Murine model af central venøs stenose ved hjælp af aortocaval fistel med en udstrømning stenose

Summary

En aortocaval fistel blev skabt ved at punktere murine infra-renal aorta gennem begge vægge ind i den ringere Vena cava og blev efterfulgt af skabelsen af en stenose i sin udstrømning via delvis ligering af den ringere Vena cava. Denne reproducerbare model kan bruges til at studere central venøs stenose.

Abstract

Central venøs stenose er en vigtig enhed, der bidrager til arteriovenøs fistel (avf) fiasko. En murine AVF-model blev modificeret for at skabe en delvis ligering af den ringere Vena cava (IVC) i udstrømningen af fistel, der efterligner den centrale venøse stenose. Der indføres tekniske aspekter af denne model. Aorta og IVC er eksponeret, efter en abdominal incision. Den infra-renal aorta og IVC er dissekeret for proksimal fastspænding, og den distale aorta er udsat for punktering. IVC ved midtpunktet mellem den venstre renale vene og aorta bifurcation dissekteres omhyggeligt for at placere en 8-0 sutur under IVC. Efter fastspænding af aorta og IVC, en AVF er skabt ved at punktere den infra-renal aorta gennem begge vægge i IVC med en 25 G nål, efterfulgt af ligating en 22 G intra-venøs (IV) kateter og IVC sammen. Kateteret fjernes derefter, hvilket skaber en reproducerbar venøs stenose uden okklusion. Aorta og IVC er ikke fastklemt efter at have bekræftet primær hæmostase. Denne nye model af central vene stenose er let at udføre, reproducerbar, og vil lette undersøgelser af AVF fiasko.

Introduction

Arteriovenøse fistler (AVF) er de mest almindelige adgangsveje til hæmodialyse, med overlegen åbenhed og reduceret infektion sammenlignet med andre adgange såsom transplantationer eller centrale venøse katetre. Dog, op til 60% af avf undlader at modne^1,2,3; en nylig systematisk gennemgang rapporterede, at primære patency satser på 1 år var kun 60%⁴. Stenose langs den venøse udstrømning forårsager overvejende svigt af avf modning^5,6. Der er visse karakteristiske steder tilbøjelige til stenose proksimal til fistel: juxtaanastomotic swing segment for radiocephalic fistel, cephalgic Arch region for brachiocephalic fistel og den centrale vene for fistel med tidligere placerede ipsilaterale subclavia eller interne jugulære venekateter^7,8.

Central vene stenose er ofte asymptomatisk hos patienter uden AVF, men kan forårsage ipsilaterale ekstremitet ødem ved venøs hypertension samt svigt af fistel modning når udfordret af fistel flow⁹. Patofysiologien af central vene stenose er sandsynligvis relateret til inflammation og den aktiverede koagulations kaskade efter enhedens placering. Desuden kan konstant bevægelse af kateterspidsen samt øget flow fra fistel ændre forskydnings stress, hvilket resulterer i trombocytaflejring og venøs vægtykkelse¹⁰. For at forstå de grundlæggende mekanismer underliggende AVF-fejl forårsaget af central vene stenose, kræves der en dyremodel, som efterligner central venøs stenose med en AVF.

Vi har etableret en murine aortocaval fistel model, der er let at udføre og mestre og rekapitulerer det kliniske forløb af human AVF. ¹¹ vi anvendte begreber og teknik af flere tidligere etablerede murine modeller til at skabe en roman MURINE avf model med venøs stenose. Vi introducerer en murine aortocaval fistel model med en IVC stenose i udstrømnings fistel, der kan bruges til studiet af central vene stenose.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført med godkendelse fra Yale universitetets institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg (IACUC).

1. anæstesi og præoperative procedurer

1. Steriliser alle kirurgiske instrumenter og materialer ved autoklave iser. Tænd for den termiske støtteenhed for at være sikker på, at den er varm (40 – 42 °C).
2. Placer en 9 – 11-ugers gammel C57BL/6 mus i en akryl induktions kammer og bedøve det med fordampet 2,5% isofluran og 0,8 L/min ilt. Anæstesi induktion tager ca. 3 min.
3. Fjern musen fra kammeret. Bekræft en dyb plan af anæstesi af en tå knivspids, en øre knivspids og en hale knivspids. Placer musen i liggende position på operationsområdet og levere 2,5% isofluran ved hjælp af silikone maske. Give buprenorphin ved 0,1 mg/kg analgetikum og anvende oftalmisk salve til øjnene.
4. Fjern pels fra den ventrale side af halsen til den nedre del af maven ved hjælp af Nair, en hårfjerning.
5. Rense og desinficere operationsstedet ved hjælp af en to-trins scrub med 10% povidon-jod og 70% isopropanol. Påfør et kirurgisk Drape.

2. operative procedurer

1. Eksponering af klemme-og punkterings steder
   1. Forbered sterile instrumenter og bær sterile handsker for at opretholde steriliteten under hele operationen.
   2. Lav en hud-dyb midterlinjen abdominal indsnit med en skalpel fra niveauet af den nedre lever kant til lige over pubis. Skær gennem muskulaturen med en saks for at åbne bughulen.
   3. Sæt en retraktor ind i maven og træk tarmene ud til højre side. Hold dem fugtige ved indpakning i en saltvand-gennemblødt gaze. Regul blæren og Sædblærer (i hanmus) og træk dem ud til den hale side. Dissekere mesenteriet mellem endetarmen og retroperitoneum med en mikro-nåle holder for at få en fuld visning af aorta og IVC.
   4. Dissekere den infra-renal aorta og IVC en bloc fra det laterale og dorsale omgivende retroperitoneale væv med en mikro-kanyle holder til at krydse dem sammen.
   5. Dissekere det omgivende væv for at udsætte aorta punkturstedet ved ca. tre fjerdedele af afstanden fra venstre renal vene til aorta bifurcation.
2. IVC dissektion
   1. Dissekere mellem den infra-renale IVC og aorta umiddelbart distale til venstre renal vene. Forlæng disseksten til halvvejs mellem den venstre renale vene og aorta bifurcation, således at den infrarøde, IVC, både opstrøms og nedstrøms til stenose, kan observeres postoperativt.
      Bemærk: Blunt dissektion mellem IVC og aorta skal udføres fra umiddelbart distale til venstre renal vene, hvor bindevæv mellem IVC og aorta er relativt løs.
   2. Lav et vindue for at adskille IVC fra aorta på dette niveau og dissekere IVC fra det omgivende væv. Placer en 8-0 polyamid Monofilament sutur for det første under IVC og aorta (figur 1a), og Placer derefter suturen under kun IVC (figur 1b) ved at trække sutur enden gennem vinduet.
      Bemærk: da IVC er skrøbelig, dissekting langs aorta adventitia er nyttigt at gøre et vindue for at forhindre IVC samt små IVC eller aorta grene fra at blive beskadiget. Hvis blødning opstår, det er sandsynligt, at være ukontrollabel. Hvis IVC har særskilte sidegrene, skal du placere en 8-0 sutur fikseres til grenene.
3. AVF-oprettelse
   1. Bøj en 25 G nål til en 45 – 60 ° vinkel på et punkt ~ 4 mm fra nålens spids.
   2. Fastgør den infrarøde og IVC-baserede aorta ved at anvende et mikrokirurgisk klip.
   3. Drej aorta overarms og caudally ved at gribe bindevæv omkring bifurcation for at udsætte punkturstedet for aorta strakt det lidt til den ventrale side.
   4. Hold aorta i en passende position, punktering gennem aorta ind i IVC ved hjælp af den tilberedte 25 G nål (figur 1c).
   5. Slip aorta og dæk punkturstedet med det omgivende væv trække op fra venstre side af aorta. Tag nålen ud og tryk forsigtigt på punkturstedet ved hjælp af en vatteret vatpind til hæmostase.
4. Skabelse af IVC stenose
   1. Anbring et spidsen af et 22 G IV kateter (Se tabellen over materialer) på IVC længderetningen. Ligate IV kateter og IVC sammen med en 8-0 (figur 1d), og fjern derefter IV-kateteret.
   2. Bekræft primær hæmostase (figur 1E) og derefter unclamp aorta og IVC. Dæk punkturstedet 1 min mere for at sikre hæmostase.
      Bemærk: du må ikke klemme for længe for at undgå IVC trombose distale til stenose.
   3. Returnere organer til deres oprindelige positioner og lukke maven med 6-0 suturer.

3. post operative procedurer

1. Efter lukning af abdominal sår, afbryde isofluran indånding. Sæt musen i en individuel sengetøj-fri bur og placere buret på en termisk støtteenhed for at forhindre hypotermi.
   Bemærk: musen observeres, indtil de opnår og opretholder brystbenet recumbency. Anvend postoperativ pleje, herunder analgesi og sårpleje i overensstemmelse med anbefalingerne fra den lokale IACUC. For analgesi bruger vi buprenorphin ved 0,1 mg/kg intrasmuscularly hver 12 h for 48 h efter de kirurgiske indgreb og derefter efter behov.
2. Bekræft AVF-patency postoperativt ved hjælp af Doppler-ultralyd (Se tabellen over materialer). Derudover måles andre fartøjs-og strømningskarakteristika efter behov.

Representative Results

Hanmus gennemgik ovennævnte operation for at skabe både en AVF og en IVC stenose. Control mus gennemgik kun laparotomi og dissektion af vævet omkring IVC, f. eks, en fingeret procedure, eller kun skabelse af en IVC stenose uden samtidig oprettelse af en AVF.

IVC blev observeret med Doppler ultralyd på dag 7 efter den kirurgiske procedure (figur 2). De fistel og stenose områder i IVC blev let påvises i længderetningen (figur 2c, E). IVC mellem fistel og stenose blev dilateret i mus, der havde en AVF med stenose. Ultralydbølge formerne blev undersøgt i IVC på tidspunktet for stenose (figur 2D, F). I mus med en stenose alene, uden en AVF, viste stenose segmentet en venøs bølgeform med mere spektral udvidelse end Sham-betjente mus, men uden megen pulsatilitet. Men, i mus, der har en AVF samt en stenose, stenose segment viste en pulsatile bølgeform ud over spektral udvidelse. Den tid i gennemsnit maksimale hastighed af strømmen ved stenose i mus, der har en AVF med stenose var signifikant højere end mus, der har stenose alene (tabel 1).

Doppler ultralyd B-tilstand blev anvendt i tværgående visninger til at vurdere IVC på dag syv efter operationen (tabel 1). Den gennemsnitlige IVC-diameter ved stenose hos mus med stenose alene var den samme som musene med AVF og stenose (tabel 1). Den procentvise stenose af IVC blev beregnet i henhold til NASCET metode¹². Ved hjælp af enten upstream-segmentet eller downstream-segmentet som reference var procent stenose signifikant større i mus med en AVF ud over stenose (tabel 1).

Figur 1. Operative billeder af murine AVF model med venøs stenose. A) placere en 8-0 sutur under IVC (blå pilespidser) og aorta (røde pilespidser) halvvejs mellem den venstre renale vene (gule pilespidser) og aorta bifurcation, fikseres til alle store IVC-grene, hvis de findes. B) Anbring suturen under IVC. C) efter proksimal fastspænding punkteres aorta gennem begge vægge og ind i IVC. D) binde et spidsen af et 22 G IV kateter og IVC sammen med den placerede sutur. (E) Fjern kateteret og unclamp. Arteriel blodgennemstrømning gennem IVC stenose kan observeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Ultralyd fund på dag 7 efter den kirurgiske procedure. Top: repræsentative billeder af mus med en fingeret procedure. (A) billede af B-tilstand viser IVC i langsgående visning. Venstre side er den kranie side. (B) bølgeform af INFRARENAL IVC. Middle: repræsentative billeder af mus med en stenose alene. (C) billede af B-tilstand viser IVC, herunder stenose (gul stjerne) i længderetningen. Venstre side er den kranie side. (D) bølgeform i området for stenose. Bund: repræsentative billeder af mus, der har AVF med stenose. (E) billede af B-tilstand viser IVC, herunder fistel (hvid Asterisk) og stenose. Venstre side er den kranie side. F) bølgeform i stenose området. Hvid skala bar repræsenterer 1 mm. gul skala bar repræsenterer 100 ms. Klik her for at se en større version af dette tal.

Stenose	Ja	Ja	P-værdi
AVF	Nej	Ja
Tid-gennemsnitlig maksimal hastighed (mm/s)	180	878	0,0023
Stenose diameter (mm)	0,62 ± 0,01	0,63 ± 0,01	0,3558
% stenose (upsteam)	43%	66%	0,0159
% stenose (downsteam)	42%	56%	0,0006

Tabel 1. Ultralyd måling på IVC stenose område i hver gruppe. Ultralyd afledte målinger på IVC stenose område af mus, der har stenose alene og mus, der har AVF med stenose på dag 7 efter operationen. % stenose (upstream) = (1-[diameter ved stenose/diameter ved upstream reference segment]) x 100%. % stenose (downstream) = (1-[diameter ved stenose/diameter ved downstream reference segment]) x 100%. % dilation = (diameter på postoperative dag 7/præoperativ diameter i samme segment) x 100%. P -værdier er baseret på elevens t-tests, n = 4-6.

Discussion

Murine avf-modellen er blevet brugt til at studere de grundlæggende mekanismer og molekylære hændelser, der fører til avf modning^13,14. I denne undersøgelse modificerede vi en etableret murine avf model til at skabe en roman murine aortocaval fistel model med en IVC stenose i udstrømning tarmkanalen af fistel. Vores ligering model ligner flere tidligere beskrevne murine modeller, der bruger vaskulære ligering. En murine model af dyb venetrombose blev oprettet ved hjælp af delvis IVC ligering med en 30 G nål spacer¹⁵; Vi brugte en større 22 G IV kateter spacer til at skabe en mindre stenose og derved undgå trombotisk okklusion. En murine model af delvis carotis arterie ligering blev brugt til at fremkalde forstyrret flow, fører til åreforkalkning¹⁶; vores model anvendte ligeledes en delvis venøs ligering og udviste derfor forstyrret strømning i IVC på området for partiel ligationen.

Mekanismer underliggende AVF-modnings fejl forårsaget af fistel venøs stenose er blevet undersøgt. Hæodynamiske ændringer, herunder forstyrret frekvenser af shear stress viste sig at være vigtige faktorer^17,18. En computational fluid Dynamics simulation viste forstyrret flow ved venøs stenose¹⁹, selv om dyremodeller af avf med venøs stenose ikke tidligere er blevet rapporteret. Denne modificerede murine aortocaval fistel model kan bruges til at studere en AVF med central venøs stenose. Den IVC diameter ved stenose har mindre variation og mere konsistens i denne model; delvis IVC-ligering ved hjælp af et IV-kateter øger denne model's reproducerbarhed. Kliniske symptomer og tegn på central vene stenose udvikles ofte først efter fisteldannelse i den ipsilaterale ekstremitet⁹. I denne model har mus, der har en delvis IVC stenose (< 50%) havde normal flow og var asymptomatiske, hvorimod tilsætning af en AVF øgede graden af stenose i en grad, der kunne forårsage symptomer (> 50%) (Figur 2, tabel 1). Disse resultater efterligner Fænotypen af central vene stenose; øget venøs flow på grund af tilstedeværelsen af fistel kan afsløre eksistensen af asymptomatisk central vene stenose, forårsager venøs hypertension og svigt af fistel modning.

Der er nogle kritiske skridt og punkter for at forbedre succesraten og sammenhængen i proceduren. Hvis IVC har særskilte sidegrene, er en 8-0 sutur placeres fikseres (caudally) til grenene (figur 1). I den oprindelige murine AVF model, sidegrene af IVC er typisk ignoreret, fordi den højere vaskulære modstand af grenene holder fistel strømmen fra ind i grenene. Men hvis IVC stenose er skabt proklelt til særskilte sidegrene i denne model, kan fistel strømmen flygte ind i grenene på grund af vaskulær modstand ved den nyligt placerede sutur. For at undgå massiv blødning påbegyndes IVC dissektion straks inferiorly til venstre renal vene og forlænges yderligere inferiorly til det punkt, hvor IVC skal være ligeret. Dette trin er den mest kritiske del af denne operation; blødning fra beskadigede IVC eller grene er sandsynligvis ukontrollabel. For at undgå at røre ved IVC, når du placerer suturen omkring det, og potentielt rive det, 8-0 sutur er oprindeligt placeret omkring både IVC og aorta, og derefter omplaceres under kun IVC. Endelig er knude af 8-0 sutur er placeret på siden af IVC, ikke direkte anteriorly, at forhindre enhver artefakt, der kan påvirke den postoperative ultralydsundersøgelse.

En potentiel begrænsning af denne undersøgelse er, at IVC stenose i denne model er skabt af ekstern mekanisk kompression; utilsigtet betændelse forårsaget af sutur og IVC dissektion kan potentielt påvirke venøs remodeling i stenose området. Desuden er fistel i denne model lavet mellem aorta og IVC, således at alle fistel strømmen er rettet ind i IVC stenose, mens fistel skabt i den menneskelige øvre ekstremitet ofte tillader sikkerhedsstillelse vener til at udvikle, holde stenose asymptomatisk. Fysiske tegn på central vene stenose såsom distale ødem og sikkerhedsstillelse dannelse er ikke vist i denne model.

Sammenfattende introducerer vi en protokol for en roman murine aortocaval fistel model med en IVC udstrømning stenose, der er let at udføre og reproducerbare. Vi forventer, at denne model vil være nyttigt at studere hæmodynamiske ændringer af en central vene stenose, der kan påvirke AVF modning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-60 Mhz scan head	VisualSonics Inc.	RMV-704
8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle	AROSuture	T06A08N14-13	polyamide monofilament sutures
Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H	VetEquip	941444
Isoflo, Isoflurane liquid	Zoetis	26675-46-7
Mice, C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
Pet Bed Microwave Heating Pad	Snuggle Safe	6250
PrecisionGlide Needle 25G	BD	305122
Surflo I.V. Catheter 22G	Terumo	SR-OX2225CA	0.85mm outer diameter
Vascular clamp	Roboz Surgical Instrument	RS-5424
Vevo770 High Resolution Imaging System	VisualSonics Inc.	770