Summary
En aortocaval fistel ble opprettet av punktering den murine infra-renal aorta gjennom begge vegger i dårligere vena cava og ble etterfulgt av opprettelsen av en stenose i sin strøm via delvis ligation av dårligere vena cava. Denne reproduserbar modellen kan brukes til å studere sentrale venøs stenose.
Abstract
Sentral venøs stenose er en viktig enhet som bidrar til arteriovenøse fistel (AVF) svikt. En murine AVF modellen ble endret for å skape en delvis ligation av dårligere vena cava (IVC) i utløpet av fistel, etterligne sentrale venøs stenose. Tekniske aspekter ved denne modellen er innført. Aorta og IVC er eksponert, etter en abdominal snitt. Den infra-nyre aorta og IVC er dissekert for proksimale klemme, og den er den skarpe aorta utsatt for punktering. IVC på midtpunktet mellom venstre nyre vene og aorta bifurkasjonen er nøye dissekert å plassere en 8-0 Sutur under IVC. Etter klemme aorta og IVC, en AVF er opprettet av punktering den infra-renal aorta gjennom begge vegger i IVC med en 25 G nål, etterfulgt av ligating en 22 G intra-venøs (IV) kateter og IVC sammen. Kateteret fjernes deretter, skaper en reproduserbar venøs stenose uten okklusjon. Aorta og IVC er unclamped etter å ha bekreftet primære hemostase. Denne romanen modell av sentral vene stenose er lett å utføre, reproduserbar, og vil lette studier på AVF svikt.
Introduction
Arteriovenøse fistler (AVF) er de mest vanlige tilganger for hemodialyse, med overlegen patency og redusert infeksjon sammenlignet med andre tilganger som for eksempel en eller en sentral venøs katetre. Men opp til 60% av aVF mislykkes i å modne1,2,3; en fersk systematisk gjennomgang rapporterte at primære patency priser på 1 år var bare 60%4. Stenose langs venøs utløp overveiende forårsaker svikt i aVF modning5,6. Der er bestemt karakteristisk plasseringene liggende å stenose proksimale å det fistel: det juxtaanastomotic gynge avsnitt for det radiocephalic fistel, det cephalic buen område for det truncus brachiocephalicus fistel og det sentral vene for det fistel med tidligere plassert ipsilateral arteria eller interne hals vene katetre7,8.
Sentral venøs stenose er ofte asymptomatisk hos pasienter uten en AVF, men kan forårsake ipsilateral ekstremiteter ødem ved venøs hypertensjon, samt svikt i fistel modning når utfordret av fistel Flow9. Patofysiologi av sentral venøs stenose er mest sannsynlig knyttet til inflammasjon og den aktiverte blødnings kaskade etter enhets plassering. Videre kan konstant bevegelse av kateter spissen samt økt strømning fra fistel endre skjær stress, noe som resulterer i blodplater deponering og venøs veggtykkelse10. Å forstå de grunnleggende mekanismene underliggende AVF svikt forårsaket av sentrale venøs stenose, en dyr modell etterligne sentral venøs stenose med en AVF er nødvendig.
Vi har etablert en murine aortocaval fistel modell som er enkel å utføre og mestre og viser den kliniske løpet av menneskelig AVF. 11 vi brukte konsepter og teknikk av flere tidligere etablerte murine modeller for å skape en roman murine aVF modell med venøs stenose. Vi introduserer en murine aortocaval fistel modell med en IVC stenose i utløpet fistel som kan brukes til studiet av sentrale venøs stenose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført med godkjennelse fra Yale University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. anestesi og pre-operative prosedyrer
- Sterilisere alle kirurgiske instrumenter og materialer ved autoklavering. Slå på den termiske støtte enheten for å være sikker på at den er varm (40 – 42 ° c).
- Plasser en 9-11-uke gamle C57BL/6 musen inn i en akryl induksjon kammer og bedøve det med fordampet 2,5% isoflurane og 0,8 L/min oksygen. Anestesi induksjon tar ca 3 min.
- Fjern musen fra kammeret. Bekreft et dypt fly av anestesi av en tå klype, et øre klemme og en hale knipe. Plasser musen i liggende posisjon på operasjonsområdet og levere 2,5% isoflurane ved hjelp av silikon maske. Gi buprenorfin ved 0,1 mg/kg smertestillende og påfør øyen salve på øynene.
- Fjern pels fra ventrale siden av nakken til nedre del av magen ved hjelp av Nair, et hår fjerningsmiddel.
- Rens og desinfisere operasjonsstedet ved hjelp av en to-trinns skrubb med 10% povidon-jod og 70% isopropanol. Påfør en kirurgisk gardin.
2. operative prosedyrer
-
Eksponering av klemme og punktering nettsteder
- Klargjør sterile instrumenter og bruk sterile hansker for å opprettholde sterilitet gjennom hele operasjonen.
- Lag en hud-dyp midtlinjen abdominal snitt med en skalpell fra nivået av den nedre leveren kanten til like over pubis. Skjær gjennom muskulaturen med saks for å åpne bukhulen.
- Sett en retractor inn i magen og trekk ut innvollene til høyre side. Holde dem fuktig ved innpakning i en saltvann gjennomvåt gasbind. Hente blæren og sæd blemmer (i mannlige mus) og trekke dem ut til caudal side. Analysere mesenterium mellom endetarmen og retroperitoneum med en mikro-nål holder for å få en full oversikt over aorta og IVC.
- Analysere infra-renal aorta og IVC en blokk fra lateral og rygg rundt retroperitoneal vev med en mikro-nål holder å krysse-klemme dem sammen.
- Analysere de omkringliggende vev for å avdekke aorta punktering området på cirka tre fjerdedeler av avstanden fra venstre nyre vene til aorta bifurkasjonen.
-
IVC-disseksjon
- Analysere mellom infra-renal IVC og aorta umiddelbart til venstre nyre vene. Forlenge disseksjon distally til halvveis mellom venstre nyre vene og aorta bifurkasjonen, slik at infra-renal IVC, både oppstrøms og nedstrøms til stenose, kan observeres postoperativt.
Merk: Blunt disseksjon mellom IVC og aorta skal utføres fra umiddelbart til venstre nyre vene der bindevev mellom IVC og aorta er relativt løs. - Lag et vindu for å skille IVC fra aorta på dette nivået og analysere IVC fra det omliggende vevet. Plasser en 8-0 polyamid monofilament Sutur først under IVC og aorta (figur 1a), og deretter plassere Sutur under bare IVC (figur 1B) ved å trekke den Sutur enden gjennom vinduet.
Merk: siden IVC er skjør, dissekere langs aorta adventitia er nyttig å lage et vindu for å hindre at IVC samt små IVC eller aorta grener fra å bli skadet. Hvis blødning oppstår, er det sannsynlig å være ukontrollert. Hvis IVC har forskjellige side grener, plasserer du en 8-0 Sutur distally til grenene.
- Analysere mellom infra-renal IVC og aorta umiddelbart til venstre nyre vene. Forlenge disseksjon distally til halvveis mellom venstre nyre vene og aorta bifurkasjonen, slik at infra-renal IVC, både oppstrøms og nedstrøms til stenose, kan observeres postoperativt.
-
AVF opprettelse
- Bøy en 25 G nål til en 45-60 ° vinkel på et punkt ~ 4 mm fra nålespissen.
- Klem infra-nyre aorta og IVC ved å bruke en mikrokirurgisk klips.
- Roter aorta anteriort og caudally ved å fatte bindevevet rundt bifurkasjonen for å avdekke punktering stedet av aorta strukket det litt til ventrale side.
- Holding av aorta i en passende posisjon, punktering gjennom aorta inn i IVC ved hjelp av forberedt 25 G nål (figur 1C).
- Frigjør aorta og dekk til punktering området med omkringliggende vev trekke opp fra venstre side av aorta. Ta ut nålen og trykk på punktering stedet forsiktig ved hjelp av en bomulls-tippet pinne for hemostase.
-
Opprettelse av IVC-stenose
- Plasser et tips av et 22 G IV-kateter (se tabell over materialer) på IVC-lengderetningen. Ombinde IV-kateteret og IVC sammen med en 8-0 Sutur (figur 1d), og fjern deretter IV-kateteret.
- Bekreft primær hemostase (figur 1e) og løsne deretter AORTA og IVC. Dekk til punktering stedet 1 min mer for å sikre hemostase.
Merk: ikke klem for lenge for å unngå at IVC-trombose er stenose. - Return organer til sine opprinnelige posisjoner og lukke magen med 6-0 sting.
3. post-operative prosedyrer
- Etter lukking av abdominal såret, avvikle isoflurane inhalasjon. Putte musa i en individ bedding-ledig bur og sted byrået opp på en Thermal oppbacking apparat å forhindre nedkjøling.
Merk: musen er observert før de oppnår og vedlikeholder sternal recumbency. Påfør postoperativ pleie, inkludert analgesi og sår behandling, i samsvar med anbefalingene fra den lokale IACUC. For analgesi bruker vi buprenorfin ved 0,1 mg/kg intrasmuscularly hver 12 h for 48 h etter kirurgiske prosedyrer og deretter etter behov. - Bekreft AVF-patency postoperativt ved hjelp av Doppler-ultralyd (se tabell over materialer). I tillegg måler du andre fartøy og strømningsegenskaper etter behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannlige mus gjennomgikk operasjonen nevnt ovenfor for å opprette både en AVF og en IVC-stenose. Kontroll mus gjennomgikk bare laparotomy og Disseksjon av vevet rundt IVC, f. eks, en humbug prosedyre, eller bare etablering av en IVC-stenose uten samtidig etablering av en AVF.
IVC ble observert med Doppler ultralyd på dag 7 etter kirurgisk inngrep (figur 2). Den fistel og stenose områder av IVC ble lett oppdages i den langsgående visningen (figur 2C, E). Den IVC mellom fistel og stenose var utvidet i mus har en AVF med stenose. Den ultralyd bølgeformer ble undersøkt i IVC på det punktet av stenose (figur 2D, F). I mus som bærer en stenose alene, uten en AVF, viste det stenose segmentet en venøs bølgeform med mer Spectral utvide enn humbug-opererte mus, men uten mye pulsatility. Men i mus som har en AVF så vel som en stenose, stenose segmentet viste en pulsatile bølgeform i tillegg til Spectral utvide. Den gjennomsnittlige maksimale hastigheten av flyten ved stenose i mus som har en AVF med stenose, var signifikant høyere enn mus som hadde stenose alene (tabell 1).
Doppler ultralyd B-modus ble brukt i tverrgående visninger for å vurdere IVC på dag syv etter operasjonen (tabell 1). Gjennomsnittlig IVC-diameter ved stenose i mus som har stenose alene, var lik musene som hadde en AVF, så vel som stenose (tabell 1). Prosent stenose for IVC ble beregnet i henhold til NASCET-metoden12. Ved å bruke enten oppstrøms segmentet eller det nedstrøms segmentet som referanse, var prosent stenose betydelig større hos mus som hadde en AVF i tillegg til stenose (tabell 1).
Figur 1. Operative bilder av murine AVF modell med venøs stenose. (A) plassere en 8-0 Sutur under IVC (blå pilspisser) og aorta (røde pilspisser) halvveis mellom venstre renal blodåre (gule pilspisser) og aorta bifurkasjonen, distally til noen store IVC grener hvis de finnes. (B) plasser Sutur under IVC bare. (C) etter proksimale klemme, punktering av aorta gjennom både vegger og inn i IVC. (D) knyt en spiss på et 22 G IV KATETER og IVC sammen med den plasserte Sutur. (E) Fjern kateteret og løsne. Arteriell blodstrøm gjennom IVC-stenose kan observeres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Ultralyd funn på dag 7 etter kirurgisk inngrep. Topp: representative bilder av mus med humbug prosedyre. (A) B-modus bilde viser IVC i lengde visning. Venstre side er skallen side. (B) bølgeform av kranieankrene IVC. Middle: representative bilder av mus med en stenose alene. (C) B-modus bildet viser IVC inkludert stenose (gul stjerne) i den langsgående visningen. Venstre side er skallen side. (D) bølgeform i området av stenose. Bunn: representative bilder av mus som har AVF med stenose. (E) B-modus bildet viser IVC inkludert fistel (hvit stjerne) og stenose. Venstre side er skallen side. (F) bølgeform i området av stenose. Hvit skala linje representerer 1 mm. gul skala bar representerer 100 MS. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stenose | ja | ja | P-verdi |
| AVF | nei | ja | |
| Tid-gjennomsnittlig maksimal hastighet (mm/s) | 180 | 878 | 0,0023 |
| Stenose diameter (mm) | 0,62 ± 0,01 | 0,63 ± 0,01 | 0,3558 |
| % stenose (upsteam) | 43 prosent | 66 prosent | 0,0159 |
| % stenose (downsteam) | 42 prosent | 56 prosent | 0,0006 |
Tabell 1. Ultralyd måling ved IVC-stenose området for hver gruppe. Ultralyd avledet målinger ved IVC stenose området av mus som har stenose alene og mus har AVF med stenose på dag 7 etter operasjonen. % stenose (oppstrøms) = (1-[diameter ved stenose/diameter ved oppstrøms referanse segment]) x 100%. % stenose (nedstrøms) = (1-[diameter ved stenose/diameter ved nedstrøms referanse segment]) x 100%. % utvidelse = (diameter på postoperativ dag 7/preoperativ diameter på samme segment) x 100%. P -verdier er basert på student t-tester, n = 4-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den murine aVF modellen har blitt brukt til å studere de grunnleggende mekanismene og molekylære hendelser som fører til aVF modning13,14. I denne studien, endret vi en etablert murine AVF modell for å skape en roman murine aortocaval fistel modell med en IVC stenose i strøm veiene i fistel. Vår ligation modellen er lik flere tidligere beskrevet murine modeller som bruker vaskulær ligation. En murine modell av dyp venetrombose ble opprettet ved hjelp av delvis IVC-ligation med en 30 G nål spacer15; Vi brukte et større 22 G IV kateter spacer for å skape en mindre stenose og dermed unngå trombotiske okklusjon. En murine modell av delvis hals puls arterie ligation ble brukt til å indusere forstyrret flyt, fører til aterosklerose16; vår modell på samme måte brukt en delvis venøs ligation og følgelig demonstrert forstyrret flyt i IVC på området av den delvise ligation.
Mekanismer underliggende AVF modnings svikt forårsaket av fistel venøs stenose har blitt undersøkt. Hemodynamisk endringer, inkludert forstyrret frekvenser av skjær stress ble vist å være viktige faktorer17,18. En beregningsorientert væske dynamikk simulering viste forstyrret flyt ved venøs stenose19, selv om dyremodeller av aVF med venøs stenose ikke har vært tidligere rapportert. Denne modifiserte murine aortocaval fistel-modellen kan brukes til å studere en AVF med sentral venøs stenose. IVC-diameteren på stenose har mindre variasjon og mer konsistens i denne modellen. delvis IVC-ligation ved hjelp av et IV-kateter øker reproduserbarheten til denne modellen. Kliniske symptomer og tegn på sentral vene stenose utvikler seg ofte bare etter fistel skapelse i ipsilateral ekstremiteter9. I denne modellen, mus har en delvis IVC stenose (< 50%) hadde normal flyt og var asymptomatisk, mens tillegg av en AVF økte graden av stenose i en grad som kan forårsake symptomer (> 50%) (Figur 2, tabell 1). Disse resultatene etterligne fenotype av sentrale vene stenose; økt venøs Flow på grunn av tilstedeværelsen av fistel kan avsløre eksistensen av asymptomatisk sentral vene stenose, forårsaker venøs hypertensjon og svikt i fistel modning.
Det er noen kritiske trinn og punkter for å forbedre suksessen rate og konsistens av prosedyren. Hvis IVC har distinkte side grener, en 8-0 Sutur er plassert distally (caudally) til grenene (figur 1). I den opprinnelige murine AVF modellen, side grener av IVC er vanligvis ignorert fordi høyere vaskulær motstand av grenene holder fistel flyt fra å komme inn i grenene. Imidlertid hvis IVC-stenose er opprettet proksimalt til forskjellige side grener i denne modellen, kan fistel flyten flykte inn i grenene på grunn av vaskulær motstand av den nylig plasserte Sutur. For å unngå massiv blødning, er IVC-disseksjon startet umiddelbart forsiktig til venstre nyre vene og utvides ytterligere forsiktig til et punkt der IVC skal ligaturer. Dette trinnet er den mest kritiske delen av denne operasjonen; blødning fra skadede IVC eller grener er sannsynlig å være ukontrollert. Videre, for å unngå å berøre IVC når plassere Sutur rundt det, og potensielt rive den, det 8-0 Sutur er opprinnelig plassert rundt både IVC og aorta, og deretter flyttet under bare IVC. Til slutt, knuten på 8-0 Sutur er plassert på siden av IVC, ikke direkte anteriort, for å hindre enhver gjenstand som kan påvirke postoperativ ultralyd undersøkelse.
En potensiell begrensning av denne studien er at IVC-stenose i denne modellen er opprettet av ekstern mekanisk komprimering; adventitial betennelse forårsaket av Sutur og IVC-disseksjon kan potensielt påvirke venøs remodeling på stenose området. I tillegg er fistel i denne modellen er laget mellom aorta og IVC slik at alle fistel flyten er rettet inn i IVC-stenose, mens fistel opprettet i menneskets øvre ekstremiteter ofte tillater sikkerhet årer til å utvikle, holde stenose asymptomatisk. Fysiske tegn på sentrale venøs stenose som for eksempel å ødem og sivile dannelse er ikke vist i denne modellen.
Oppsummert introduserer vi en protokoll for en roman murine aortocaval fistel modell med en IVC utløp stenose som er enkel å utføre og reproduserbar. Vi forventer at denne modellen vil være nyttig å studere hemodynamisk endringer av en sentral venøs stenose som kan påvirke AVF modning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health (NIH) Grant R01-HL128406; USA Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory forskning og utvikling program Merit Review Award I01-BX002336; så vel som med ressurser og bruk av fasiliteter på VA Connecticut Healthcare system, West Haven, CT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-60 Mhz scan head | VisualSonics Inc. | RMV-704 | |
| 8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle | AROSuture | T06A08N14-13 | polyamide monofilament sutures |
| Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H |
VetEquip | 941444 | |
| Isoflo, Isoflurane liquid | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Mice, C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | |
| Pet Bed Microwave Heating Pad | Snuggle Safe | 6250 | |
| PrecisionGlide Needle 25G | BD | 305122 | |
| Surflo I.V. Catheter 22G | Terumo | SR-OX2225CA | 0.85mm outer diameter |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument | RS-5424 | |
| Vevo770 High Resolution Imaging System | VisualSonics Inc. | 770 |
References
- Dember, L. M., et al. Effect of clopidogrel on early failure of arteriovenous fistulas for hemodialysis: a randomized controlled trial. JAMA. 299 (18), 2164-2171 (2008).
- Dixon, B. S. Why don't fistulas mature? Kidney International. 70 (8), 1413-1422 (2006).
- Wilmink, T., Hollingworth, L., Powers, S., Allen, C., Dasgupta, I. Natural History of Common Autologous Arteriovenous Fistulae: Consequences for Planning of Dialysis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 51 (1), 134-140 (2016).
- Al-Jaishi, A. A., et al. Patency rates of the arteriovenous fistula for hemodialysis: a systematic review and meta-analysis. American Journal of Kidney Diseases. 63 (3), 464-478 (2014).
- Rocco, M. V., Bleyer, A. J., Burkart, J. M. Utilization of inpatient and outpatient resources for the management of hemodialysis access complications. American Journal of Kidney Diseases. 28 (2), 250-256 (1996).
- Roy-Chaudhury, P., Sukhatme, V. P., Cheung, A. K. Hemodialysis vascular access dysfunction: a cellular and molecular viewpoint. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 1112-1127 (2006).
- Quencer, K. B., Arici, M. Arteriovenous Fistulas and Their Characteristic Sites of Stenosis. AJR: American Journal of Roentgenology. 205 (4), 726-734 (2015).
- Kian, K., Asif, A. Cephalic arch stenosis. Semin Dial. 21 (1), 78-82 (2008).
- Agarwal, A. K. Central vein stenosis. American Journal of Kidney Diseases. 61 (6), 1001-1015 (2013).
- Glanz, S., et al. Axillary and subclavian vein stenosis: percutaneous angioplasty. Radiology. 168 (2), 371-373 (1988).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial. Methods, patient characteristics, and progress. Stroke. 22 (6), 711-720 (1991).
- Kuwahara, G., et al. CD44 Promotes Inflammation and Extracellular Matrix Production During Arteriovenous Fistula Maturation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1147-1156 (2017).
- Protack, C. D., et al. Eph-B4 regulates adaptive venous remodeling to improve arteriovenous fistula patency. Scientific Reports. 7 (1), 15386 (2017).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. J Vis Exp. (130), (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Ene-Iordache, B., Remuzzi, A. Disturbed flow in radial-cephalic arteriovenous fistulae for haemodialysis: low and oscillating shear stress locates the sites of stenosis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (1), 358-368 (2012).
- Yamamoto, K., et al. Disturbed shear stress reduces Klf2 expression in arterial-venous fistulae in vivo. Physiological reports. 3, (2015).
- Remuzzi, A., Ene-Iordache, B. Novel paradigms for dialysis vascular access: upstream hemodynamics and vascular remodeling in dialysis access stenosis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 8 (12), 2186-2193 (2013).
