐために熱サポート装置にケージを置きます。
注:マウスは、彼らが達成し、胸骨の再発を維持するまで観察されます。地元のIACUCの勧告に従って鎮鎮創および創傷ケアを含む術後ケアを適用する。鎮鎮鎮治療では、外科的処置に従い、その後必要に応じて12時間毎に0.1mg/kgのブプレノルフィンを使用します。 - ドップラー超音波を使用して術後にAVFのパテンシーを確認してください(材料の表を参照してください)。さらに、必要に応じて他の容器および流れの特性を測定する。
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Representative Results
雄マウスは、AVFとIVC狭窄の両方を作成するために上記の操作を受けた。対照マウスは、IVCを取り巻く組織の腹腔切除および解剖のみを受けた、例えば、偽の手順、またはAVFの同時作成なしにIVC狭窄の作成のみを行った。
IVCは、外科的処置の後7日目にドップラー超音波で観察された(図2)。IVCの瘻孔および狭窄領域は、縦方向図で容易に検出された(図2C,E)。瘻孔と狭窄との間のIVCは、狭窄を有するAVFを有するマウスにおいて拡張した。超音波波形は、狭窄の点でIVCで調べた(図2D,F)。狭窄を有するマウスでは、AVFなしで、狭窄セグメントは、シャム操作マウスよりもスペクトル広がりを有する静脈波形を示したが、脈動性はあまりなかった。しかし、AVFおよび狭窄を有するマウスにおいて、狭窄セグメントはスペクトル広がりを広げるに加えて脈動性波形を示した。狭窄を有するAVFを有するマウスにおける狭窄における流れの平均最大速度は、狭窄単独を有するマウスよりも有意に高かった(表1)。
ドップラー超音波Bモードは、手術後7日目にIVCを評価するために横方向のビューで使用されました(表1)。狭窄単独を有するマウスにおける狭窄における平均IVC直径は、AVFを有するマウスならびに狭窄を有するマウスと同様であった(表1)。IVCの狭窄率はNASCET法12に従って算出した。上流セグメントまたは下流セグメントのいずれかを参照として使用すると、狭窄に加えてAVFを有するマウスにおいて狭窄率が有意に大きかった(表1)。
図 1.静脈狭窄を伴うマウスAVFモデルの手術写真。(A) 8-0 を配置するIVC(青い矢印)と大動脈(赤い矢印)の下の縫合糸は、左腎静脈(黄色の矢印)と大動脈分岐の中間にあり、存在する場合は、任意の大きなIVC分岐に遠位である。(B) 縫合糸を IVC の下にのみ配置します。(C) 近位クランプ後、大動脈を壁からIVCに穿刺する。(D) 22 G IV カテーテルと IVC の先端を配置された縫合糸と一緒に結びます。(E) カテーテルを取り外し、クランプを解除します。IVC狭窄を通る動脈血流が観察される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.外科的処置の後7日目に超音波所見。上:偽の手順を持つマウスの代表的な画像。(A) B モードイメージは、縦方向のビューで IVC を示しています。左側は頭蓋側です。(B) 屈折IVCの波形。中央:狭窄を単独で有するマウスの代表的な画像。(C) Bモード画像は、縦方向図に狭窄(黄色のアスタリスク)を含むIVCを示す。左側は頭蓋側です。(D) 狭窄の領域における波形。下:狭窄を有するAVFを有するマウスの代表的な画像。(E) Bモード画像は、瘻孔(白アスタリスク)および狭窄を含むIVCを示す。左側は頭蓋側です。(F) 狭窄の領域における波形。白いスケールバーは1mmを表し、黄色のスケールバーは100ミリ秒を表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
| 狭窄 | うん | うん | P 値 |
| AVF | 違います | うん | |
| 時間平均最大速度 (mm/s) | 180年 | 878の | 0.0023 |
| 狭窄直径(mm) | 0.62 ± 0.01 | 0.63 ± 0.01 | 0.3558円 |
| % 狭窄症 (アップスチーム) | 43パーセント | 66パーセント | 0.0159 |
| % 狭窄症 (ダウンスチーム) | 42パーセント | 56パーセント | 0.0006 |
表 1.各群のIVC狭窄領域における超音波測定。超音波は、狭窄単独を有するマウスおよび手術後7日目に狭窄を有するAVFを有するマウスのIVC狭窄領域で測定した。%狭窄(上流)=(1 -[上流基準セグメントの狭窄時の直径/直径])x 100%。%狭窄(下流)=(1 -[下流基準セグメントの狭窄時の直径/直径])x 100%。%拡張 = (術後7日目の直径/同じセグメントでの術前直径) x 100%。P値は、受講者の t 検定 n = 4-6 に基づいています。
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Discussion
マウスAVFモデルは、AVF成熟につながる基本的なメカニズムおよび分子事象を研究するために使用されてきた13,14.本研究では、確立されたマウスAVFモデルを改定し、瘻孔の流出管にIVC狭窄を伴う新規マウス大極瘻モデルを作成した。我々のライゲーションモデルは、血管ライゲーションを使用するいくつかの以前に説明されたマウスモデルに似ています。深部静脈血栓症のマウスモデルは、30G針スペーサー15を用いた部分的なIVCライゲーションを用いて作成された。より小さな狭窄を作り出し、血栓性閉塞を避けるために、より大きな22G IVカテーテルスペーサーを使用しました。部分的な頚動脈ライゲーションのマウスモデルは、乱れた流れを誘発するために使用され、アテローム性動脈硬化症16;我々のモデルは同様に部分静脈ライゲーションを使用し、それに応じて部分ライゲーションの領域でIVCにおける乱れた流れを実証した。
瘻静脈狭窄によって引き起こされるAVF成熟障害の基礎となるメカニズムが研究されている。せん断応力の乱れた周波数を含むヘモダイナミクス変化は、重要な因子17,18であることが示された。計算流体力学シミュレーションは静脈狭窄19で乱れた流れを示したが、静脈狭窄を伴うAVFの動物モデルは以前に報告されていない。この修飾されたマウス大器内瘻モデルは、中枢静脈狭窄を伴うAVFを研究するために使用することができる。狭窄のIVC直径は、このモデルのバリエーションが少なく、一貫性が高い。IVカテーテルを使用した部分IVCライゲーションは、このモデルの再現性を高めます。臨床症状および中枢静脈狭窄の徴候は、しばしば虚索前肢9における瘻孔作成後にのみ発症する。このモデルでは、部分的なIVC狭窄を有するマウス(<50%)正常な流れを持ち、無症候性であったのに対し、AVFを添加すると、症状を引き起こす程度に狭窄の程度が増加した(>50%)(図2、表1)これらの結果は、中枢静脈狭窄の表現型を模倣する;瘻孔の存在による静脈流量の増加は、無症候性中枢静脈狭窄の存在を明らかにし、静脈高血圧および瘻孔成熟の障害を引き起こす。
手順の成功率と一貫性を向上させる重要な手順とポイントがいくつかあります。IVC に異なるサイド ブランチがある場合は、8-0縫合糸は枝に遠く(口頭で)配置される(図1)。元のマウスAVFモデルでは、IVCの側枝は、枝の高い血管抵抗が瘻孔の流れが枝に入るのを防ぐため、通常は無視される。しかし、このモデルでは、IVC狭窄が異なる側枝に近接して作成された場合、新たに配置された縫合糸による血管抵抗のために瘻孔の流れが枝に逃げ込むことがある。大量の出血を避けるために、IVC解剖は左腎静脈に直ちに劣って開始され、IVCがライゲーションされるポイントまでさらに劣って拡張される。このステップは、この手術の最も重要な部分です。損傷したIVCや枝からの出血は制御不能である可能性が高い。さらに、縫合糸を周囲に置くときにIVCに触れないようにし、それを引き裂く可能性を防ぐために、8-0縫合は、最初は IVC と大谷の両方の周りに配置され、次に IVC の下に再配置されます。最後に、8-0の結び目縫合糸は、術後の超音波検査に影響を与える可能性のあるアーティファクトを防ぐために、直接ではなく、IVCの側に配置されます。
この研究の潜在的な制限は、このモデルのIVC狭窄は、外部機械的圧縮によって作成される。縫合糸およびIVC解剖によって引き起こされる冒険的な炎症は、狭窄領域における静脈のリモデリングに影響を与える可能性がある。さらに、このモデルの瘻孔は、すべての瘻孔の流れがIVC狭窄に向かるように大動脈とIVCの間で作られ、一方、ヒト上肢に作成された瘻孔はしばしば側骨静脈を発達させ、狭窄を無症候性に保つ。遠位上皮および担保形成のような中心静脈狭窄の物理的徴候は、このモデルでは示されていない。
要約すると、実行しやすく再現性の高いIVC流出狭窄を持つ新規マウス大横腔瘻モデルのプロトコルを紹介する。我々は、このモデルがAVF成熟に影響を与える可能性のある中枢静脈狭窄によるヘモダイナミクスの変化を研究するのに有用であると期待する。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)グラントR01-HL128406によってサポートされました。米国退役軍人省生物医学研究所研究開発プログラムメリットレビュー賞I01-BX002336;だけでなく、VAコネチカットヘルスケアシステム、ウェストヘブン、CTのリソースと施設の使用と同様に。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-60 Mhz scan head | VisualSonics Inc. | RMV-704 | |
| 8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle | AROSuture | T06A08N14-13 | polyamide monofilament sutures |
| Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H |
VetEquip | 941444 | |
| Isoflo, Isoflurane liquid | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Mice, C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | |
| Pet Bed Microwave Heating Pad | Snuggle Safe | 6250 | |
| PrecisionGlide Needle 25G | BD | 305122 | |
| Surflo I.V. Catheter 22G | Terumo | SR-OX2225CA | 0.85mm outer diameter |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument | RS-5424 | |
| Vevo770 High Resolution Imaging System | VisualSonics Inc. | 770 |
References
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