Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdere mobilnettet immunforsvaret frukt fly, Drosophila melanogaster, bruke i Vivo fagocytose analysen

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

Denne protokollen beskriver i vivo fagocytose analysen voksen Drosophila melanogaster å kvantifisere phagocyte anerkjennelse og rydding av mikrobielle infeksjoner.

Abstract

I alle dyr gir medfødt immunitet en umiddelbar og robust forsvar mot et bredt spekter av patogener. Humoral og cellulær immunreaksjoner er de viktigste grenene av medfødt immunitet, og mange av faktorene som regulerer disse svarene er evolutionarily konservert mellom dyr og pattedyr. Fagocytose, den sentrale delen av mobilnettet medfødt immunitet, utføres av spesialiserte blod celler i immunsystemet. Frukt fly, Drosophila melanogaster, har dukket opp som en kraftig genetisk modell å undersøke molekylære mekanismer og fysiologiske virkningene av fagocytose i hele dyr. Her viser vi en injeksjon-basert i vivo fagocytose analysen for å kvantifisere partikkel opptak og ødeleggelse av Drosophila blodlegemer, hemocytes. Prosedyren kan forskere å kontrollere nøyaktig partikkel konsentrasjonen og dose, gjør det mulig å oppnå svært reproduserbar resultater på kort tid. Eksperimentet er kvantitative, enkel å utføre, og kan brukes til skjermen for vert faktorer som innflytelse patogen anerkjennelse, opptak og klarering.

Introduction

Medfødte immunforsvar danner den første linjen i forsvaret mot sykdomsfremkallende mikrober. Disse svarene kan være funksjonelt delt i humoral og cellulær medfødt immunitet, begge er formidlet av germline-kodet mønster anerkjennelse reseptorer (PRRs) som forstand patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs)1. Mange av signalveier og effektor mekanismer av medfødt immunitet er bevart i pattedyr og evertebrater som Rundormer, Caenorhabditis elegans, og frukt fly, Drosophila melanogaster2. Frukt fly har dukket opp som et kraftig system å studere vert forsvar mot smittsomme mikroorganismer3. Drosophila er genetisk medgjørlig, lett og rimelig oppdratt i laboratorier, og har en kort generasjonstid. Videre utstillinger frukt fly svært effektiv forsvar mot en rekke mikrober, aktivere undersøkelse av verten immunitet mot viral, bakteriell, fungal eller parasittiske patogener.

Drosophila immunologists historisk har utnyttet frem genetisk skjermer, genomet hele RNA-mediert forstyrrelser (RNAi) screening av insekt cellelinjer, og eksisterende mutant fly stammer for å undersøke medfødt immunitet-fører til den identifikasjon og karakterisering av flere evolusjonært bevarte humoral immun trasé4,5,6,7,8. Humoral medfødte immunforsvaret er, uten tvil, best preget immunforsvar forsvar i frukt fluer. Etter infeksjon fører humoral respons til produksjon og systemisk utgivelsen av antimikrobielle peptid (AMP) molekyler i hemolymph, blod tilsvarende i insekter. Forsterkere produseres av høyt konservert Toll og Imd signalnettverk trasé. Toll veien er homologe til pattedyr TLR/IL-1R reseptor signalering Imd veien er homologe til pattedyr Tumor nekrose faktor-alfa signalering. I Drosophila, Toll signalnettverk er indusert av gram-positive bakterier, sopp og Drosophila X virus6,9,10 og Imd signalnettverk er indusert av gram-negative bakterier11 ,12.

Cellulære immunitet, består av innkapsling, melanization og fagocytose invasiv patogener, utført av spesialiserte blodlegemer kalt hemocytes13. Det er tre klasser av hemocytes i frukt fly: krystall celler, lamellocytes og plasmatocytes13. Krystall celler, som utgjør 5% av sirkulerende hemocytes i larver, slipper proPhenoloxidase (forslag) enzymer fører til melanization av patogener og vert vev på såret nettsteder. Lamellocytes, som ikke normalt finnes i friske befruktede egg eller larver, er tilhenger celler som innkapsler fremmedlegemer. Disse cellene er indusert pupariation eller når parasitizing veps egg er avsatt i larver. Phagocytic plasmatocytes, som utgjør 95% av sirkulerende hemocytes i larver og alle gjenværende hemocytes i voksne, spille en rolle i vev remodeling under utvikling og, spesielt, fungere som den viktigste effektor cellen i Drosophila cellulære immunitet.

Fagocytose en umiddelbar og avgjørende linje av medfødte immunforsvaret forsvar; mikrober som bryter vert epithelial barrieren er raskt oppslukt og eliminert phagocytic blodceller (For en omfattende gjennomgang av cellebiologi på fagocytose se referanse 14). Denne prosessen er igangsatt når germline-kodet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) på hemocytes gjenkjenne patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs) av mikrober. Når bundet til sine mål, starte PRRs signalnettverk cascades som fører til dannelsen av eukaryotene gjennom begrepsordbok cytoskjelett remodeling. Eukaryotene omgir mikrobe, som senere oppslukt og internalisert i en begynnende organeller, phagosome. Mikrober er ødelagt som phagosome gjennomgår prosessen med phagosome modning når phagosome smugles mot indre av hemocyte og Forsurer gjennom en rekke interaksjon med lysosomer. I vitro og celle har biologi studier i primære pattedyrceller vært medvirkende i identifisere og karakteriserer faktorer som regulerer fagocytose, som pattedyr Fc-gamma reseptor og C3b reseptorer15,16. Likevel muligheten til å kjøre store skjermer eller i vivo studier er begrenset i pattedyr systemer.

Her presenterer vi en i vivo analysen for fagocytose i voksen frukt fluer, som er basert på en prosedyre først introdusert av laboratoriet av David Schneider i 200017. Schneider laboratoriet viste at fastsittende hemocytes gruppert langs abdominal dorsal fartøyet lett phagocytose polystyren perler og bakterier. For å visualisere fagocytose, fluer er injisert med fluorescently merket partikler (som E. coli merket med fluorescein isothiocyanate (E. coli -FITC)), ruges i 30 minutter for å gi hemocytes tid til å sluke partikler, og deretter injisert med trypan blå som slukker fluorescens partikler ikke phagocytosed under inkubasjonstiden. Fly dorsal fartøy er da fotografert med en invertert fluorescerende mikroskop. Denne banebrytende papir, bruker et relativt enkelt eksperiment, viste at hemocytes phagocytose bakterier og latex perler, som bakteriell fagocytose kan bli hemmet av pre sprøytebruk flyr med latex perler, og som flyr uten både cellulære og humorale immunreaksjoner er utsatt til E. coli. Analysen presentert i denne rapporten bygger på arbeidet til Schneider lab å kvantifisere i vivo fagocytose ved å måle fluorescens intensiteten av partikler omsluttet av dorsal fartøyet tilknyttet hemocytes.

Lik tilnærming tatt i pattedyr systemer, Drosophila Genetikere opprinnelig brukt genomet hele i vitro RNAi skjermer for å identifisere tilblivelse kreves for mobilnettet immunforsvaret18,19,20 ,21,22,23. Men aktivert utviklingen av voksen i vivo fagocytose analysen oppfølgingseksperimenter utføres lett i hele dyr, slik at forskere til å kontrollere biologiske faktorer i in vitro studier rollen. Slik var tilfellet med transmembrane reseptoren Eater, som ble først identifisert som en bakteriell reseptor i en RNAi skjermen bruker S2 celler24 og deretter vist å megle Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, og gule stafylokokker (S. aureus) fagocytose voksne25.

Våre lab ansatt i vivo fagocytose analysen i fremover genetisk skjermer og genom hele association studier (med Drosophila genetisk referanse Panel (DGRP)) til å identifisere romanen gener som regulerer fagocytose i voksen hemocytes. Disse studiene førte til karakterisering receptors PGRP-SC1A og PGRP-SA26, intracellulær vesicle menneskehandel protein Rab1427, glutamat transporter Polyfemos28og RNA-bindende protein Fox-129.

Vi forventer at fremtidige skjermer innlemme det i vivo fagocytose kan føre til identifisering av flere gener som er viktige for mobilnettet immunforsvaret i Drosophila. Skjermer med fullt sekvensielt innavlet linjer, som DGRP eller Drosophila syntetiske befolkningen ressurs (DSPR), kan identifisere naturlig varianter påvirker fagocytose eller hemocyte utvikling. Videre kan teknikken være vedtatt i andre arter av Drosophila eller brukes til skjermen nye-ressurser, som samlingen av 250 Drosophila arter vedlikeholdes av den nasjonale Drosophila arter lager Center (NDSSC ) ved Cornell. Disse eksperimentene kan utføres ved hjelp av fluorescently-merket bakterielle eller sopp-vegg bioparticles som er tilgjengelig kommersielt eller kan utføres ved hjelp av en rekke bakterier og sopp arter-forutsatt at mikrobe uttrykker fluorescerende markører .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargjør Fluorescein partikler for injeksjon

  1. Rekonstituer 10 mg av kommersielt tilgjengelig, varme-drepte bakterier partikler merket med fluorescein (se Tabell of Materials) til en lager konsentrasjon av 10 mg/mL ved å legge 990 µL sterilt 1 x PBS og 10 µL 50 mM Natriumazid. Vortex å blande.
    1. Del i engangs 8 µL dele i 0,2 mL rør og lagre i en mørk boks 4 ° C å minimere tilknyttet lysfølsomhet.
      Merk: Natriumazid konserveringsmiddel er valgfri og kan utelates hvis 10 mg/mL aksjer er laget med 1 mL steril 1 x PBS, aliquoted og lagret på 20 ° C.
  2. Lage en 10 mL løsning av 5% konditorfarge i 1 x PBS ved å blande 500 µL sprøyte filtrert grønne food coloring og 9,5 mL steril 1 x PBS.
  3. Vask partikler før injeksjon fjerne Natriumazid. Mix 42 µL sterilt 1 x PBS og 8 µL av 10 mg/mL i en 1,7 mL tube. Sentrifuge på maks fart for 2,5 min ved romtemperatur.
    1. Fjern nedbryting, Legg 50 µL 1 x PBS og sentrifuger på maks fart for 2,5 min ved romtemperatur.
    2. Gjenta trinn 1.3 og 1.3.1 2 x, for totalt 3 vasker.
    3. Etter siste vask, forkaste nedbryting og å suspendere partikler til 1,6 mg/mL i 50 µL av 5% konditorfarge i 1 x PBS.
    4. Pakk røret i aluminiumsfolie å beskytte mot lyset. Lagre på 4 ° C, kaste etter 1 uke.

2. Forbered injeksjon stasjonen og fluer

  1. Forberede injeksjon puten. For å injisere opptil 4 genotyper fluer på samme tid, bruk laboratorium tape til å dele en rektangulær CO2 fly pad i 4 seksjoner. På benken i mikroskopet, angi områder å plassere hetteglass når fluene har vært stilt opp på puten (ett for hvert hjørne på puten).
  2. Forberede ampuller av alder-passet, 4-7 dager-gamle, flyr for injeksjon. For hver stamme skal testes, overføre 5 menn og 5 kvinner til friske, merket ampuller med forberedt fly mat og holde på 25 ° C.
  3. Forberede pneumatiske injektoren (se Tabell for materiale) ved å sette apparatet til en 100 ms (korte støt av gasstrykk å utvise væske-tillate levering av sub-nanoliter volumer) tidsinnstilt modus.
  4. Forberede objektglass. Klippe 1.5-tommen strimler av elektriske tape, kaste i en løkke med den selvklebende siden ut og plassere på en merket microscope skyve.

3. forberedelse glass kapillær nåler

  1. Trekk glass nåler (tynn vegg glass kapillærene) bruker en nål avtrekker.
    1. Hold nålen under mikroskop med en mikrometer og bryte spissen ved hjelp av #5 fin spiss rustfritt stål pinsett. 100 µm tips er tilstrekkelig til å pierce fly's cuticle samtidig minimere såret.
    2. Måle volumet av væske som blir sprøytet inn hvert fly. Laste inn nålen med sterilt 5% konditorfarge i 1 x PBS og utvise væske på en dråpe av mineralolje på en 0,01 mm scenen mikrometer.
      Merk: Hvis flytende slippverktøyet sfærisk, volumet i picoliters er beregnet som (størrelse)3/1910. 30 en nål 100 µm diameter utløses ~ 2 nL i 100 ms.

4. injisere fluer

  1. Pipetter 10 µL av 1.6 mg/mL partikler på en liten firkant med parafilm.
    1. Trekke væsken inn nålen og montere i injektor munnstykket (se Tabell for materiale).
    2. Bedøve fluer med CO2 og ordner dem i deres bestemt område på flypad, med den ventral siden opp og hodene orientert mot fronten av puten. Plasser ampuller i tilsvarende områder på benken.
    3. Injisere fluer i øvre hjørne i magen med 5, 100 ms pumper væske (~ 10 nL totalt).
    4. Overføre de injiserte flyr til riktig hetteglass, Merk tiden på ampullen. Holde på 25 ° C.
  2. Laste inn en ny nål med 0,4% Trypan blå løsning.
  3. Angi pneumatisk injektoren GATED, som gir en konstant flyt av luft å presse væske ut av nålen.
  4. Bedøve fluer når de har hvilt i 30 min og injisere med Trypan blå til magen er full og distended.
    Merk: Når undersøke phagosome modning med partikler merket med en pH-sensitive fargestoff, lar fluer hvile 1t og injisere ikke med trypan blå før montering fluer.
  5. Montere fluer på objektglass med elektriske tape, ventral side ned. Skyv vingene ved siden av fly og sikre dem på båndet. Også, skyv hodet inn båndet slik at fly ikke vil flytte.
  6. Umiddelbart gå til trinn 5.

5. imaging fluer

  1. Bildet flyr, en om gangen, på 25 x eller 32 x forstørrelse med en invertert fluorescens mikroskop knyttet til en digital kameraet og datamaskinen (se Tabell for materiale). Fokus på dorsal fartøyet av bruke programvare for digitalkameraet.
  2. Registrere eksponeringstid og forstørrelsen mellom eksperimenter.
    Merk: Mister sporet av genotyper er en potensiell feilkilde Når fotografere flere stammer i en enkelt sittende. For å unngå mislabeling fluer, bør du notere antall bilde av første og siste fly fotografiet for hver genotype.

6. kvantifisering og normalisere fluorescensen

  1. Åpne programvaren og åpne ett bilde om gangen.
    1. Måle fluorescens intensiteten av dorsal fartøyet. Tegne en polygon rundt dorsal fartøyet. Velg mål og registrere fluorescens intensiteten i polygonet.
    2. Bestemme bakgrunn fluorescens intensiteten. Kopier den første polygonen og flytter det til en tilstøtende dorsal fartøyet fly. Velg mål og fortegnelse fluorescens intensitet bakgrunnsområdet.
    3. Normalisere dorsal fartøyet fluorescens av bakgrunnen fluorescens:
      Dorsal fartøyet ÷ bakgrunn.
    4. Beregn gjennomsnittet normalisert dorsal fartøyet fluorescens intensiteten av alle fluer i en belastning.
    5. Gjenta eksperimentet 2 ganger.
    6. Bruk en Student er unpaired t-testen til å sammenligne mener relative fluorescens intensiteten av kontroll fluer og teste flyr fra tre eksperimenter. Beregne effekten størrelsen ved hjelp av formelen: Cohen d = (M1- M2) ÷ SDgruppert, der M1 er gjennomsnittet av genotype 1 og M2 er gjennomsnittet av genotype 2 &
      SD grupperte =Equation
      hvor SD1 er standardavviket for genotype 1 og SD2 er standardavviket for genotype 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk av i vivo fagocytose analysen ved hjelp av fluorescein-merket partikler vises i figur 1A. Fluene er montert ventral side ned på et stykke elektriske tape og de to første delene av magen, der dorsal fartøyet ligger, er synlig (figur 1B). Sentrale kilder for eksperimentell feil oppstå ved injeksjon og tenkelig trinnene av fremgangsmåten (figur 1 c). Bruker samme p for å injisere flere fluer føre til bli tett med fly vev eller partikler (øverste venstre panel i figur 1 c). Fordi Drosophila auto-fluoresces under GFP lys, fluer injisert med tettning i kanylen fluoresce svakt men mangler den klare, vises punctate fluorescensen partikler internalisert hemocytes. En annen potensiell feilkilde eksperimentelle kan oppstå under Trypan blå injeksjoner. Tretti minutter etter første injeksjon med fluorescently-merket partikler, får fluer en andre injeksjon med Trypan blå slukker fluorescens ekstracellulære, un phagocytosed partikler. Relativ fluorescens intensitet for hvert fly beregnes ved å dele fluorescens av dorsal fartøyet av et like store tilstøtende område på magen. Fluer som ikke får nok Trypan blå fluoresce lyst gjennom deres hele magen (nedre venstre panel i figur 1 c). Denne lyse fluorescens kan redusere forholdet mellom dorsal fartøyet til bakgrunnen fluorescens, dermed redusere sant fluorescens intensitet forholdet av dyret. Til slutt, fluer skal fotograferes mens immobilisert av CO2, som flytte aktivt flyr produsere uskarpe bilder som ikke kan kvantifiseres (topp og bunn, høyre paneler med figur 1 c).

Samlingen Zuker er et panel av ethyl methanesulfonate (EMS) behandlet flyr autosomalt mutasjoner. 31 opprinnelig etablert som et fellesskap ressurs i 2004, har linjene blitt brukt til å utføre revers genetisk skjermer. Våre lab identifisert en linje fra den Zuker samlingen som ikke kan phagocytose gram-negative (E. coli K-12 belastning) og gram-positive bakteriene (S. aureus tre belastning uten protein A) (figur 2). Denne mutant, kalt argus, viser nesten ingen dorsal fartøyet fluorescens i i vivo fagocytose analysen. Sammenlignet med Zuker isogenic bakgrunn belastningen, cn bw, argus viser betydelig mindre opptak av E. coli (p-verdi = 0.019; Cohens d = 1.677) og S. aureus (p-verdi = 0.0083; Cohens d = 1 672 innbyggere). Argus bakteriell fagocytose er også betydelig svekket, E. coli (p-verdi = 0,045; Cohens d = 0.850) og S. aureus (p-verdi = 0.0136; Cohens d = 1.422) sammenlignet med en vanlig laboratoriet kontroll belastning, Canton-S.

Figure 1
Figur 1: Oversikt og representant bilder i vivo fagocytose analysen. A. skjematisk av i vivo fagocytose analysen ved hjelp av fluorescein-merket partikler. To injeksjoner, 30 minutter fra hverandre, brukes visualisert partikkel anerkjennelse og opptak av dorsal fartøy-assosiert blod celler. B. hvitt lys bilde viser en flue montert på tape, med tydelig fremre abdominal segmenter. C. eksempel vivo fagocytose bilder. (øverst til venstre) En flue injisert med tettning i kanylen har ingen partikkel fluorescens. (venstre) Et fly med høy ekstracellulære fluorescens på grunn av utilstrekkelige trypan blå. (øverst til høyre) En immobilize fly med ingen ekstracellulære fluorescens-perfekt bilde. (nederst til høyre) Fly glidende skaper som CO2 anestesi slites av en sløret image. Skala bar, 0.2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Fagocytose bakterier mutant og kontroll flyr. A. representant bilder av fagocytose bakterier merket med fluorescein farge; E. coli (topp panel) og S. aureus (bunnen panel). B. fluorescens intensitet forholdet mellom flyr injisert med fluorescein -E. coli partikler. C. fluorescens intensitet forholdet mellom flyr injisert med fluorescein -S. aureus partikler. n = 3 eksperimenter for hver bakterier, med 6-8 fluer per forsøk. Feilfelt, ± SEM. statistisk analyse = tosidige t -test. Skala bar, 0.2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kommersielt tilgjengelig, fluorescently merket, brukes til å vurdere fagocytose generelt (0,2 µm carboxylate endret mikrosfærer) eller fagocytose av mikrober (fluorescently merket varme - eller kjemisk drepte bakterier eller gjær). For å vurdere phagosome modning, kan forskere velge partikler merket med en pH-sensitive fargestoff som fluoresces når pH reduseres fra nøytrale til surt, som i phagolysosome. Også for å undersøke de første stegene fagocytose, patogen anerkjennelse og opptak, bør forskere velge partikler merket med fluorescerende koder som fluoresce i og utenfor celler.

Nøye kontrollert eksperimentelle forhold er nøkkelen til å sikre i vivo fagocytose analysen utføres i en reproduserbar måte. Først gjennomgår Drosophila mobilnettet immunosenescence32, så fluer i eksperimentet bør være alder-passet, optimalt innenfor en 4-7 dager gamle. Andre bør perioden mellom injeksjoner være konsekvent. Fagocytose skjer raskt, bare minutter fra verten cellen sensing mikrobe14. Over den neste timen, phagosome modningen foregår, fører til forsuring av phagosome og ødeleggelse av internalisert mikrobe. Angi en angitt intervall vente mellom injeksjoner reduserer eksperimentelle variasjon og lar sammenligninger mellom stammer og eksperimenter utført på forskjellige dager. Vi anbefaler at du venter tretti minutter når benytter fluorescein partikler og en time for i vivo phagosome modning analysen med partikler merket med pH-sensitive fluorescerende farge.

Bruker samme p for å injisere flere stammer sikrer at alle fluer får den samme dosen av partikler og eksperimentell variasjoner kan oppstå hvis glass nåler pause eller bli tett. Så, konfigurere injeksjon stasjon og flyr på forhånd er nøkkelen til å sikre at i vivo fagocytose analysen utføres raskt og effektivt. Før du starter eksperimentet, måle volumet av væske utvist av flere nåler og beholde en rekke nåler av samme størrelse. Dermed, hvis en nål bryter mellom injeksjoner, kan den erstattes umiddelbart. Videre tette nåler kan føre til falske negative resultater, gjør det vanskelig å skille mellom fluer som hemocytes ikke klarer å phagocytose mikrober og fluene som ikke mottok fluorescerende partikler. Fargestoff løsninger med grønn konditorfarge, gjør det enklere å spore som flyr er blitt injisert og identifisere problemer med tette nåler. Ideelt sett eksperimentet skal utføres flere ganger, med minst 6-8 fluer per belastning i hvert eksperiment, og resultatene av eksperimentene sammenlignet identifisere outliers. Til slutt, bør nok Trypan blå administreres å fullt slukke fluorescens ekstracellulære partikler slik at bakgrunnen fluorescens sammenlignes mellom fluer (figur 1 c).

Når imaging fluer, må også utvises forsiktighet å få klar, konsekvent bilder av dorsal fartøyet. Svart elektrisk tape brukes til å opprette en mørk bakgrunn og fluer bør være montert ventral side ned, med sine vinger og hoder festet til den selvklebende siden av båndet. Hvis mulig, bør fluer forbli immobilisert under CO2 mens tas. Til slutt, for å begrense muligheten for eksperimentell bias, anbefaler vi bruker en blendet eksperimentelle oppsett; hvor ampuller og stammer er kodet av en forsker og eksperimentet er utført og kvantifisert ved en annen forsker.

I vivo fagocytose analysen er en nyttig verktøyet å identifisere globale defekter i fagocytose. Imidlertid, den ikke skiller mellom hemocyte fagocytose effektivitet og forskjeller i hemocyte tall eller sted, på grunn av alder-relaterte nedgang eller utviklingsmessige defekter. 32 videre prosedyren gir ikke informasjon om forskjellene i størrelse eller phagocytic kapasitet på individuelle hemocytes. Dermed når fluer med redusert fagocytose identifisert med i vivo fagocytose analysen, skal forskere utføre oppfølgingsstudier, kanskje bruke alternative partikler, for å skille mellom immun-relaterte fagocytose defekter og generelt phagocytic defekter. Til slutt krever bestemmer molekylære mekanismer underlie phagocytic defekter i mutant stammer en undersøkelse av fagocytose i én hemocytes. Dette kan være dyktig med, for eksempel, AC confocal mikroskopi, fluorescens aktivert celle sortering eller magnetiske perle isolering av voksen hemocytes27,28,29,32,33 , 34.

Samlet Drosophila har vist seg for å være en effektiv modell å studere medfødt immunitet i levende dyr. Her har vi gitt en oversikt over i vivo fagocytose analysen, en metode for å studere det globale fagocytose og mobilnettet immunforsvaret i voksen fluer. Prosedyren kan brukes til skjermen for nye gener som kan være viktige for vert forsvar, validere gener i stor skala i vitro RNAi skjermer og ytterligere karakterisere mutanter med defekter i humoral, gut eller antivirale immunreaksjoner. Det er lett å sette opp og kan gi en stor mengde pålitelige data om flere stammer av fluer på kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Beth Gonzalez og Dr. Aprajita Garg for støtte i å utføre eksperimenter i vivo fagocytose. En NSF UMD forhånd frø stipend og UMD NIH T32 trening tilskudd, cellen og molekylærbiologi (CMB) og det vert-patogen samhandlinger (HPI), finansiert dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 146 fagocytose bakterier Cellular immunitet Drosophila melanogaster medfødt immunitet voksen
Vurdere mobilnettet immunforsvaret frukt fly, <em>Drosophila melanogaster</em>, bruke i Vivo fagocytose analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P.… More

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter