Summary
Una fistola aortocaval è stata creata perforando l'aorta infra-renale murina attraverso entrambe le pareti nella vena cava inferiore ed è stata seguita dalla creazione di una stenosi nel suo deflusso attraverso la legatura parziale della vena cava inferiore. Questo modello riproducibile può essere utilizzato per studiare la stenosi venosa centrale.
Abstract
La stenosi venosa centrale è un'entità importante che contribuisce al fallimento della fistola arteriovenosa (AVF). Un modello MURine AVF è stato modificato per creare una legatura parziale della vena cava inferiore (IVC) nel deflusso della fistola, imitando la stenosi venosa centrale. Vengono introdotti aspetti tecnici di questo modello. L'aorta e l'IVC sono esposti, a seguito di un'incisione addominale. L'aorta infra-renale e l'IVC sono sezionati per il bloccaggio prossimale, e l'aorta distale è esposta per la puntura. L'IVC nel punto medio tra la vena renale sinistra e la biforcazione aortica viene attentamente sezionato per posizionare un sutura sotto l'IVC. Dopo aver bloccato l'aorta e IVC, viene creato un AVF forando l'aorta afra-renale attraverso entrambe le pareti nell'IVC con un ago da 25 G, seguito dalla legatura di un catetere intrave (IV) da 22 G e IVC insieme. Il catetere viene quindi rimosso, creando una stenosi venosa riproducibile senza occlusione. L'aorta e l'IVC sono sbloccati dopo aver confermato l'emostasi primaria. Questo nuovo modello di stenosi venosa centrale è facile da eseguire, riproducibile e faciliterà gli studi sul fallimento dell'AVF.
Introduction
Le fistole arteriovenose (AVF) sono gli accessi più comuni per l'emodialisi, con una patenza superiore e un'infezione ridotta rispetto ad altri accessi come innesti o cateteri venosi centrali. Tuttavia, fino al 60% di AVF non riesce a maturare1,2,3; una recente revisione sistematica ha riferito che i tassi di patenza primaria a 1 anno erano solo il 60%4. La stenosi lungo il deflusso venoso provoca prevalentemente il fallimento della maturazione AVF5,6. Ci sono alcuni luoghi caratteristici inclini alla stenosi prossima alla fistola: il segmento a oscillazione accostato per la fistola radiocefalica, la regione arcicefalica per la fistola brachiocefalica e la vena centrale per la fistola con precedente Catetere di vena subclaviale ipsilaterale o giugulare interno7,8.
La stenosi venosa centrale è spesso asintomatica in pazienti senza AVF, ma può causare edema ipsilaterale all'estremità da ipertensione venosa e fallimento della maturazione della fistola quando viene sfidata dal flusso di fistola9. La fisiofisiologia della stenosi venosa centrale è probabilmente correlata all'infiammazione e alla cascata di coagulazione attivata dopo il posizionamento del dispositivo. Inoltre, il movimento costante della punta del catetere e l'aumento del flusso dalla fistola possono alterare lo stress da taglio, con conseguente deposizione di piastrine e ispessimento venoso della parete10. Per comprendere i meccanismi di base alla base del fallimento di AVF causato dalla stenosi venosa centrale, è necessario un modello animale che imita la stenosi venosa centrale con un AVF.
Abbiamo stabilito un modello di fistola murina aortocaval che è facile da eseguire e padroneggiare e ricapitola il corso clinico di AVF umano. 11 Abbiamo applicato i concetti e la tecnica di diversi modelli murini precedentemente stabiliti per creare un nuovo modello murine AVF con stenosi venosa. Introduciamo un modello di fistola murinaa-cavalla con una stenosi IVC nella fistola di deflusso che può essere utilizzata per lo studio della stenosi venosa centrale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati con l'approvazione del Comitato istituzionale di cura e uso degli animali dell'Università di Yale (IACUC).
1. Anestesia e procedure pre-operative
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e materiali automatizzando l'autoclaving. Accendere il dispositivo di supporto termico per essere certi che sia caldo (40-42 gradi centigradi).
- Mettere un topo C57BL/6 di 9-11 settimane in una camera di induzione acrilica e anestesizzarlo con 2,5% di isoflurane vaporizzato e 0,8 ossigeno L/min. L'induzione dell'anestesia dura circa 3 min.
- Togliere il mouse dalla camera. Confermare un piano profondo di anestesia da un pizzico di punta, un pizzico per le orecchie e un pizzico di coda. Posizionare il mouse in posizione supina sull'area chirurgica e fornire il 2,5% di isoflurane utilizzando la maschera di silicone. Fornire buprenorfine a 0,1 mg/kg analgesico e applicare unguento oftalmico agli occhi.
- Rimuovere la pelliccia dal lato ventrale del collo all'addome inferiore utilizzando Nair, un'inrimozione dei capelli.
- Pulire e disinfettare il sito chirurgico utilizzando uno scrub a due passaggi con 10% povidone-iodio e 70% isopropanolo. Applicare un drappo chirurgico.
2. Procedure operative
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Esposizione dei siti di morsetto e foratura
- Preparare strumenti sterili e indossare guanti sterili per mantenere la sterilità durante l'intervento chirurgico.
- Fare un'incisione addominale midline profonda della pelle con un bisturi dal livello del bordo inferiore del fegato a appena sopra il pube. Tagliare la muscolatura con le forbici per aprire la cavità addominale.
- Inserire un retrattore nell'addome e tirare fuori le viscere sul lato destro. Tenerli umidi avvolgendo in una garza imbevuta di salina. Recupera la vescica e le vesciche seminali (nei topi maschi) e le tira verso il lato caudale. Dissezionare la mesenteria tra il retto e il retroperitoneo con un supporto micro-aghi per ottenere una visione completa dell'aorta e dell'IVC.
- Disseziona l'aorta infra-renale e l'IVC en bloc dai tessuti retroperitoneici laterali e dorsali circostanti con un supporto micro-aghi per bloccarli insieme.
- Sezionare i tessuti circostanti per esporre il sito di puntura aortica a circa tre quarti della distanza dalla vena renale sinistra alla biforcazione aortica.
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Dissezione iVC
- Il disseta tra l'IVC infrarosso e l'aorta distale immediatamente nella vena renale sinistra. Estendere il dissezione a metà strada tra la vena renale sinistra e la biforcazione aortica, in modo che l'IVC a infrarossi, sia a monte che a valle, possa essere osservato postoperatorio.
NOTA: La dissezione smussata tra l'IVC e l'aorta deve essere eseguita immediatamente dalla distale immediatamente alla vena renale sinistra dove il tessuto connettivo tra l'IVC e l'aorta è relativamente allentato. - Fare una finestra per separare l'IVC dall'aorta a quel livello e sezionare l'IVC dal tessuto circostante. Posizionare un 8-0 sutura monofilamento in poliammide prima sotto l'IVC e l'aorta (Figura 1A), quindi posizionare la sutura sotto solo l'IVC (Figura 1B) tirando l'estremità della sutura attraverso la finestra.
NOTA: Poiché l'IVC è fragile, sezionare lungo l'avventizia è utile per fare una finestra per evitare che l'IVC così come piccoli rami IVC o aortic venga danneggiati. Se si verifica un sanguinamento, è probabile che sia incontrollabile. Se l'IVC ha rami laterali distinti, posizionare un sutura distally ai rami.
- Il disseta tra l'IVC infrarosso e l'aorta distale immediatamente nella vena renale sinistra. Estendere il dissezione a metà strada tra la vena renale sinistra e la biforcazione aortica, in modo che l'IVC a infrarossi, sia a monte che a valle, possa essere osservato postoperatorio.
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Creazione AVF
- Piega un ago da 25 G ad un angolo di 45-60 gradi, in un punto di 4 mm dalla punta dell'ago.
- Bloccare l'aorta afra-renale e IVC applicando una clip microchirurgica.
- Ruotare l'aorta medialmente e caudalmente afferrando il tessuto connettivo che circonda la biforcazione per esporre il sito di puntura dell'aorta allungato leggermente al lato ventrale.
- Tenendo l'aorta in una posizione adatta, forare l'aorta nell'IVC utilizzando l'ago da 25 G preparato (Figura 1C).
- Rilasciare l'aorta e coprire il sito di foratura con il tessuto circostante che si sta acalzando dal lato sinistro dell'aorta. Estrarre l'ago e premere delicatamente il sito di puntura utilizzando un tampone con punta di cotone per l'emostasi.
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Creazione della stenosi IVC
- Posizionare una punta di un catetere da 22 G IV (vedere la Tabella deiMateriali) sull'IVC longitudinalmente. Ligate il catetere IV e IVC insieme a un sutura (Figura 1D), quindi rimuovere il catetere IV.
- Confermare l'emostasi primaria (Figura1E) e quindi sblocco l'aorta e IVC. Coprire il sito di foratura 1 min in più per garantire l'emostasi.
NOTA: Non bloccare troppo a lungo in modo da evitare la distesità trombosi IVC alla stenosi. - Riportare gli organi nelle loro posizioni originali e chiudere l'addome con 6-0 suture.
3. Procedure post-operatorie
- Dopo la chiusura della ferita addominale, interrompere l'inalazione dell'isoflurane. Mettere il mouse in una gabbia individuale senza biancheria da letto e posizionare la gabbia su un dispositivo di supporto termico per prevenire l'ipotermia.
NOTA: Il mouse viene osservato fino a quando non raggiungono e mantengono la recumbency sternale. Applicare cure post-operatorie tra cui analgesia e cura delle ferite in conformità con le raccomandazioni dell'IACUC locale. Per l'analgesia usiamo buprenorfina a 0,1 mg/kg per via intrasmuscolare ogni 12 h per 48 h seguendo le procedure chirurgiche e successivamente, se necessario. - Confermare la papotenza AVF postoperatoria utilizzando l'ecografia Doppler (vedere la Tabella dei Materiali). Inoltre, misurare altre caratteristiche del vaso e del flusso in base alle esigenze.
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Representative Results
Topi maschi hanno subito l'operazione di cui sopra per creare sia un AVF e una stenosi IVC. I topi di controllo sono stati sottoposti solo alla laparotomia e alla dissezione dei tessuti che circondano l'IVC, ad esempio, una procedura fittizia, o solo la creazione di una stenosi IVC senza la creazione simultanea di un AVF.
L'IVC è stato osservato con ultrasuoni Doppler il giorno 7 dopo la procedura chirurgica (Figura 2). Le aree di fistola e stenosi dell'IVC sono state facilmente rilevate nella vista longitudinale (Figura 2C, E). L'IVC tra la fistola e la stenosi è stato dilatato nei topi con una AVF con la stenosi. Le forme d'onda ad ultrasuoni sono state esaminate nell'IVC nel punto della stenosi (Figura 2D, F). Nei topi che portano una stenosi da solo, senza un AVF, il segmento della stenosi ha mostrato una forma d'onda venosa con un ampliamento più spettrale rispetto ai topi sham, ma senza molta pulsatilità. Tuttavia, nei topi che hanno un AVF e una stenosi, il segmento della stenosi ha mostrato una forma d'onda pulsatile oltre all'ampliamento spettrale. La velocità massima media del flusso alla stenosi nei topi che hanno un AVF con stenosi era significativamente superiore a quella dei topi che avevano solo stenosi (Tabella 1).
La modalità B a ultrasuoni Doppler è stata utilizzata nelle viste trasversali per valutare l'IVC il giorno sette dopo l'intervento chirurgico (Tabella 1). Il diametro medio di IVC alla stenosi nei topi che hanno la stenosi da solo era simile ai topi che avevano un AVF così come la stenosi (Tabella 1). La stenosi percentuale dell'IVC è stata calcolata in base al metodo NASCET12. Utilizzando come riferimento il segmento a monte o il segmento a valle, la percentuale di stenosi era significativamente maggiore nei topi con un AVF oltre alla stenosi (Tabella 1).
come illustrato nella Figura 1. Foto operative del modello murine AVF con stenosi venosa. (A) Posizionare un sutura sotto l'IVC (punte di freccia blu) e l'aorta (punte di freccia rossa) a metà strada tra la vena renale sinistra (punte di freccia gialla) e la biforcazione aortica, distagliante per eventuali grandi rami IVC se presenti. (B) Posizionare la sutura solo sotto l'IVC. (C) Dopo il bloccaggio prossimale, forare l'aorta attraverso entrambe le pareti e nell'IVC. (D) Legare una punta di un catetere da 22 G IV e l'IVC insieme alla sutura inserita. (E) Rimuovere il catetere e il cesetto. Il flusso sanguigno arterioso attraverso la stenosi di IVC può essere osservato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Risultati ecografici il giorno 7 dopo l'intervento chirurgico. In alto: immagini rappresentative di top con una procedura fittizia. (A) L'immagine in modalità B mostra IVC nella vista longitudinale. Il lato sinistro è il lato cranico. (B) Forma d'onda dell'IVC infrarosso. Middle: immagini rappresentative di topi con solo stenosi. (C) L'immagine in modalità B mostra IVC, incluso lo stenosi (asterisone giallo) nella vista longitudinale. Il lato sinistro è il lato cranico. (D) Forma d'onda nell'area della stenosi. In basso: Immagini rappresentative di topi con AVF con stenosi. (E) L'immagine in modalità B mostra IVC, tra cui fistula (asterisco bianco) e stenosi. Il lato sinistro è il lato cranico. (F) Forma d'onda nell'area della stenosi. La barra della scala bianca rappresenta 1 mm. La barra della scala gialla rappresenta 100 ms.
| stenosi f | sì | sì | Valore P |
| Avf | No | sì | |
| Velocità massima media (mm/s) | 180 del sistema | 878 84 | 0.0023 (invia in stato di inademazione) |
| Diametro stenosi (mm) | 0,62 x 0,01 | 0,63 x 0,01 | 0,3558 |
| % stenosi (upsteam) | 43% | 66% | 0,0159 |
| % stenosi (downsteam) | 42% | 56% | 0.0006 (in inglese) |
Tabella 1. Misurazione ad ultrasuoni nell'area stenosi IVC di ciascun gruppo. Le misurazioni derivate dagli ultrasuoni nell'area di stenosi IVC dei topi che hanno la stenosi da soli e topi che hanno AVF con stenosi il giorno 7 dopo l'intervento chirurgico. %stenosi (a monte) - (1 - [diametro a stenosi / diametro al segmento di riferimento a monte]) x 100%. %stenosi (a valle) - (1 - [diametro a stenosi/ diametro al segmento di riferimento a valle]) x 100%. %dilatazione (diametro nel giorno postoperatorio 7 / diametro preoperatorio allo stesso segmento) x 100%. I valori P si basano sui test t di Student, n - 4-6.
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Discussion
Il modello murine AVF è stato utilizzato per studiare i meccanismi di base e gli eventi molecolari che portano alla maturazione AVF13,14. In questo studio, abbiamo modificato un modello AVF murine stabilito per creare un nuovo modello di fistola murina aortocaval con una stenosi IVC nel tratto di deflusso della fistola. Il nostro modello di legatura è simile a diversi modelli murini descritti in precedenza che utilizzano la legatura vascolare. Un modello murino di trombosi venosa profonda è stato creato utilizzando la legatura parziale IVC con un distanziale aghi 30 G15; abbiamo usato un distanziale del catetere da 22 G IV più grande per creare una stenosi più piccola e quindi evitare l'occlusione trombotica. Un modello murino di legatura arteriosa carotide parziale è stato utilizzato per indurre il flusso disturbato, portando all'aterosclerosi16; il nostro modello ha usato allo stesso modo una legatura venosa parziale e di conseguenza ha dimostrato un flusso disturbato nell'IVC nell'area della legatura parziale.
Sono stati studiati i meccanismi alla base del fallimento della maturazione AVF causato dalla stenosi venosa della fistola. I cambiamenti emodinamici, comprese le frequenze disturbate dello stress da taglio, si sono dimostrati fattori importanti17,18. Una simulazione di fluidodinamica computazionale ha mostrato un flusso disturbato alla stenosi venosa19, anche se i modelli animali di AVF con stenosi venosa non sono stati precedentemente segnalati. Questo modello di fistula aortocaval murino modificato può essere utilizzato per studiare una AVF con stenosi venosa centrale. Il diametro IVC alla stenosi ha meno variazione e più coerenza in questo modello; legatura IVC parziale utilizzando un catetere IV aumenta la riproducibilità di questo modello. I sintomi clinici e i segni di stenosi venosa centrale spesso si sviluppano solo dopo la creazione della fistola nell'estremità ipsilaterale9. In questo modello, i topi con una stenosi IVC parziale (<50%) aveva un flusso normale ed erano asintomatici, mentre l'aggiunta di un AVF ha aumentato il grado di stenosi a un grado che potrebbe causare sintomi (>50%) (Figura 2, Tabella 1). Questi risultati imitano il fenotipo della stenosi venosa centrale; aumento del flusso venoso dovuto alla presenza della fistola può svelare l'esistenza di stenosi venosa centrale asintomatica, causando ipertensione venosa e fallimento della maturazione della fistola.
Ci sono alcuni passaggi critici e punti per migliorare il tasso di successo e la coerenza della procedura. Se l'IVC ha rami laterali distinti, un sutura è posto distasy (caudally) ai rami (Figura 1). Nel modello AVF murine originale, i rami laterali di IVC vengono in genere ignorati perché la maggiore resistenza vascolare dei rami mantiene il flusso di fistola dall'entrare nei rami. Tuttavia, se la stenosi IVC viene creata proporzionalmente a rami laterali distinti in questo modello, il flusso di fistola può fuoriuscire nei rami a causa della resistenza vascolare da parte della sutura appena posizionata. Per evitare sanguinamenti massicci, la dissezione di IVC viene avviata immediatamente in modo inferiore alla vena renale sinistra e viene estesa ulteriormente fino al punto in cui l'IVC deve essere ligate. Questo passaggio è la parte più critica di questo intervento chirurgico; sanguinamento da IVC o rami danneggiati è probabile che sia incontrollabile. Inoltre, per evitare di toccare l'IVC quando si posiziona la sutura intorno ad esso, e potenzialmente strappandolo, il 8-0 sutura è inizialmente collocato intorno sia l'IVC e l'aorta, e poi riposizionato sotto solo l'IVC. Infine, il nodo dell'8-0 la sutura viene posta sul lato dell'IVC, non direttamente anteriormente, per prevenire qualsiasi artefatto che potrebbe influenzare l'esame ecografico postoperatorio.
Una potenziale limitazione di questo studio è che la stenosi IVC in questo modello è creata dalla compressione meccanica esterna; l'infiammazione venace causata dalla sutura e dalla dissezione di IVC potrebbe potenzialmente influenzare il rimodellamento venoso nell'area della stenosi. Inoltre, la fistola in questo modello è fatta tra aorta e IVC in modo che tutto il flusso di fistola sia diretto nella stenosi di IVC, mentre la fistola creata nell'estremità superiore umana spesso consente lo sviluppo delle vene, mantenendo la stenosi asintomatica. I segni fisici della stenosi venosa centrale come l'edema distale e la formazione collaterale non sono mostrati in questo modello.
In sintesi, introduciamo un protocollo per un nuovo modello di fistola murina aortocaval con una stenosi di deflusso IVC che è facile da eseguire e riproducibile. Prevediamo che questo modello sarà utile per studiare i cambiamenti emodinamici da una stenosi venosa centrale che potrebbe influenzare la maturazione AVF.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal NATIONAL Institute of Health (NIH) degli Stati Uniti Grant R01-HL128406; il Dipartimento dei Veterani Affari Biomedico Laboratorio di ricerca e sviluppo Programma merito Review Award I01-BX002336; nonché con le risorse e l'uso di strutture presso il VA Connecticut Healthcare System, West Haven, CT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-60 Mhz scan head | VisualSonics Inc. | RMV-704 | |
| 8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle | AROSuture | T06A08N14-13 | polyamide monofilament sutures |
| Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H |
VetEquip | 941444 | |
| Isoflo, Isoflurane liquid | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Mice, C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | |
| Pet Bed Microwave Heating Pad | Snuggle Safe | 6250 | |
| PrecisionGlide Needle 25G | BD | 305122 | |
| Surflo I.V. Catheter 22G | Terumo | SR-OX2225CA | 0.85mm outer diameter |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument | RS-5424 | |
| Vevo770 High Resolution Imaging System | VisualSonics Inc. | 770 |
References
- Dember, L. M., et al. Effect of clopidogrel on early failure of arteriovenous fistulas for hemodialysis: a randomized controlled trial. JAMA. 299 (18), 2164-2171 (2008).
- Dixon, B. S. Why don't fistulas mature? Kidney International. 70 (8), 1413-1422 (2006).
- Wilmink, T., Hollingworth, L., Powers, S., Allen, C., Dasgupta, I. Natural History of Common Autologous Arteriovenous Fistulae: Consequences for Planning of Dialysis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 51 (1), 134-140 (2016).
- Al-Jaishi, A. A., et al. Patency rates of the arteriovenous fistula for hemodialysis: a systematic review and meta-analysis. American Journal of Kidney Diseases. 63 (3), 464-478 (2014).
- Rocco, M. V., Bleyer, A. J., Burkart, J. M. Utilization of inpatient and outpatient resources for the management of hemodialysis access complications. American Journal of Kidney Diseases. 28 (2), 250-256 (1996).
- Roy-Chaudhury, P., Sukhatme, V. P., Cheung, A. K. Hemodialysis vascular access dysfunction: a cellular and molecular viewpoint. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 1112-1127 (2006).
- Quencer, K. B., Arici, M. Arteriovenous Fistulas and Their Characteristic Sites of Stenosis. AJR: American Journal of Roentgenology. 205 (4), 726-734 (2015).
- Kian, K., Asif, A. Cephalic arch stenosis. Semin Dial. 21 (1), 78-82 (2008).
- Agarwal, A. K. Central vein stenosis. American Journal of Kidney Diseases. 61 (6), 1001-1015 (2013).
- Glanz, S., et al. Axillary and subclavian vein stenosis: percutaneous angioplasty. Radiology. 168 (2), 371-373 (1988).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial. Methods, patient characteristics, and progress. Stroke. 22 (6), 711-720 (1991).
- Kuwahara, G., et al. CD44 Promotes Inflammation and Extracellular Matrix Production During Arteriovenous Fistula Maturation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1147-1156 (2017).
- Protack, C. D., et al. Eph-B4 regulates adaptive venous remodeling to improve arteriovenous fistula patency. Scientific Reports. 7 (1), 15386 (2017).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. J Vis Exp. (130), (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Ene-Iordache, B., Remuzzi, A. Disturbed flow in radial-cephalic arteriovenous fistulae for haemodialysis: low and oscillating shear stress locates the sites of stenosis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (1), 358-368 (2012).
- Yamamoto, K., et al. Disturbed shear stress reduces Klf2 expression in arterial-venous fistulae in vivo. Physiological reports. 3, (2015).
- Remuzzi, A., Ene-Iordache, B. Novel paradigms for dialysis vascular access: upstream hemodynamics and vascular remodeling in dialysis access stenosis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 8 (12), 2186-2193 (2013).
