Summary
هنا، نقوم بوصف استراتيجية خطوة بخطوة لعزل RNAs الصغيرة، وإثراء microRNAs، وإعداد عينات لتسلسل الإنتاجية العالية. ثم نقوم بوصف كيفية معالجة تسلسل القراءة ومحاذاتها إلى microRNAs، وذلك باستخدام أدوات مفتوحة المصدر.
Abstract
ويعتقد أن نصف جميع النصوص البشرية تنظمها microRNAs. ولذلك، يمكن أن يكشف التحديد الكمي للتعبير microRNA الآليات الكامنة في حالات المرض وتوفير الأهداف العلاجية والمؤشرات الحيوية. هنا، نقوم بتفصيل كيفية قياس الميكروRNAs بدقة. باختصار، يصف هذا الأسلوب عزل microRNAs، ربطها إلى محولات مناسبة لتسلسل الإنتاجية العالية، تضخيم المنتجات النهائية، وإعداد مكتبة عينة. ثم، نشرح كيفية محاذاة قراءات التسلسل التي تم الحصول عليها إلى دبابيس الشعر microRNA، وتحديد كمية، تطبيع، وحساب التعبير التفاضلي. متعدد الاستخدامات وقوية، وهذا الجمع بين سير العمل التجريبي وتحليل المعلوماتية الحيوية تمكن المستخدمين من البدء مع استخراج الأنسجة والانتهاء مع القياس الكمي microRNA.
Introduction
اكتشفت لأول مرة في عام 19931، ويقدر الآن أن ما يقرب من 2000 microRNAs موجودة في الجينوم البشري2. MicroRNAs هي RNAs صغيرة غير الترميز التي عادة ما تكون 21-24 النيوكليوتيدات طويلة. هم منظمون ما بعد النسخ للتعبير الجيني، وغالبا ما تكون ملزمة لمواقع تكميلية في المنطقة 3-Untranslated (3-UTR) من الجينات المستهدفة لقمع التعبير البروتين يتحلل mRNA. ويمكن أن يعطي التحديد الكمي للميكروRNAs نظرة ثاقبة قيّمة في التعبير الجيني وقد وضعت عدة بروتوكولات لهذا الغرض3.
لقد قمنا بتطوير بروتوكول محدد، قابل للاستنساخ، وطويل الأمد لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير، ولتحليل القراءات الطبيعية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر. الأهم من ذلك، بروتوكولنا يتيح التعرف في وقت واحد على كل من microRNAs الذاتية وبنيت تسليمها من الخارج التي تنتج الأنواع الشبيهة microRNA، في حين تقليل يقرأ تلك الخريطة لأنواع الرنا الصغيرة الأخرى، بما في ذلك RNAs ريبوسومال ( rRNAs)، نقل RNAs الصغيرة المشتقة من الحمض النووي الريبي (tsRNAs)، RNAs الصغيرة المشتقة من التكرار، ومنتجات تحلل mRNA. لحسن الحظ، microRNAs هي 5-فوسفوريلات و2-3 هيدروكسيلاد 4، وهي ميزة التي يمكن الاستفادة منها لفصلها عن هذه RNAs الصغيرة الأخرى ومنتجات تدهور mRNA. توجد عدة خيارات تجارية لاستنساخ وتسلسل microRNA التي غالباً ما تكون أسرع وأسهل لمضاعفات; ومع ذلك، فإن طبيعة الملكية من الكواشف عدة وتعديلاتها المتكررة يجعل مقارنة عينة يعمل تحديا. استراتيجيتنا يحسن جمع فقط الحجم الصحيح من microRNAs من خلال الأكريلاميد وخطوات تنقية هلام أغاروز. في هذا البروتوكول، نقوم أيضًا بوصف إجراء لمحاذاة تسلسل القراءة إلى microRNAs باستخدام أدوات مفتوحة المصدر. هذه المجموعة من التعليمات ستكون مفيدة بشكل خاص لمستخدمي المعلوماتية المبتدئين، بغض النظر عما إذا كان يتم استخدام طريقة إعداد المكتبة أو طريقة تجارية.
وقد استخدم هذا البروتوكول في العديد من الدراسات المنشورة. على سبيل المثال، تم استخدامه لتحديد الآلية التي أنزيم ديسير يشق RNAs دبوس الشعر الصغيرة على مسافة اثنين من النيوكليوتيدات من الحلقة الداخلية من هيكل حلقة الجذعية - ما يسمى "حلقة العد قاعدة"5. كما اتبعنا هذه الطرق لتحديد الوفرة النسبية لRNAs دبوس الشعر الصغيرة تسليم (shRNA) أعرب عنها من ناقلات الفيروسية المرتبطة بالدينو المؤتلف (rAAVs)، لتحديد عتبة التعبير shRNA التي يمكن التسامح معها قبل الكبد السمية المرتبطة بالتعبير الزائد shRNA6. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا أيضا microRNAs في الكبد التي تستجيب لعدم microRNA-122 - microRNA الكبدي أعرب للغاية - في حين تتميز أيضا نمط تدهور هذا microRNA7. لأننا استخدمنا بروتوكولنا باستمرار في العديد من التجارب، تمكنا من مراقبة الاستعدادات عينة طوليا، ونرى أنه لا توجد آثار دفعة واضحة.
في تقاسم هذا البروتوكول، هدفنا هو تمكين المستخدمين من توليد جودة عالية، والقياس الكمي القابلة للاستنساخ من microRNAs في أي الأنسجة أو خط الخلية تقريبا، وذلك باستخدام معدات بأسعار معقولة والكواشف، وأدوات المعلوماتية الحيوية مجانا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أذنت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة واشنطن بإجراء تجارب حيوانية.
إعداد مكتبة RNA صغيرة
1. عزل الحمض النووي الريبي
- عزل الحمض النووي الريبي من مصدر بيولوجي باستخدام كاشف عزل RNA قياسي، أو مجموعة تثري الميكروRNAs. بالنسبة للأنسجة، فمن الأفضل أن تبدأ مع عينات المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل والأرض إلى مسحوق باستخدام هاون المبردة مسبقا والآفات.
- قياس سلامة الحمض النووي الريبي لكل عينة على أداة يمكن قياس الحمض النووي الريبي وتوفير رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN). يجب أن تكون RINs >7.
3'محول الربط 3.
- إعداد رد فعل الربط في أنابيب قطاع PCR، عن طريق الجمع بين: 11 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (1-3 ميكروغرام، وذلك باستخدام نفس الكمية لكل عينة)، و1.5 ميكرولتر من 10x T4 RNA ligase التفاعل العازلة، ATP-خالية، 1 ميكرولتر من البولي ايثيلين غليكول (PEG)، و 0.5 ميكرولتر من 3'-linker (100 μM العالمي ميرنا استنساخ لين كير).
ملاحظة: يساعد عدم وجود ATP على إثراء miRNAs ويقلل من استنساخ منتجات تحلل mRNA. PEG بمثابة عامل الازدحام الجزيئي، وتعزيز الربط الناجح. وMiRNA العالمي استنساخ الرابط لديه 3 ' حظر مجموعة (أمين) لمنع الربط الذاتي، التعميم، والربط إلى RNA في نهاية 5'. - تسخين العينات في 95 درجة مئوية على دراجة حرارية لمدة 30-40 ق. بارد على الجليد لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: الحضانة في درجة حرارة الغرفة يساعد على منع ربط linker-linker. لقد استخدمنا أيضا بنجاح T4 RNA ligase 1. - إعداد 30 مل من هلام بوليأكريلاميد 15٪ مع 8 M اليوريا (لهلام 20x20 سم): 14.4 غرام من اليوريا، 3 مل من 10X تريس العازلة حمض الإيثيلين ديايمينتيراسيتيك (TBE)، 11.2 مل من 40٪ 19:1 أكريلاميد، و H2س إلى 30 مل. الحل هو أفضل حل في 42 درجة مئوية. قبل الصب مباشرة، إضافة 150 درجة مئوية من 10٪ كبريتات الأمونيوم (APS) و 30 ميكرولتر من رباعي ميثيل الإيثيلين ديامين (TEMED) للبلمرة.
- صب بين 0.8 ملم لوحات زجاجية منفصلة في يلقي البلاستيك وإدراج مشط. مرة واحدة يتم تقوية هلام (حوالي 20 دقيقة)، إضافة 0.5x TBE إلى خزان وغسل الآبار من اليوريا المتبقية عن طريق الأنابيب بقوة.
- قبل تشغيل هلام في ثابت 375 V لمدة 25 دقيقة دون عينات حتى اليوريا يمكن أن تدخل الجل، ثم غسل الآبار مرة أخرى.
ملاحظة: قد تحتاج إلى تقليل مقدار الجهد اعتماداً على نوع إمدادات الطاقة ونظام الكهربائي الذي يتم استخدامه. - بمجرد الانتهاء من العينات الربط، إضافة 15 درجة مئوية من صبغ تحميل أكريلاميد إلى العينات (لنسبة 1:1)، ثم تشوه لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية على دراجة حرارية.
- إعداد 25 نانوغرام / ميكرولتر من 37 و 44 نقطة أساس علامات الحجم، المخففة مع جزء واحد أكريلاميد صبغ التحميل. يتم سرد التسلسلات في الجدول 1.
- تحميل العينات على هلام polyacrylamide، وترك حارة واحدة على الأقل بين كل عينة. تحميل 20 درجة مئوية من مجموعتين على الأقل من علامات، في نمط غير متناظرة لتتبع اتجاه هلام.
- تشغيل هلام في ثابت 375 V لأول 15 دقيقة ثم قم بزيادة إلى ثابت 425 V لتشغيل المتبقية. تشغيل حتى بروموفينول الأزرق حوالي 1-4 سم من الجزء السفلي، والذي يأخذ ما يقرب من 2 ساعة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، قد يتم تشغيل الجل في الجهد المستمر أقل لفترة أطول من الزمن حتى الأزرق بروموفينول حوالي 1-4 سم من القاع. - إزالة هلام من لوحات الزجاج باستخدام فاصل لوحة، ووضع هلام على حامي صفحة من البلاستيك. تخفيف 5 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم في 500 ميكرولتر من الماء المقطر، والماصة على ممرات العلامات فوق العلامة الزرقاء الفاتحة العليا (انظر الشكل 1ألف).
تحذير: استخدام القفازات لبروميد الإيثيديوم والتخلص من النفايات وفقا للوائح المحلية. اسمحوا الجلوس لمدة 5 دقائق. - تحت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، وقطع المواد الهلامية من أعلى إلى أسفل علامة في كل حارة باستخدام شفرة الحلاقة نظيفة (انظر الشكل 1A). نقل إلى 4 × 4 سم مربع من مختبر ختم الفيلم، ثم قطع هلام مع حوالي 4 تخفيضات أفقيا و 3 عموديا لإنتاج 12 مربعات صغيرة (انظر الشكل 1B).
- ماصة 400 درجة مئوية من 0.3 M NaCl إلى مربع الفيلم الختم، وقطع هلام قمع في أنابيب السيليكون 1.5 مل (انظر الشكل 1C). تحريك العينات على الجوز في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن استبدال أنابيب أخرى منخفضة الاحتفاظ بـ 1.5 مل بأنابيب السيليكون. - بعد ما لا يقل عن 12 ساعة من التحريض في 4 درجة مئوية، واسترداد العينات ووضعها على الجليد، جنبا إلى جنب مع أنبوب مخروطي من الإيثانول 100٪.
- نقل 400 درجة مئوية من supernatant إلى أنبوب جديد، ومن ثم إضافة 1 مل من الإيثانول 100٪ و 1 ميكرولتر من 15 ملغ / مل الجليكوجين coprecipitant. تأكد من جمع أكبر قدر ممكن من الفائقة، والغزل إلى أسفل في 4 درجة مئوية وpipetting أكثر حسب الضرورة. ضع في -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، أو -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو أكثر. الجليكوجين coprecipitant يحسن بيليه الرؤية والانتعاش.
- تدور في 4 درجة مئوية في 17،000 × ز لمدة 20-30 دقيقة.
3. 5 'الربط الرابط
- إعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب في 6.5 درجة مئوية من المياه الخالية من النوكل. ترك بيليه الجلوس في الماء لبضع دقائق أولا سوف تساعد مع إعادة تعليق.
- بعد الغزل أسفل بيليه وإعادة تعليق في الماء، إضافة 0.5 درجة مئوية من 100 μM 5'-linker (مع الباركود؛ انظر الجدول1)، 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase العازلة، 1 ميكرولتر من ATP 10 mM، و 1 ميكرولتر من PEG. يُحمّى على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية، ثم يُوضع على الجليد. إضافة 1 درجة مئوية من T4 RNA ligase 1 والسماح للاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- إضافة 400 درجة مئوية من 0.3 M حمض الكل، تليها 400 ميكرولتر من الفينول الحمضي / الكلوروفورم. دوامة 30 ق - 1 دقيقة (الحل سوف تبدو غائمة)، ومن ثم تدور في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة في السرعة القصوى في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة (~ 17،000 × ز). رسم قبالة الطبقة العليا ومكان في أنبوب جديد 1.5 مل.
ملاحظة: تجنب توجيه أي من الطبقة السفلية. - إضافة 350 درجة مئوية من الكلوروفورم، دوامة لفترة وجيزة، ومن ثم تدور في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في السرعة القصوى (~ 17،000 × ز). رسم قبالة أعلى في وقت لاحق ووضعها في أنبوب جديد 1.5 مل. إضافة 1.5 ميكرولتر من الجليكوجين coprecipitant و 1 مل من الإيثانول 100٪.
ملاحظة: مرة أخرى، تجنب توجيه الأنابيب أي من الطبقة السفلية. - دوامة لفترة وجيزة، ثم وضع في -80 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل، أو -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
4. النسخ العكسي (RT)
- قم بتشغيل كتلة الحرارة 42 درجة مئوية. تدور العينات في 4 درجة مئوية و ~ 17،000 × ز لمدة 20-30 دقيقة.
- إعادة تعليق عينة بيليه في 8.25 درجة مئوية من المياه الخالية من nuclease، ثم إضافة: 0.5 ميكرولتر من 100 μM RT التمهيدي (الجدول1)،و 5 ميكرولتر من 2X RT مزيج رد الفعل من مجموعة توليف cDNA. حضانة في 42 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- إضافة 1.5 ميكرولتر من إنزيم RT 10X إلى كل عينة وحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في دراجة حرارية. ضع في -20 درجة مئوية أو الاستمرار في التحلل المائي والتحييد.
ملاحظة: يمكن استخدام عدة مجموعات RT للخطوتين 4-2 و4-3. - إجراء التحلل القلوي والتحييد: جعل 1 مل من هيدروكسيد البوتاسيوم 150 مل (KOH) الحل (150 ميكرولتر من 1 M KOH، 20 ميكرولتر من 1 M تريس قاعدة درجة الحموضة 7.5، و 830 ميكرولتر من H2O) و 1 مل من 150 مل حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) (150 ميكرولتر من 1 م حمض الهيدروكلوريك و 850 ميكرولتر من H2O).
- قبل إضافة إلى العينات، تحديد كمية حمض الهيدروكلوريك اللازمة لتحييد حل KOH. عموما، حول 20-24 درجة مئوية من حمض الهيدروكلوريك سوف تحييد 25 درجة مئوية من KOH. تحقق من تركيبة على شريط الحموضة للتأكد من أنه في النطاق الصحيح (pH 7.0 إلى 9.5).
- تحلل العينات عن طريق إضافة 25 درجة مئوية من 150 مل كحل KOH وحضانة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.
- تحييد العينات عن طريق إضافة كمية 150 مل حمض الهيدروكلوريك المحددة في الخطوة 4.4، للحصول على درجة الحموضة عينة نهائية بين 7.0 و 9.5.
5. تضخيم PCR
- بعد التحييد، قم بإعداد تفاعل PCR مع: 29.5 ميكرولتر من الماء، و5 ميكرولتر من 10 x طاقة العازلة،و1 ميكرولتر من dNTP، و2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي الأمامي (الجدول 1)، 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي العكسي (الجدول1)،0.5 ميكرولتر من طاقة، و10 ميكرولتر من cDNA المنقولة العكسية من الخطوة 4.6 .
- تشغيل رد فعل PCR التالية: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم 20 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 45 s، 50 درجة مئوية ل75 s و 72 درجة مئوية لمدة 60 s.
- تشغيل رد فعل PCR الثاني من حوالي 2-4 دورات أكثر باستخدام 5 μL من المنتج من الخطوة 5.2. مزيج: 34.8 ميكرولتر من الماء، 5 ميكرولتر من 10X طاقة العازلة، 1 ميكرولتر من dNTP، 1 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام (الجدول1)،1 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي العكسي (الجدول1)،و 0.2 ميكرولتر من بوليميراز طاقة. اتبع نفس معلمات الدراجات الحرارية الموضحة في الخطوة 5.2.
ملاحظة: الغرض من القيام باثنين من ردود فعل PCR - مع الأول لمدة 20 دورة والثاني لمدة 2-4 أكثر فقط - هو التأكد من أن كمية cDNA تضخيم في نطاق ديناميكي (أي، ليس كمية مشبعة).
6. غاروز جل تنقية
- إعداد هلام أغاروز 4٪ مع الأغروز منخفضة الذوبان. تحميل 40 درجة مئوية أو أكثر من المنتج PCR على هلام، جنبا إلى جنب مع صبغ التحميل. تحميل 100 نقطة أساس و 25 نقطة أساس علامات الحجم.
ملاحظة: يساعد سلم 25 bp على تمييز المنتج المكبر عن منتجات ربط الرابط. يجب أن يلقي المواد الهلامية الأجاروز منخفضة ذوبان مع رعاية أكبر من هلام أغاروز التقليدية، لذلك اتبع عن كثب تعليمات من الشركة المصنعة. - لاستخراج هلام، حدد رقم الدورة التي تكون مرئية على هلام ولكن غير مشبعة (عادة 22-24 دورات). اختر نطاقات كثافة مشابهة عند تشغيل عينات متعددة.
- قطع النطاق الذي هو فوق النطاق 125 نقطة أساس (الفرقة أغمق على سلم 25 bp؛ انظر الشكل 1D). باستخدام مجموعة استخراج هلام، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإضافة العازلة على أساس هلام 4٪، ثم يهز لإذابة أغاروز في العازلة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: إذابة عند 55 درجة مئوية يزيد من إمكانية ربط الرابط. - اتبع تعليمات استخراج هلام الشركة المصنعة وelute في 30 درجة مئوية من العازلة elution أو الماء. إذا كان المنتج بدا ضعيفا على هلام، ثم تقليل الإلتواء إلى 20 درجة مئوية.
- قياس تركيز cDNA باستخدام تقنية حساسة، وإعداد مكتبة عينة للتسلسل. وسيتوقف الإعداد على نوع التسلسل المستخدم.
ملاحظة: المتطلبات الدنيا لمكتبة التسلسل عادةً حجم 10 ميكرولتر من 10 μM المنتج. إذا كانت التركيزات منخفضة جداً، تجمع والإيثانول يعجل عينات لجلب المكتبة إلى التركيز المطلوب. - تسلسل العينات باستخدام المعدات المتاحة. مثال شائع هو تشغيل العينات باستخدام مجموعة لقراءات واحدة 50 bp، للحصول على حوالي 15-25 مليون قراءة بتنسيق إخراج FASTQ.
محاذاة تسلسل RNA الصغيرة والمعلوماتية الحيوية
7. تحميل البيانات
- قم بتنزيل ملفات FASTQ التي تم إنشاؤها من كل تشغيل تسلسل. تحميل قائمة من تسلسل دبوس الشعر microRNA من miRbase.org8,9,10.
- إنشاء حساب غالاكسي في www.usegalaxy.org وتحميل ملف FASTQ من تسلسل يقرأ إلى هذا الحساب.
- تحميل ملف نصي من تسلسل الباركود إلى حساب غالاكسي، مثل barcodes.txt، والذي يتوفر كملف نصي (الجدولالتكميلي 1).
- تحميل ملف FASTA من دبابيس الشعر microRNA إلى حساب غالاكسي من قاعدة بيانات مثل miRBase.org. وترد في الجدول التكميلي 2 والجدول التكميلي 3أمثلة على سلائف الفأر (mousehairpins.fa) أو السلائف البشرية (humanhairpins.fa).
8. إزالة محول، نوع الباركود، وتقليم
- في علامة التبويب الأيمن، انتقل إلى معالجة الملفات الجينية > FASTA/FASTQ > تسلسلات محول القصاصة.
- في ملف الإدخال بتنسيق FASTA أو FASTQ، أدخل ملف FASTQ من القائمة المنسدلة. تغيير الحد الأدنى لطول التسلسل إلى 18. تغيير المصدر لإدخال تسلسل مخصص. أدخل CTGTAGGC. الاحتفاظ بكافة المعلمات الافتراضية الأخرى. انقر فوق تنفيذ.
ملاحظة: يقرأ تسلسل التي هي أقصر من 18 النيوكليوتيدات من الصعب تعيين بشكل فريد إلى microRNAs وتحتوي على العديد من منتجات التحلل. - في علامة التبويب اليد اليسرى، انتقل إلى معالجة الملفات الجينية > FASTA/FASTQ > مقسم الباركود.
ملاحظة: يتم تحديث وظائف Galaxy والرؤوس بشكل دوري، لذلك قد تكون وظيفة البحث ضرورية للبحث عن أداة مكافئة أو موقعها. مجموعات التجارية باستخدام التمهيديات المفهرسة غالبا ما يتم فرزها بالفعل عن طريق الباركود. لذلك، هذه الخطوة وخطوة تقليم الباركود ليست ضرورية إذا بدأت من مجموعة تجارية. - للالباركودلاستخدامها ، أشر إلى barcodes.txt. لتقسيم المكتبة، استخدم قصاصة على ملف البيانات الذي تم إنتاجه في الخطوة السابقة. في عدد حالات عدم التطابقالمسموح بها ، أدخل 1. انقر فوق تنفيذ.
- تقليم أول 4 النيوكليوتيدات: انتقل إلى التلاعب النص > تقليم الأحرف الرائدة أو زائدة. بالنسبة لمجموعة بياناتالإدخال، انقر فوق رمز المجلد، وهو مجموعة بيانات. حدد الملف الدفعي للعينات، والذي يتضمن تسمية مقسم الباركود على البيانات. في تريم من البداية إلى هذا الموقف، أدخل 5. في هل مجموعة بيانات الإدخال بتنسيق FASTQ؟ أدخل نعم. انقر فوق تنفيذ. قد يستغرق التنفيذ عدة دقائق.
9- مواءمة القراءات مع الميكروRNAs
- في المجرة، انتقل إلى تحليل الجينوم > RNA-Seq > الإبحار نسخة القياس الكمي11.
- للسؤال حدد نسخة مرجعية من التاريخ الخاص بك أو استخدم فهرس مضمن؟ حدد استخدام واحد من المحفوظات. أدخل الملف الذي تم تحميله mousehairpins.fa من القائمة المنسدلة. في الملف FASTA/Q، انقر فوق رمز المجلد لاستخدام مجموعة مجموعة بيانات وحدد الملف الذي يتضمن Trim on collection. انقر فوق تنفيذ. قد يستغرق التنفيذ عدة دقائق.
- في علامة التبويب التاريخ على اليمين، انقر على Sailfish على جمع ... انقر فوق كل ملف فردي وانقر فوق رمز القرص لحفظه على الكمبيوتر المحلي. يجب أولاً إلغاء ضغط الملفات التي يتم تنزيلها بشكل فردي. قد تحتاج أيضاً إلى إعادة حفظها بملحق .txt لغرض الاستيراد إلى جدول بيانات.
- افتح كل ملف جدول بيانات في وإعادة تسمية العمود NumReads إلى شرط العلاج. دمج الأعمدة معاً لإنشاء مصفوفة microRNAs في العمود الأول وقراءة التهم لكل شرط في الأعمدة اللاحقة.
- لحساب microRNAs معبرا عنها بشكل تفاضلي لكل حالة علاج، استخدم الملف مع microRNA الخام قراءة التهم كمدخلات لبرامج مثل DESeq212. DESeq2 موجود في غالاكسي في تحليل الجينوم > RNA-seq > DESeq2 علامة التبويب.
- تحويل قراءات الخام إلى حساب القراءة microRNA تطبيع. يتم تطبيع العد إلى عمق تسلسل المكتبة من المكتبة من خلال الحساب التالي: [(يقرأ الخام / مجموع microRNA يقرأ) * (1,000,000 – عدد microRNAs عد) + 1].
ملاحظة: يوفر هذا الحساب قراءات عادية لكل مليون (RPM) microRNAs المعينة التي يمكن مقارنتها عبر مجموعات البيانات والظروف البيولوجية. الإخراج هو ملف محدد بعلامات جدولة. يوفر سمك المراكب الشراعية عمود إخراج TPM، على الرغم من أن هذه القيمة يتم تطبيعها من قبل طول دبوس الشعر microRNA، وهو أمر غير ضروري في هذا السياق. - إذا كان ذلك مناسباً، كرر المحاذاة مع تسلسلات الإدخال المخصصة (مثل متجه) لتحديد يقرأ تلك الخريطة إلى البنيات المسلمة، مثل shRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مخطط للخطوات التي ينطوي عليها إعداد المكتبة
ويرد مخطط شامل لاستخراج الحمض النووي الريبي الصغير والتسلسل والمحاذاة في الشكل 2.
تم جمع عينات الكبد من فأر واحد من الذكور والإناث والمفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل. تم استخراج مجموع الحمض النووي الريبي وتقييمها للجودة والتركيز.
ينتج تسلسل RNA صغير [رنا] كاف لتسلسل
استعملت 3 μg من [رنا] من اثنان مستقلّة [رنا] إستخراجات كان ك [سترت متريل] لصغيرة [رنا] تسلسل. تم تشغيل عينات على هلام أكريلاميد وقطع بين علامات الحجم المقابلة ل17-28 nt من الحمض النووي الريبي (الشكل1A). وقد قُطعت العينات إلى أجزاء لعزل الحمض النووي الريبي (الشكل1B)ونُقلت إلى أنبوب طرد مركزي منخفض الاحتفاظ بـ 1.5 مل (الشكل1C). الباركود bc7 و bc17 (الجدول1)كانت مربطة إلى نهاية 5 'من RNA الصغيرة. وقد تم تضخيم مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام 22 دورة من PCR لإنتاج 8.0 و 11.2 نانوغرام/ميكرولتر المنتج، على التوالي. تم تجميع العينات وقدمت عينة مجمعة 10 nM لتسلسل الإنتاجية العالية باستخدام طول القراءة 50 نقطة أساس.
MiR-122 هو microRNA الأكثر وفرة في كبد الماوس
بعد فرز الباركود، 851،931 يقرأ الواردة الباركود من عينة الكبد 1 و 650،154 من عينة الكبد 2. ومن بين القراءات، تم تعيين 83.5 في المائة و90.0 في المائة على الميكروRNAs على التوالي، بينما تم تعيين القراءات المتبقية إلى rRNAs (1.8 في المائة و0.6 في المائة على التوالي)، وشظايا التحلل في الـ tRNAs وmRNA. بعد المحاذاة إلى دبابيس الشعر microRNA الإنسان، لاحظنا توافق قوي بين microRNA قراءة التهم في كل تكرار (R2 = 0.998; الشكل3). تم اكتشاف ما مجموعه 306 أنواع microRNA، مع أكبر عدد من القراءات رسم الخرائط إلى miR-122 (الجدولالتكميلي4). وكانت وفرة MicroRNA مماثلة بين عينات الكبد الذكور والإناث.
الشكل 1 استخراج RNAs الصغيرة من هلام أكريلاميد. (أ) هلام أكريلاميد والمنطقة التي يتم قطع المقابلة لحجم microRNAs. (B) قطع هلام قبل وبعد قطع إلى شظايا أصغر. (C) عملية لنقل شظايا هلام في أنابيب السيليكون. (D) تفاعل PCR على جل أغاروز منخفض الذوبان مما يدل على المنتج المستنسخة الصحيح مقارنة مع المنتج linker-linker وغير المشبعة (22 دورات) مقابل المشبعة (24 دورات) العينات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 مخطط البروتوكول. جدول زمني يبين الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها الإجراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 استنساخ النتائج من اثنين من استخراج الحمض النووي الريبي مستقلة. Scatterplot من microRNA قراءة التهم من كبد الماوس الذكور (س محور) مقارنة مع كبد الماوس الإناث (ص المحور) باستخدام مقياس المستندة إلى log10. تمثل كل نقطة القراءات لكل مليون (RPM) التي تم تعيينها حساب microRNA لكل ميكرورنا فردية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| التمهيدي | تسلسل | |
| 3' رابط 1 | محمد الدوسري | |
| علامة حجم أقل | rarurCrCrCrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrUrArArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| علامة الحجم العلوي | rararurcrarGrGrGrUrUrUrUrUrurururarararararururararararararargGTAACCGCATATGCGTC | |
| الرمز الشريطي1 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGCTrArGrG | |
| الرمز الشريطي2 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrGrUrC | |
| الرمز الشريطي3 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGCTrUrGrG | |
| الرمز الشريطي4 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrArUrUrU | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrGrGrGU | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrGrUra | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCGCTrUrUrUrG | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGCTrUrGrC | |
| محمد محمد | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGCTrCrArG | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrArUrArC | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCGCTrUrUrUrUrU | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrCrarArU | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrararGrA | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGCTrUrGrarA | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGCTrUrGrG | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCGCTrUrUrUrG | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCGCTrUrCrArU | |
| محمد الدوسري | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATTrGrUrArU | |
| RT التمهيدي | ATTGGTGCCTACAG | |
| PCR التمهيدي F | AATGATACCGACCACCTACACTCTTTTTTACACACGACGCTCTTCCGATCT | |
| PCR التمهيدي R | CAAGCAGAGACGGCATACACCTCCCCCCATCTATTGGTGCCTACAG | |
الجدول 1 قائمة التمهيديات.
الجدول التكميلي 1. قائمة تسلسل الباركود. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2. قائمة برعاية من تسلسل السلائف ميكرورنا الماوس. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 3. قائمة برعاية من تسلسل السلائف microRNA الإنسان. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 4. الخام وتطبيع microRNA قراءة التهم. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من تحديد microRNAs منذ أكثر من 20 عاما13، فإن عملية تسلسل microRNA لا تزال شاقة وتتطلب معدات متخصصة ، مما يعوق المختبرات من اعتماد البروتوكولات الداخلية بشكل روتيني14. تقنيات أخرى يمكن أن تقيم في وقت واحد microRNAs، مثل microRNA microarrays ولوحات التعبير متعددة المضاعفات؛ ومع ذلك، فإن هذه النهج محدودة من حيث أنها تحدد فقط كمية microRNAs الموجودة في مجموعة المسبار الخاصة بها. وبسبب هذا، فإنها تفوت الميزات الهامة من تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة، مثل تحديد microRNAs رواية، وisoforms microRNA - التغيرات النووية التي يمكن أن يكون لها وظيفة بيولوجية هامة6،7،15 .
عند بدء تجربة جديدة، غالباً ما يكون استخدام بائع تجاري أسهل لأنها توفر الدعم التقني وسهولة الاستخدام. تتوفر العديد من الخيارات التجارية لتسلسل microRNA، والتي يمكن مضاعفة لتقليل عبء العمل عند معالجة أعداد كبيرة (>100) من العينات. ويجري باستمرار تحسين هذه المجموعات التجارية، وهو ما يشكل ميزة وحرمانا على حد سواء. فمن ناحية، طورت الشركات التي تصنع هذه المجموعات أساليب جديدة لالتقاط الرنا، على سبيل المثال، من خلال التعميم لنهاياتها الخمسة والثالثة قبل التسلسل أو استخدام الوصلات المنحلة ذات التسلسلات العشوائية في كل نهاية للحد من تحيز الربط. كما أنها وضعت أساليب لإزالة محول الخافتات، على سبيل المثال، من خلال ربط محولات الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة أو التهجين من oligonucleotides التكميلية. ومن ناحية أخرى، توصي مجموعات المواد التجارية بعدم تعديل أو تعديل أي خطوة. ولذلك، إذا أجريت أي تحديثات لمجموعة من الأدوات، فمن الصعب أو المستحيل مقارنة البيانات المستمدة من الإصدارات القديمة والجديدة من مجموعات المواد، فضلا عن البيانات المستمدة من مجموعات من بائعين تجاريين مختلفين. هنا، لقد وصفنا بروتوكولاً يبقى في السلطة في مواجهة البدائل التجارية. تركيزنا على خطوات تنقية هلام - في حين أنها تضيف الوقت إلى البروتوكول - تمكن التقاط microRNA متسقة واستنساخ على مدى سنوات عديدة استخدمناها. وقد أجريت عدة تقييمات للاستنساخ بين المجموعات التجارية والبروتوكولات الداخلية، ونقوم بإحالة القارئ إلى عدد قليل من هذه الدراسات16،17،18،19. والأهم من ذلك، يمكن استخدام الخطوات التي نحددها لتحليل المعلوماتية الحيوية للميكروRNAs بغض النظر عن اختيار مجموعة الأدوات أو البروتوكول الداخلي.
تسلسل MicroRNA غالبا ما تكون مضطربة من قبل اختيار الباركود: في بعض الحالات، قد لا تكون كفاءة الربط من الباركود المختلفة معادلة، مما يؤدي إلى توزيعات متحيزة من تسلسل في العينات20. فمن المستحسن الآن لاستخدام قواعد منحطة في نهاية 5 و 3 للحد من التحيزات ربط microRNAs محددة21،22. في هذا البروتوكول، لم نلاحظ هذه القضايا الربط ولاحظنا عمليات قراءة متسقة لتكرار التقنيةوالبيولوجية تقييمها مع الباركود مختلفة 5،6،7،23، ولكن من المهم أن تكون على بينة منها. وتشمل أساليب تجنب التحيز الربط إدراج التمهيديات مؤشر في التمهيديات PCR، أو لإضافة واحد أو أكثر من النيوكليوسيدات RNA عشوائية في نهاية 3 من تسلسل محول 5 (الجدول1). إدخال واحد أو أكثر من الحمض النووي الريبي الاصطناعية، مثل C. elegans miR-39 microRNA24، هو أيضا خيار لأغراض التطبيع، وهو أمر بالغ الأهمية للحالات ذات العائد المنخفض، مثل قياس microRNAs من exosomes. وبالمثل، لالربط RNA، لقد استخدمنا بنجاح T4 RNA ligase 1، ولكن تم إثبات الربط مع أقل التحيز لشكل مقتطع من T4 RNA ligase 225. وأخيرا، النصوص الفوقية الثالثة والرابعة هي إنزيمات النسخ العكسي البديلة التي استخدمناها دون مشكلة.
اختيار قاعدة بيانات microRNA يمكن أن تؤثر أيضا على النتائج النهائية تطبيع. والتحدي الذي يواجه تنظيم قواعد بيانات microRNA هو أن العديد من التقييمات الجديدة الصغيرة RNAs المدرجة على أنها microRNAs هي في الواقع أجزاء من العناصر المتكررة وليست microRNAs حسن النية2. وقد بُذلت جهود للتقاعد من الميكروRNAs التي لا تتفق مع المعايير القياسية، بحيث تكون النسخة التالية من قاعدة بيانات microRNA أكثر دقة؛ ومع ذلك، يحتوي التكرار التالي أيضاً على مرشحين جدد يحتاجون إلى تأكيد. وعندما يتم تضمين الميكروRNAs المشتقة من التكرار في المحاذاة، فإنها يمكن أن تشوه النتائج وتطغى على البيانات من microRNAs الموجودة. ولذلك، فإن استخدام مجموعات البيانات المنسقة جيدا من microRNAs من مختلف الأنواع أمر ضروري26،27. لقد شهدنا أكبر قابلية للاستنساخ عند محاذاة تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة يقرأ إلى قوائم برعاية microRNAs المحفوظة وأدرجوا هذه دبابيس الشعر في الجدول التكميلي 2 والجدول التكميلي 3. هذه القوائم تطابق تقديرات حوالي 500 microRNAsعالية الثقة في الجينوم البشري 2،26.
كما هو الحال مع أي تقنية، ينبغي تأكيد النتائج مع نهج متعامد. لقد استنسخنا بنجاح نتائج تسلسل RNA الصغيرة مع البقع الصغيرة RNA الشمالية التي تتضمن تحقيقات ذاتعلامات الراديو لتأكيد حجم ووفرة نسبية من microRNAs مرشح 6،7،23. PCR الكمية من microRNAs باستخدام تسلسل القراءة المجزأة، وتأكيد التغيرات الهدف mRNA باستخدام qPCR والنشاف الغربية هي خيارات أخرى للتحقق.
وباختصار، قدمنا طريقة لعزل وتسلسل microRNAs وإجراء المحاذاة ضد قواعد البيانات microRNA الموجودة. ومن شأن قدرة الكواشف والمعدات على تحمل تكاليفها واستخدام أدوات مفتوحة المصدر للتحليل أن تجعل هذا البروتوكول في متناول أي شخص. وأخيرا، يمكن استخدام هذا البروتوكول في أي نسيج أو خط الخلية لتحقيق قراءات قابلة للاستنساخ للغاية، وذات جودة عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر أعضاء مختبرات أندرو فاير ومارك كاي على التوجيه والاقتراحات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P.
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C.
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S.
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
