Summary
Uma fístula aortocaval foi criada puncionando a aorta infra-renal murino através de ambas as paredes na veia inferior oca e foi seguida pela criação de um stenosis em seu saída através da ligadura parcial da veia inferior oca. Este modelo reprodutível pode ser usado para estudar a estenose venosa central.
Abstract
O stenosis venoso central é uma entidade importante que contribui à falha arteriovenosa da fístula (AVF). Um modelo murino de AVF foi modificado para criar uma ligadura parcial da veia cava inferior (IVC) na saída da fístula, imitando o stenosis venoso central. Os aspectos técnicos deste modelo são introduzidos. A aorta e o IVC são expostos, seguindo uma incisão abdominal. A aorta infra-renal e o IVC são dissecados para o aperto proximal, e a aorta longe do ponto de origem é expor para a punctura. O IVC no ponto médio entre a veia renal esquerda e a bifurcação aórtica é dissecado com cuidado para coloc um 8-0 sutura o IVC. Após o aperto da aorta e da VCI, uma fav é criada perfurando a aorta infra-renal através de ambas as paredes para o IVC com uma agulha de 25 G, seguida de ligando um cateter intra-venoso (IV) de 22 G e IVC juntos. O cateter é então removido, criando uma estenose venosa reprodutível sem oclusão. A aorta e o IVC são apalpe após ter confirmado o hemostasis preliminar. Este modelo novo do stenosis da veia central é fácil de executar, reprodutível, e facilitará estudos na falha de AVF.
Introduction
As fístulas arteriovenosas (fav) são os acessos mais comuns para hemodiálise, com patência superior e infecção reduzida em comparação com outros acessos, como enxertos ou cateteres venosos centrais. No entanto, até 60% das AVF não amadurecem1,2,3; uma revisão sistemática recente relatou que as taxas preliminares do patência em 1 ano eram somente 60%4. A estenose ao longo do fluxo venoso causa predominantemente falência da maturação da fav5,6. Existem certos locais característicos propensos a estenose proximal à fístula: o segmento de balanço justaanastomose para a fístula radiocefálica, a região do arco cefálico para a fístula Braquiocefálica e a veia central para a fístula com previamente cateteresdeveia jugular interna ou subclávia ipsilateral7,8.
O stenosis venoso central é frequentemente assintomático nos pacientes sem um AVF, mas pode causar o edema ipsilateral da extremidade pela hipertensão venosa assim como a falha da maturação da fístula quando desafiado pelo fluxo9da fístula. A patofisiologia do stenosis venoso central é mais provável relacionada à inflamação e à cascata ativada da coagulação após a colocação do dispositivo. Além disso, o movimento constante da ponta do cateter, bem como o aumento do fluxo da fístula podem alterar o estresse de cisalhamento, resultando em deposição plaquetária e espessamento da parede venosa10. Para compreender os mecanismos básicos que subjacentes à falha AVF causada pelo stenosis venoso central, um modelo animal que imita o stenosis venoso central com um AVF é exigido.
Nós estabelecemos um modelo murino da fístula do aortocaval que seja fácil de executar e dominar e recapitula o curso clínico do AVF humano. 11 nós aplicamos os conceitos e a técnica de diversos modelos murino previamente estabelecidos para criar um modelo murino novo de AVF com stenosis venoso. Nós introduzimos um modelo murino do aortocaval da fístula com um stenosis de IVC na fístula do saída que pode ser usada para o estudo do stenosis venoso central.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Yale (IACUC).
1. anestesia e procedimentos pré-operatórios
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e materiais por autoclavagem. Ligue o dispositivo de suporte térmico para ter a certeza de que está quente (40 – 42 ° c).
- Coloc um rato velho de 9-11-Week C57Bl/6 em uma câmara acrílica da indução e anestesiá-la com o isoflurano vaporizado de 2,5% e o oxigênio de 0,8 L/min. A indução anestésica demora cerca de 3 min.
- Retire o rato da câmara. Confirme um plano profundo da anestesia por uma pitada do dedo do pé, por uma pitada da orelha e por uma pitada da cauda. Coloque o mouse em posição supina na área cirúrgica e entregar 2,5% isoflurano usando máscara de silicone. Fornecer buprenorfina em 0,1 mg/kg analgésico e aplicar pomada oftálmicas aos olhos.
- Retire a pele do lado ventral do pescoço para o abdômen inferior usando Nair, um removedor de pêlos.
- Limpe e desinfete o local cirúrgico usando uma esfoliação em duas etapas com 10% de iodo-povidona e 70% de isopropanol. Aplique um drapejar cirúrgico.
2. procedimentos operativos
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Exposição dos locais da braçadeira e da punctura
- Prepare instrumentos estéreis e use luvas estéreis para manter a esterilidade durante toda a cirurgia.
- Faça uma incisão abdominal profunda na pele com um bisturi a partir do nível da borda inferior do fígado para um pouco acima do púis. Corte através da musculatura com tesouras para abrir a cavidade abdominal.
- Insira um retractor no abdômen e puxe as entranhas para o lado direito. Mantenha-os húmidos envolvendo uma gaze salina encharcada. Retreive a bexiga e as vesículas seminais (em camundongos machos) e retirá-los para o lado caudal. Dissecar o mesentério entre o reto e o retroperitoneum com um suporte da micro-agulha para obter uma vista completa da aorta e do IVC.
- Dissecar a aorta infra-renal e o bloco do en de IVC dos tecidos retroperitoneal circunvizinhos laterais e dorsais com um suporte da micro-agulha para cruzá-los junto.
- Dissecar os tecidos circundantes para expor o local da punção aórtica em aproximadamente três quartos da distância da veia renal esquerda até a bifurcação aórtica.
-
Dissecção de IVC
- Dissecar entre o IVC infra-renal e a aorta imediatamente longe do ponto de origem à veia renal esquerda. Estender a dissecção distalmente ao meio caminho entre a veia renal esquerda e a bifurcação aórtica, de modo que o IVC infra-renal, ascendente e a jusante ao stenosis, possa ser observado postoperatively.
Nota: a dissecção contundente entre o IVC e a aorta deve ser realizada de imediato distal à veia renal esquerda, onde o tecido conjuntivo entre o IVC e a aorta é relativamente solto. - Faça uma janela para separar o IVC da aorta a esse nível e dissecar o IVC do tecido circundante. Coloque um 8-0 sutura do monofilamento da poliamida primeiramente abaixo do IVC e da aorta (Figura 1a), a seguir Posicione a sutura abaixo somente do IVC (Figura 1b) puxando a extremidade da sutura através da janela.
Nota: uma vez que o IVC é frágil, a dissecação ao longo da adventícia aórtica é útil para fazer uma janela para impedir que o IVC, bem como pequenas IVC ou ramos aórticos de ser danificado. Se ocorrer sangramento, é provável que seja incontrolável. Se o IVC tem filiais laterais distintas, coloque um 8-0 sutura distalmente aos ramos.
- Dissecar entre o IVC infra-renal e a aorta imediatamente longe do ponto de origem à veia renal esquerda. Estender a dissecção distalmente ao meio caminho entre a veia renal esquerda e a bifurcação aórtica, de modo que o IVC infra-renal, ascendente e a jusante ao stenosis, possa ser observado postoperatively.
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Criação de AVF
- Dobre uma agulha de 25 G para um ângulo de 45 – 60 ° em um ponto ~ 4 mm da ponta da agulha.
- Prenda a aorta infra-renal e o IVC aplicando um grampo microsurgical.
- Gire a aorta medialmente e caudalmente agarrando o tecido conjuntivo em torno da bifurcação para expor o local de punção da aorta esticou-o ligeiramente para o lado ventral.
- Segurando a aorta em uma posição apropriada, perfure através da aorta no IVC usando a agulha preparada de 25 G (Figura 1C).
- Libere a aorta e cubra o local da punção com o tecido circundante puxando do lado esquerdo da aorta. Retire a agulha e pressione o local da punção suavemente usando um cotonete com ponta de algodão para hemostasia.
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Criação da estenose do IVC
- Coloque uma ponta de um cateter de 22 G IV (veja a tabela de materiais) no IVC longitudinalmente. Ligate o cateter IV e o IVC junto com um 8-0 sutura (Figura 1D) e, em seguida, retire o cateter IV.
- Confirme a hemostasia primária (Figura 1e) e depois Desaperte a aorta e o IVC. Cubra o local da punctura 1 minuto mais para assegurar o hemostasis.
Nota: não prenda por muito tempo para evitar trombose de VCI distal à estenose. - Retorne órgãos a suas posições originais e feche o abdômen com 6-0 suturas.
3. procedimentos pós-operatórios
- Após o fechamento da ferida abdominal, interrompa a inalação de isoflurano. Põr o rato em uma gaiola cama-livre individual e coloc a gaiola em um dispositivo térmico da sustentação para impedir a hipotermia.
Nota: o rato é observado até atingir e manter a recumbência esternal. Aplique cuidados pós-operatórios, incluindo analgesia e tratamento de feridas, de acordo com as recomendações do IACUC local. Para analgesia utilizamos buprenorfina a 0,1 mg/kg intrasmuscularmente a cada 12 h por 48 h após os procedimentos cirúrgicos e, posteriormente, conforme necessário. - Confirme o patência de AVF postoperatively usando o ultra-som de Doppler (veja a tabela dos materiais). Além disso, meça outras características da embarcação e do fluxo conforme necessário.
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Representative Results
Os ratos machos submeteram-se à operação mencionada acima para criar um AVF e um stenosis de IVC. Os ratos do controle submeteram-se somente à laparotomia e à dissecção dos tecidos que cercam o IVC, por exemplo, um procedimento Sham, ou somente a criação de um stenosis de IVC sem criação simultânea de um AVF.
O IVC foi observado com ultrassonografia Doppler no 7º dia após o procedimento cirúrgico (Figura 2). As áreas de fístula e estenose do IVC foram facilmente detectadas na visão longitudinal (Figura 2C, e). O IVC entre a fístula e o stenosis foi dilatado nos ratos que têm um AVF com o stenosis. As formas de onda ultrassonográficas foram examinadas no IVC no ponto da estenose (Figura 2D, F). Em camundongos portadores de uma estenose isolada, sem AVF, o segmento de estenose mostrou uma forma de onda venosa com maior ampliação espectral do que os camundongos operados por Sham, mas sem muita pulsatilidade. No entanto, em camundongos com AVF, bem como uma estenose, o segmento de estenose mostrou uma forma de onda pulsátil, além de ampliação espectral. A velocidade máxima média de tempo do fluxo na estenose em camundongos com AVF com estenose foi significativamente maior que os camundongos com estenose isolada (tabela 1).
O modo de ultrassonografia Doppler B foi utilizado em vistas transversais para avaliar o IVC no sétimo dia após a cirurgia (tabela 1). O diâmetro médio da VCI na estenose em camundongos com estenose isolada foi semelhante aos camundongos que possuíam uma fav bem como a estenose (tabela 1). O percentual de estenose do IVC foi calculado de acordo com o método NASCET12. Usando o segmento upstream ou o segmento downstream como referência, a porcentagem de estenose foi significativamente maior em camundongos com AVF, além da estenose (tabela 1).
Figura 1. Fotos operativas do modelo murino de AVF com stenosis venoso. (A) Coloque um 8-0 sutura abaixo do IVC (pontas de seta azuis) e da aorta (pontas de seta vermelhas) a meio caminho entre a veia renal esquerda (pontas de seta amarelas) e a bifurcação aórtica, distalmente a todas as grandes filiais de IVC se atual. (B) coloc a sutura abaixo do IVC somente. (C) após o aperto proximal, perfure a aorta através das paredes e no IVC. (D) amarre uma ponta de um cateter de 22 G IV e o IVC junto com a sutura coloc. (E) Retire o cateter e desaperte. O fluxo sanguíneo arterial através da estenose do IVC pode ser observado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resultados do ultra-som no dia 7 após o procedimento cirúrgico. Top: imagens representativas de camundongos com um procedimento simulado. (A) a imagem do modo B mostra IVC na vista longitudinal. O lado esquerdo é o lado craniano. (B) forma de onda do infrarrenal IVC. Médio: imagens representativas de camundongos com estenose isolada. (C) a imagem do modo B mostra IVC incluindo a estenose (asterisco amarelo) na vista longitudinal. O lado esquerdo é o lado craniano. (D) forma de onda na área da estenose. Bottom: imagens representativas de camundongos com AVF com estenose. (E) a imagem do modo B mostra IVC incluindo fístula (asterisco branco) e estenose. O lado esquerdo é o lado craniano. (F) forma de onda na área da estenose. A barra de escala branca representa 1 mm. barra de escala amarela representa 100 ms. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Estenose | Sim | Sim | Valor de P |
| Fav | Não | Sim | |
| Velocidade máxima média do tempo (mm/s) | 180 | 878 | 0, 23 |
| Diâmetro do stenosis (milímetro) | 0,62 ± 0, 1 | 0,63 ± 0, 1 | 0,3558 |
| % de estenose (upsteam) | 43% de | 66% de | 0, 159 |
| % de estenose (downsteam) | 42% de | 56% de | 0, 6 |
Tabela 1. Medida do ultra-som na área do stenosis de IVC de cada grupo. As medidas derivadas do ultra-som na área do stenosis de IVC dos ratos que têm o stenosis sozinho e os ratos que têm o AVF com stenosis no dia 7 após a cirurgia. % estenose (upstream) = (1-[diâmetro na estenose/diâmetro no segmento de referência upstream]) x 100%. % estenose (downstream) = (1-[diâmetro na estenose/diâmetro no segmento de referência a jusante]) x 100%. % de dilatação = (diâmetro no dia pós-operatório 7/diâmetro pré-operatório no mesmo segmento) x 100%. Os valores de P são baseados nos testes t de Student, n = 4-6.
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Discussion
O modelo murino AVF tem sido utilizado para estudar os mecanismos básicos e eventos moleculares que levam à maturação da fav13,14. Neste estudo, nós modificamos um modelo murino estabelecido de AVF para criar um modelo murino novo da fístula do aortocaval com um stenosis de IVC no intervalo da saída da fístula. Nosso modelo da ligadura é similar a diversos modelos murino previamente descritos que usam a ligadura vascular. Um modelo murino de trombose venosa profunda foi criado utilizando-se ligadura de IVC parcial com espaçador de agulha de 30 G15; Nós usamos um espaçador maior do cateter de 22 G IV para criar um stenosis menor e assim para evitar a oclusão thrombotic. Um modelo murino de ligadura da artéria carotídea parcial foi utilizado para induzir o fluxo perturbado, levando à aterosclerose16; nosso modelo usou similarmente uma ligadura venosa parcial e conformemente demonstrou o fluxo perturbado no IVC na área da ligadura parcial.
Mecanismos subjacentes à falha de maturação da fav causada por estenose venosa de fístula têm sido estudados. As alterações hemodinâmicas, incluindo as freqüências perturbadas de estresse de cisalhamento,mostraram-se fatores importantes 17,18. Uma simulação computacional da dinâmica fluida mostrou o fluxo perturbado no stenosis venoso19, embora os modelos animais de AVF com stenosis venoso não tenham sido relatados previamente. Este modelo murino modificado da fístula do aortocaval pode ser usado para estudar um AVF com stenosis venoso central. O diâmetro do IVC na estenose tem menor variação e maior consistência nesse modelo; a ligadura parcial de IVC usando um cateter IV aumenta a reprodutibilidade deste modelo. Os sintomas e os sinais clínicos do stenosis da veia central desenvolvem frequentemente somente após a criação da fístula na extremidade ipsilateral9. Neste modelo, camundongos com estenose parcial de VCI (< 50%) apresentaram fluxo normal e foram assintomáticos, enquanto a adição de uma fav aumentou o grau de estenose em um grau que poderia causar sintomas (> 50%) (Figura 2, tabela 1). Estes resultados imitam o phenotype do stenosis central da veia; o aumento do fluxo venoso devido à presença da fístula pode revelar a existência de estenose da veia central assintomática, causando hipertensão venosa e falência da maturação da fístula.
Existem algumas etapas críticas e pontos para melhorar a taxa de sucesso e a consistência do procedimento. Se o IVC tem filiais laterais distintas, um 8-0 a sutura é colocada distalmente (caudally) nas ramificações (Figura 1). No modelo original de AVF murino, as filiais laterais de IVC são ignoradas tipicamente porque a resistência vascular mais elevada dos ramos mantem o fluxo da fístula de entrar nos ramos. No entanto, se a estenose da VCI é criada proximalmente para distintos ramos laterais neste modelo, o fluxo de fístula pode escapar para os ramos devido à resistência vascular pela sutura recém-colocada. Para evitar o sangramento maciço, a dissecção de IVC é começada imediatamente inferiormente à veia renal esquerda e é estendida mais inferiormente ao ponto onde o IVC deve ser ligated. Esta etapa é a parte mais crítica desta cirurgia; o sangramento de IVC ou de filiais danificados é provável ser incontrolável. Além disso, para evitar tocar o IVC ao colocar a sutura em torno dele, e potencialmente rasgando-o, o 8-0 a sutura é coloc inicialmente em torno do IVC e da aorta, e reposicionada então abaixo somente do IVC. Por último, o nó do 8-0 a sutura é coloc no lado do IVC, não diretamente anterior, para impedir todo o artefato que poderia afetar a examinação postoperative do ultra-som.
Uma limitação potencial deste estudo é que a estenose do IVC neste modelo é criada por compressão mecânica externa; a inflamação adventitial causada pela sutura e pela dissecção de IVC poderia potencialmente afetar o remodelamento venoso na área do stenosis. Além, a fístula neste modelo é feita entre a aorta e o IVC de modo que todo o fluxo da fístula esteja dirigido no stenosis de IVC, visto que a fístula criada na extremidade superior humana permite frequentemente as veias colaterais se desenvolver, mantendo o stenosis assintomático. Sinais físicos de estenose venosa central, como edema distal e formação colateral, não são mostrados neste modelo.
Em resumo, nós introduzimos um protocolo para um modelo murino novo da fístula do aortocaval com um stenosis do saída de IVC que seja fácil de executar e reprodutível. Espera-se que este modelo seja útil para estudar as alterações hemodinâmicas por uma estenose venosa central que possa afetar a maturação da fav.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde dos EUA (NIH) Grant R01-HL128406; o departamento de Estados Unidos da Veterans Affairs laboratório biomédico pesquisa e desenvolvimento programa mérito Review Award I01-BX002336; bem como com os recursos e o uso de instalações no VA Connecticut Healthcare System, West Haven, CT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-60 Mhz scan head | VisualSonics Inc. | RMV-704 | |
| 8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle | AROSuture | T06A08N14-13 | polyamide monofilament sutures |
| Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H |
VetEquip | 941444 | |
| Isoflo, Isoflurane liquid | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Mice, C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | |
| Pet Bed Microwave Heating Pad | Snuggle Safe | 6250 | |
| PrecisionGlide Needle 25G | BD | 305122 | |
| Surflo I.V. Catheter 22G | Terumo | SR-OX2225CA | 0.85mm outer diameter |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument | RS-5424 | |
| Vevo770 High Resolution Imaging System | VisualSonics Inc. | 770 |
References
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