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Genetics

Isolating और अनुक्रमMicroRNAs के लिए एक पूरी पाइपलाइन, और उन्हें मुक्त स्रोत उपकरण का उपयोग का विश्लेषण

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/59901
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Medical Genetics, University of Washington School of Medicine

Summary

यहाँ, हम छोटे RNAs अलग करने के लिए एक कदम दर कदम रणनीति का वर्णन, microRNAs के लिए समृद्ध, और उच्च throughput अनुक्रमण के लिए नमूने की तैयारी. हम तो अनुक्रम को संसाधित करने के लिए कैसे का वर्णन पढ़ता है और उन्हें microRNAs करने के लिए संरेखित करें, खुला स्रोत उपकरण का उपयोग कर.

Abstract

सभी मानव प्रतिलिपि के आधे microRNAs द्वारा विनियमित माना जाता है. इसलिए, microRNA अभिव्यक्ति परिमाणक रोग राज्यों में अंतर्निहित तंत्र प्रकट कर सकते हैं और चिकित्सीय लक्ष्य और biomarkers प्रदान करते हैं. यहाँ, हम विस्तार से कैसे सही microRNAs मात्रा निर्धारित करने के लिए. संक्षेप में, इस विधि microRNAs अलग करने का वर्णन करता है, उन्हें उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए उपयुक्त adapters के लिए ligating, अंतिम उत्पादों बढ़ाना, और एक नमूना पुस्तकालय की तैयारी. फिर, हम समझा कैसे प्राप्त अनुक्रमण संरेखित करने के लिए microRNA hairpins को पढ़ता है, और मात्रा, सामान्य, और उनके अंतर अभिव्यक्ति की गणना. बहुमुखी और मजबूत, इस संयुक्त प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह और bioinformatic विश्लेषण उपयोगकर्ताओं ऊतक निष्कर्षण और microRNA परिमाणीकरण के साथ खत्म करने के साथ शुरू करने के लिए सक्षम बनाता है.

Introduction

पहली बार 19931में खोज की गई , अब यह अनुमान लगाया गया है कि मानव जीनोम2में लगभग 2000 माइक्रोआरएन मौजूद हैं . MicroRNAs छोटे गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो आम तौर पर 21-24 न्यूक्लिओटाइड लंबे होते हैं। वे जीन अभिव्यक्ति के बाद-transcriptional नियामकों, अक्सर 3-untranslated क्षेत्र में पूरक साइटों के लिए बाध्यकारी हैं (3-UTR) लक्ष्य जीन के प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबाने और mrna नीचा. परिमाणीकरण microRNAs जीन अभिव्यक्ति में मूल्यवान अंतर्दृष्टि दे सकते हैं और कई प्रोटोकॉल इस उद्देश्य के लिए विकसित किया गया है3.

हम छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए एक परिभाषित, reproduible, और लंबे समय से चली आ रही प्रोटोकॉल विकसित किया है, और खुला स्रोत bioinformatics उपकरण का उपयोग कर सामान्यीकृत पढ़ता का विश्लेषण करने के लिए. महत्वपूर्ण बात यह है कि हमारे प्रोटोकॉल दोनों अंतर्जात microRNAs और exogenously दिया निर्माण है कि microRNA की तरह प्रजातियों का उत्पादन की एक साथ पहचान सक्षम बनाता है, जबकि कम से कम है कि अन्य छोटे आरएनए प्रजातियों के नक्शे पढ़ता है, रिबोसोमल आरएनए सहित ( आर.आर.एन.ए.), स्थानांतरण आरएनए व्युत्पन्न छोटे आरएनए (टीएसआरएन), दोहराने से व्युत्पन्न छोटे आरएनए, और एमआरएनए अवक्रमण उत्पाद। सौभाग्य से, microRNAs 5-फॉस्फोरीलेटा हुआ और2-3 हाइड्रॉक्सीलेटा 4, एक विशेषता है कि उन्हें इन अन्य छोटे RNAs और MRNA गिरावट उत्पादों से अलग leveraged किया जा सकता है. microRNA क्लोनिंग और अनुक्रमण है कि अक्सर तेज और मल्टीप्लेक्स के लिए आसान कर रहे हैं के लिए कई वाणिज्यिक विकल्प मौजूद हैं; हालांकि, किट अभिकर्मकों और उनके लगातार संशोधनों के स्वामित्व प्रकृति नमूना चुनौतीपूर्ण चलाता है की तुलना करता है. हमारी रणनीति acrylamide और agarose जेल शुद्धि कदम के माध्यम से microRNAs के केवल सही आकार इकट्ठा करने का अनुकूलन. इस प्रोटोकॉल में, हम भी अनुक्रम aligning के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन खुला स्रोत उपकरण का उपयोग microRNAs करने के लिए पढ़ता है. निर्देशों का यह सेट विशेष रूप से नौसिखिया informatics उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा, चाहे हमारे पुस्तकालय तैयारी विधि या एक वाणिज्यिक विधि प्रयोग किया जाता है की परवाह किए बिना.

इस प्रोटोकॉल कई प्रकाशित अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, इसका उपयोग उस तंत्र की पहचान करने के लिए किया गया था जिसके द्वारा डाइजर एंजाइम स्टेम-लूप संरचना के आंतरिक लूप से दो न्यूक्लिओटाइड की दूरी पर छोटे हेयरपिन आरएनए को छोड़ देता है - तथाकथित "लूप-काउंटिंग नियम"5। हम भी वितरित छोटे hairpin RNAs के रिश्तेदार बहुतायत की पहचान करने के लिए इन तरीकों का पालन किया (shRNA) रिकॉमबिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर (rAAVs) से व्यक्त, shRNA अभिव्यक्ति की सीमा है कि जिगर से पहले सहन किया जा सकता की सीमा की पहचान करने के लिए अधिक shRNA अभिव्यक्ति के साथ जुड़े विषाक्तता6| इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने यकृत में माइक्रोआरएन की भी पहचान की जो माइक्रोआरएनए-122 की अनुपस्थिति का जवाब देती है - एक अत्यधिक व्यक्त यकृत microRNA - जबकि इसमाइक्रोआरएनए 7 के निम्नीकरण पैटर्न की भी विशेषता है। क्योंकि हम कई प्रयोगों में लगातार हमारे प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, हम नमूना तैयारी longitudinally निरीक्षण करने में सक्षम किया गया है, और देखते हैं कि वहाँ कोई स्पष्ट बैच प्रभाव हैं.

इस प्रोटोकॉल साझा करने में, हमारा लक्ष्य उपयोगकर्ताओं को उच्च गुणवत्ता उत्पन्न करने के लिए सक्षम करने के लिए है, लगभग किसी भी ऊतक या सेल लाइन में microRNAs के reproduible परिमाणीकरण, सस्ती उपकरण और अभिकर्मकों का उपयोग कर, और मुक्त bioinformatics उपकरण.

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Protocol

पशु प्रयोगों वाशिंगटन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अधिकृत किया गया.

छोटे आरएनए पुस्तकालय की तैयारी

1. आरएनए अलगाव

  1. एक मानक आरएनए अलगाव अभिकर्मक का उपयोग कर एक जैविक स्रोत से आरएनए अलग, या एक किट है कि microRNAs के लिए समृद्ध. ऊतकों के लिए, यह एक पूर्व ठंडा मोर्टार और मूसल का उपयोग कर एक पाउडर के लिए तरल नाइट्रोजन और जमीन में नमूने स्नैप-फ्रोज़न के साथ शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है।
  2. आरएनए की मात्रा निर्धारित करने और आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) प्रदान कर सकते हैं कि एक साधन पर प्रत्येक नमूने के आरएनए अखंडता को मापने। RINs होना चाहिए और 7.

2. 3' अनुकूलक लिगेशन

  1. पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों में एक लिगेशन प्रतिक्रिया तैयार करें, संयोजन के द्वारा: आरएनए के 11 डिग्री एल (1-3 डिग्री ग्राम, प्रत्येक नमूने के लिए एक ही राशि का उपयोग कर), 10x T4 आरएनए लिगे प्रतिक्रिया बफर के 1.5 $L, एटीपी मुक्त, 1 एथिलीन ग्लाइकोल (PEG) के 1 $L, और 3'link-link-linker के 0.5 डिग्री एल (100M यूनिवर्सल लिग्ना लिओनिंग) केर)।
    नोट: एटीपी की अनुपस्थिति miRNAs के लिए समृद्ध में मदद करता है और MRNA गिरावट उत्पादों की क्लोनिंग को कम करता है. खूंटी एक आणविक भीड़ एजेंट के रूप में कार्य करता है, सफल ligation बढ़ाने. यूनिवर्सल miRNA क्लोनिंग लिंकर है एक 3' अवरुद्ध समूह (amine) आत्म-लिगेशन को रोकने के लिए, परिपत्र, और 5' अंत में आरएनए के लिए लिगेशन.
  2. 30-40 s. 1 मिनट के लिए बर्फ पर कूल के लिए एक thermocycler पर 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने गरम करें 1 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा. टी 4 आरएनए लिगेज़ 2 के 1 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट 2 ज के लिए जेल तैयार (चरण 2.3) जबकि नमूने इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं।
    नोट: कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन लिंकर-लिंकर लिगेशन को रोकने में मदद करता है। हम भी सफलतापूर्वक T4 आरएनए लिगेस 1 का इस्तेमाल किया है।
  3. 8 एम यूरिया (एक 20x20 सेमी जेल के लिए) के साथ एक 15% polyacrylamide जेल के 30 एमएल तैयार करें: यूरिया के 14.4 ग्राम, 10x Tris के 3 एमएल-बफर एथिलीनडायमेनेटेरेटिक एसिड (टीबीई), 40% के 11.2 एमएल 19:1 acrylamide, और एच2ओ 30 एम एल के लिए। हल सबसे अच्छा 42 डिग्री सेल्सियस पर भंग कर दिया है। कास्टिंग से ठीक पहले, बहुलकीकरण के लिए 10% अमोनियम पर्सुलफेट (एपीएस) और 30 डिग्री सेल्सियस टेट्रामेथिलएथिलीनडियामाइन (टीईएमईडी) जोड़ें।
  4. एक प्लास्टिक डाली में 0.8 मिमी अलग कांच की प्लेटों के बीच डालो और कंघी डालें. एक बार जेल ठोस है (के बारे में 20 मिनट), टैंक के लिए 0.5x TBE जोड़ें और तेजी से pipeting द्वारा अवशिष्ट यूरिया के कुओं धोने.
  5. नमूने के बिना 25 मिनट के लिए एक निरंतर 375 वी पर जेल पूर्व चलाने के लिए तो यूरिया जेल में प्रवेश कर सकते हैं, तो कुओं फिर से धो लें.
    नोट: वोल्टेज की मात्रा बिजली की आपूर्ति और विद्युत फोरफोरोसिस प्रणाली है कि प्रयोग किया जाता है के प्रकार के आधार पर कम करने की आवश्यकता हो सकती है.
  6. एक बार नमूनों ligating किया जाता है, नमूनों के लिए acrylamide लोडिंग डाई के 15 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (एक 1:1 अनुपात के लिए), तो एक thermocycler पर 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए विकृत.
  7. 37 और 44 बीपी आकार मार्करों के 25 एनजी/जेडएल तैयार करें, एक भाग ऐक्रिलमाइड लोडिंग डाई के साथ पतला। अनुक्रम तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।
  8. polyacrylamide जेल पर नमूने लोड, प्रत्येक नमूने के बीच में कम से कम एक लेन छोड़ने. जेल अभिविन्यास का ट्रैक रखने के लिए एक असममित पैटर्न में, मार्करों के कम से कम दो सेट के 20 $L लोड करें।
  9. पहले 15 मिनट के लिए एक निरंतर 375 V पर जेल चलाने के लिए और फिर शेष रन के लिए एक निरंतर 425 V करने के लिए वृद्धि हुई है। ब्रोमोफेनोल ब्लू तक चलाएं नीचे से लगभग 1-4 सेमी है, जो लगभग 2 ज लेता है।
    नोट: यदि आवश्यक हो, जेल समय की एक लंबी अवधि के लिए एक कम निरंतर वोल्टेज पर चलाया जा सकता है जब तक ब्रोमोफेनोल नीले नीचे से 1-4 सेमी के बारे में है.
  10. एक प्लेट विभाजक का उपयोग कर कांच की प्लेटों से जेल निकालें, और एक प्लास्टिक पृष्ठ रक्षक पर जेल जगह है. 500 डिग्री सेल्सियस आसुत जल में एथिडियम ब्रोमाइड का 5 डिग्री सेल्सियस और पिपेट को शीर्ष प्रकाश नीले मार्कर के ठीक ऊपर मार्कर लेन पर (चित्र 1कदेखें) को देखें।
    चेतावनी: एथिडियम ब्रोमाइड के लिए दस्ताने का उपयोग करें और स्थानीय नियमों के अनुसार कचरे का निपटान करें। 5 मिनट के लिए बैठते हैं.
  11. पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत, साफ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर प्रत्येक लेन में ऊपरी से कम मार्कर के लिए जैल में कटौती (चित्र 1Aदेखें)। प्रयोगशाला सील फिल्म के एक 4 x 4 सेमी वर्ग के लिए स्थानांतरण, तो के बारे में 4 क्षैतिज कटौती और 3 खड़ी 12 छोटे वर्गों का उत्पादन करने के साथ जेल में कटौती (चित्र 1Bदेखें).
  12. सील फिल्म वर्ग पर 0.3 एम NaCl के Pipette 400 $L, और 1.5 एमएल सिलिकॉन ट्यूबों में कीप जेल टुकड़े (चित्र 1Cदेखें)। रात में चार डिग्री सेल्सियस पर एक नटेटर पर नमूने जगाओ।
    नोट: अन्य कम प्रतिधारण 1.5 एमएल ट्यूब सिलिकॉन ट्यूबों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के कम से कम 12 एच के बाद, नमूने पुनः प्राप्त करने और उन्हें बर्फ पर डाल दिया, 100% इथेनॉल की एक शंकु ट्यूब के साथ.
  14. एक नई ट्यूब के लिए supernatant के 400 $L स्थानांतरण, और फिर 100% इथेनॉल के 1 एमएल और 1 $L 15 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन coprecipitant जोड़ें। जितना संभव हो उतना सुपरनेटेंट इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे कताई और अधिक आवश्यक के रूप में पाइपिंग। -80 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 h, या 2 एच या उससे अधिक समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। Glycogen coprecipitant गोली दृश्यता और वसूली में सुधार.
  15. 20-30 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। इथेनॉल के सभी निशान निकालें और गोली हवा को 5 मिनट के लिए सूखने दें।

3. 5' लिंकर लिगेशन

  1. न्यूक्लेस-मुक्त जल के 6.5 डिग्री सेल्सियस में पाइपिंग द्वारा गोली को पुन: निलंबित करें। गोली पहले कुछ मिनट के लिए पानी में बैठने देने से फिर से निलंबन के साथ मदद मिलेगी.
  2. गोली नीचे कताई और पानी में ressinssकेश के बाद, जोड़ें 0.5 $L के 100 डिग्री एम 5'linker (बारकोड के साथ; तालिका 1देखें), टी 4 आरएनए लिगेज बफर के 1 $L, 10 एमएम एटीपी के 1 $L, और खूंटी के 1 $L. 30 s के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, तो बर्फ पर जगह है. टी 4 आरएनए लिगेज 1 का 1 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  3. 0ण्3 ड दक्क के 400 दल जोड़ें, जिसके बाद अम्ल फीनोल/क्लोरोफॉर्म का 400 डिग्री सेल्सियस का उपयोग किया गया है। भंवर 30 s - 1 मिनट (समाधान बादल दिखेगा), और फिर एक microcentrifuge में अधिकतम गति पर 10-15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ($17,000 x ग्राम). शीर्ष परत से ड्रा और नए 1.5 एमएल ट्यूब में जगह है।
    नोट: नीचे की परत के किसी भी पाइपिंग से बचें।
  4. क्लोरोफॉर्म, भंवर के 350 डिग्री सेल्सियस को संक्षेप में जोड़ें, और फिर अधिकतम गति पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें ($17,000 x g)। बाद में शीर्ष से ड्रा और नए 1.5 एमएल ट्यूब में जगह है। ग्लाइकोजन कोपरीपिटेंट का 1.5 डिग्री सेल्सियस और 100% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: फिर, नीचे की परत के किसी भी pipeting से बचें.
  5. भंवर संक्षेप में, तो कम से कम 1 एच, या -20 डिग्री सेल्सियस रात के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जगह है।

4. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी)

  1. 42 डिग्री सेल्सियस ऊष्मा ब्लॉक चालू करें. 20-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और $ 17,000 x ग्राम पर नमूनों स्पिन। सभी supernatant निकालें और गोली हवा 5 मिनट के लिए सूखी.
  2. न्यूक्लेस-मुक्त जल के 8.25 डिग्री एल में छेडदार नमूना फिर से निलंबित करें, फिर जोड़ें: 100 डिग्री एम आरटी प्राइमर (तालिका1) के 0.5 $L और एक सीडीएएनए संश्लेषण किट से 2x आरटी रिएक्शन मिक्स का 5 डिग्री एल। 3 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. प्रत्येक नमूने में 10x आरटी एंजाइम का 1.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और थर्मोसाइकिलर में 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें या हाइड्रोलिसिस और तटस्थीकरण के साथ जारी रखें।
    नोट: कई आरटी किट कदम 4.2 और 4.3 के लिए उपयोग किया जा सकता है.
  4. क्षारीय हाइड्रोलिसिस और उदासीनीकरण करें: 150 एमएल पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (केएच) घोल (150 डिग्री सेल्सियस के 1 एम KOH, 1 एम ट्रास बेस पीएच 7.5 का 20 डिग्री एल, और एच2ओ का 830 एमएल) और 1 50 एमएम हाइड्रोलिक एसिड (एचसीएल) के 150 एमएल (एचसीएल) 8एमएल और एचसीएल के 80 एमएल का 1एमएल बनाओ। H2हे की)
  5. नमूनों को जोड़ने से पहले, KOH समाधान को बेअसर करने के लिए आवश्यक एचसीएल की मात्रा निर्धारित करें। सामान्यतः एचसीएल का लगभग 20-24 डिग्री सेल्सियस KOH के 25 डिग्री सेल्सियस को निष्प्रभावी कर देगा। यह सुनिश्चित करने के लिए एक पीएच पट्टी पर संयोजन की जाँच करें सही रेंज में है (pH 7.0 करने के लिए 9.5).
  6. नमूनों को 150 एमएम KOH समाधान के 25 डिग्री एल जोड़कर और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. 7.0 और 9.5 के बीच एक अंतिम नमूना पीएच प्राप्त करने के लिए चरण 4.4 में निर्धारित 150 एमएम एचसीएल की मात्रा जोड़कर नमूनों को निष्क्रिय करें।

5. पीसीआर प्रवर्धन

  1. तटस्थीकरण के बाद, एक पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें: 29.5 डिग्री सेल्सियस पानी, 10x तक बफर के 5 डिग्री एल, डीएनटीपी के 1 डिग्री एल, 2 $M आगे प्राइमर के 2 $L (तालिका 1), 2 $L के 2 $L रिवर्स प्राइमर (तालिका1),ताक के 0.5 डिग्री एल, और रिवर्स जेडडीएनए के 10 डिग्रीएल चरण से 4.6. .
  2. निम्नलिखित पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएँ: 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, फिर 45 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 20 चक्र, 75 s के लिए 50 डिग्री सेल्सियस और 60 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
  3. चरण 5-2 से 5 डिग्री सेल्सियस उत्पाद का उपयोग करके लगभग 2-4 अधिक चक्रों की दूसरी PCR प्रतिक्रिया चलाएँ. Mix: 34.8 $L पानी, 10x Tak बफर के 5 $L, dNTP के 1 $L, 25 $M आगे प्राइमर के 1 $L (तालिका 1), 25 डिग्री एम रिवर्स प्राइमर के 1 $L (तालिका1), और ताक पॉलिमरेज के 0.2 डिग्री एल। चरण 5.2 में दिए गए समान थर्मोसाइकिलर पैरामीटर का पालन करें.
    नोट: दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं करने का उद्देश्य - 20 चक्र के लिए पहले और सिर्फ 2-4 अधिक के लिए दूसरा के साथ - यह सुनिश्चित करना है कि cDNA प्रवर्धित की राशि एक गतिशील रेंज में है (यानी, नहीं एक संतृप्त राशि).

6. Agarose जेल शुद्धि

  1. कम पिघल agarose के साथ एक 4% agarose जेल तैयार करें. लोड 40 $L या अधिक पीसीआर उत्पाद के जेल पर, लोड हो रहा है डाई के साथ. लोड 100 बीपी और 25 बीपी आकार मार्करों.
    नोट: 25 बीपी सीढ़ी linker-linker लिगिंग उत्पादों से प्रवर्धित उत्पाद भेद करने में मदद करता है। कम पिघल agarose जैल पारंपरिक agarose जैल की तुलना में अधिक से अधिक देखभाल के साथ डाली जानी चाहिए, तो बारीकी से निर्माता से निर्देशों का पालन करें.
  2. जेल निष्कर्षण के लिए, जेल पर दिखाई देता है, लेकिन संतृप्त नहीं है कि चक्र संख्या का चयन करें (आमतौर पर 22-24 चक्र). एकाधिक नमूने चल रहा है जब इसी तरह की तीव्रता बैंड चुनें.
  3. 125 बीपी बैंड से ऊपर का बैंड काटें (25 बीपी सीढ़ी पर गहरा बैंड; चित्र 1Dदेखें )। एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करना, एक 4% जेल के आधार पर बफर जोड़ने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें, तो कमरे के तापमान पर बफर में agarose भंग करने के लिए हिला.
    नोट: 55 डिग्री सेल्सियस पर भंग लिंकर-लिंकर लिगेशन के लिए क्षमता बढ़ जाती है।
  4. निर्माता के जेल निष्कर्षण निर्देशों का पालन करें और elution बफर या पानी के 30 डिग्री एल में elute. यदि उत्पाद जेल पर कमजोर देखा, तो elution को कम करने के लिए 20 $L.
  5. एक संवेदनशील तकनीक का उपयोग कर CDNA एकाग्रता उपाय, और अनुक्रमण के लिए नमूना पुस्तकालय तैयार करते हैं। तैयारी उपयोग किए गए अनुक्रमण के प्रकार पर निर्भर करेगा।
    नोट: अनुक्रमण लायब्रेरी के लिए न्यूनतम आवश्यकताएँ आम तौर पर 10 $L वॉल्यूम 10 $M उत्पाद की हैं। सांद्रता बहुत कम कर रहे हैं, पूल और इथेनॉल वांछित एकाग्रता के लिए पुस्तकालय लाने के लिए नमूने वेग।
  6. उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर नमूने अनुक्रम. एक आम उदाहरण के लिए एक किट का उपयोग कर नमूने को चलाने के लिए किया जाएगा 50 bp एकल पढ़ता, प्राप्त करने के लिए लगभग 15-25 लाख एक FASTQ आउटपुट स्वरूप में पढ़ता है.

लघु आरएनए अनुक्रम संरेखण और जैव सूचना विज्ञान

7. डेटा अपलोड

  1. प्रत्येक अनुक्रमण रन से उत्पन्न FASTQ फ़ाइलें डाउनलोड करें। miRbase.org 8,9,10से microRNA हेयरपिन दृश्यों की एक सूची डाउनलोड करें .
  2. www.usegalaxy.org पर एक आकाशगंगा खाता उत्पन्न और अनुक्रम की एक FASTQ फ़ाइल अपलोड इस खाते में पढ़ता है.
  3. गैलेक्सी खाते में बारकोड अनुक्रमों की एक पाठ फ़ाइल अपलोड करें, जैसे कि बारकोड.txt, जो एक टेक्स्ट फ़ाइल (पूरकतालिका 1)के रूप में उपलब्ध है.
  4. miRBase.org की तरह एक डेटाबेस से आकाशगंगा खाते में microRNA hairpins की एक FASTA फ़ाइल अपलोड करें. माउस के उदाहरण (mousehairpins.fa) या मानव (humanhairpins.fa) microRNA अग्रदूतों अनुपूरक तालिका 2 और अनुपूरक तालिका 3में प्रदान की जाती हैं.

8. अनुकूलक हटाने, बारकोड सॉर्ट, और ट्रिम

  1. बाएँ हाथ टैब में, जीनोमिक फ़ाइल हेरफेर करने के लिए नेविगेट करने के लिए , FASTA/FASTQ gt; क्लिप एडाप्टर दृश्यों।
  2. FASTA या FASTQ प्रारूप में इनपुट फ़ाइलमें, ड्रॉप-डाउन सूची से FASTQ फ़ाइल दर्ज करें। न्यूनतम अनुक्रम लंबाई को 18 में बदलें. कस्टम अनुक्रम दर्जकरने के लिए स्रोत बदलें | CTGTAGGCदर्ज करें | अन्य सभी डिफ़ॉल्ट पैरामीटर रखें। निष्पादितकरें क्लिक करें.
    नोट: अनुक्रम पढ़ता है कि 18 न्यूक्लिओटाइड से कम कर रहे हैं microRNAs करने के लिए विशिष्ट रूप से मैप करने के लिए मुश्किल है और कई गिरावट उत्पादों होते हैं.
  3. बाएँ हाथ टैब में, जीनोमिक फ़ाइल हेरफेर करने के लिए नेविगेट करने के लिए , FASTA/FASTQ gt; बारकोड स्प्लिटरकरने के लिए।
    नोट: आकाशगंगा कार्यों और हेडर समय-समय पर अद्यतन कर रहे हैं, तो खोज समारोह एक समकक्ष उपकरण या उसके स्थान को खोजने के लिए आवश्यक हो सकता है। अनुक्रमणित प्राइमर का उपयोग वाणिज्यिक किट अक्सर पहले से ही बारकोड द्वारा क्रमबद्ध हैं. इसलिए, यह चरण और बारकोड ट्रिम चरण आवश्यक नहीं हैं यदि एक वाणिज्यिक किट से प्रारंभ कर रहा है।
  4. बारकोड का उपयोग करने केलिए, barcodes.txtको इंगित करें. लाइब्रेरी को विभाजित करने केलिए, पिछले चरण में उत्पादित डेटा फ़ाइल पर क्लिप का उपयोग करें. अनुमत बेमेल की संख्यामें , 1दर्ज करें . निष्पादितकरें क्लिक करें.
  5. पहले 4 न्यूक्लियोटाइड्स ट्रिम करें: पाठ हेरफेर करने के लिए नेविगेट करें और प्रमुख या पीछे के पात्रोंको ट्रिम करें। इनपुट डेटासेटके लिए, फ़ोल्डर चिह्न पर क्लिक करें, जो एक डेटासेट संग्रह है. नमूने के बैच फ़ाइल का चयन करें, जो डेटा पर लेबल बारकोड विभाजकशामिल हैं। इस स्थिति तक की शुरुआत से ट्रिम में, 5दर्ज करें . में क्या इनपुट डेटासेट FASTQ स्वरूप में है? हाँदर्ज करें| निष्पादितकरें क्लिक करें. निष्पादन में कुछ मिनट लग सकते हैं.

9. microRNAs को पढ़ता का संरेखण

  1. आकाशगंगा में, जीनोमिक्स विश्लेषण करने के लिए नेविगेट करें ; आरएनए-सेक और सेलफिश प्रतिलिपि मात्रा 11|
  2. प्रश्न के लिए अपने इतिहास से किसी संदर्भ ट्रांसक्रिंटोम का चयन करें या अंतर्निहित अनुक्रमणिका का उपयोग करें? इतिहास से एक का उपयोग करें का चयन करें. ड्रॉप-डाउन सूची से अपलोड की गई फ़ाइल mousehairpins.fa दर्ज करें. FASTA/Q फ़ाइल में, डेटासेट संग्रह का उपयोग करने के लिए फ़ोल्डर चिह्न क्लिक करें और संग्रह पर ट्रिमशामिल फ़ाइल का चयन करें। निष्पादितकरें क्लिक करें. निष्पादन में कुछ मिनट लग सकते हैं.
  3. सही पर इतिहास टैब में, संग्रह पर Sailfish पर क्लिक करें ... प्रत्येक अलग-अलग फ़ाइल पर क्लिक करें और स्थानीय कंप्यूटर पर सहेजने के लिए डिस्क चिह्न क्लिक करें। व्यक्तिगत रूप से डाउनलोड की गई फ़ाइलों को पहले असंपीड़ित होने की आवश्यकता है। उन्हें स्प्रैडशीट में आयात करने के उद्देश्य से .txt एक्सटेंशन से फिर से सहेजने की आवश्यकता हो सकती है.
  4. प्रत्येक स्प्रेडशीट फ़ाइल में खोलें और उपचार की स्थिति के लिए NumReads स्तंभ को फिर से नाम दें। पहले स्तंभ में microRNAs का मैट्रिक्स जनरेट करें और बाद के स्तंभों में प्रति शर्त गणना पढ़ने के लिए स्तंभों को एक साथ मर्ज करें।
  5. प्रत्येक उपचार की स्थिति के लिए अंतर व्यक्त microRNAs की गणना करने के लिए, कच्चे microRNA पढ़ने के साथ फ़ाइल का उपयोग ऐसे DESeQ212के रूप में कार्यक्रमों के लिए इनपुट के रूप में मायने रखता है. DESeQ2 आकाशगंगा में जीनोमिक्स विश्लेषण में मौजूद है , आरएनए-सेक gt; DESeQ2 टैब.
  6. परिवर्तित कच्चे पढ़ता है सामान्यीकृत microRNA पढ़ने की गिनती के लिए. गणना निम्न गणना के माध्यम से पुस्तकालय के पुस्तकालय अनुक्रम गहराई के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं: [(रॉ पढ़ता है / कुल microRNA पढ़ता है) * (1,000,000 - microRNAs गिना की संख्या) + 1].
    नोट: यह गणना एक सामान्यीकृत प्रति मिलियन (RPM) मैप microRNAs जो डेटासेट और जैविक स्थितियों में तुलना की जा सकती है पढ़ता है प्रदान करता है। आउटपुट एक टैब सीमांकित फ़ाइल है। Sailfish एक tpm उत्पादन स्तंभ प्रदान करता है, हालांकि इस मूल्य microRNA hairpin लंबाई है, जो इस संदर्भ में आवश्यक नहीं है द्वारा सामान्यीकृत है.
  7. यदि प्रासंगिक हो, तो कस्टम इनपुट अनुक्रमों (उदा., एक सदिश) के साथ संरेखण दोहराएँ, ताकि वह मैप उसकी पहचान कर सके, जैसे shRNAs.

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Representative Results

पुस्तकालय की तैयारी में शामिल कदमों की योजना
चित्र 2में छोटे आरएनए निष्कर्षण, अनुक्रमण और संरेखण का एक समग्र योजनाबद्ध रूपरेखा दी गई है।
एक पुरुष और एक मादा माउस से जिगर के नमूने एकत्र किए गए और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए स्नैप किए गए। कुल आरएनए निकाला और गुणवत्ता और एकाग्रता के लिए मूल्यांकन किया गया था.

छोटे आरएनए अनुक्रमण अनुक्रमण अनुक्रमण के लिए पर्याप्त आरएनए पैदावार
3 दो स्वतंत्र आरएनए निष्कर्षणों से आरएनए के 3 डिग्री छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया गया. नमूने एक ऐक्रिलमाइड जेल पर चलाए गए थे और आरएनए के 17-28 nt के अनुरूप आकार मार्करों के बीच काट दिए गए थे (चित्र 1क) . नमूने आरएनए अलगाव के लिए टुकड़ों में काट दिए गए थे (चित्र 1 ख) और एक कम प्रतिधारण 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया ( चित्र1C) . बारकोड बीसी 7 और बीसी 17 (सारणी 1) छोटे आरएनए के 5 के अंत तक ली गई थी। छोटे आरएनए पुस्तकालयों पीसीआर के 22 चक्रों का उपयोग कर क्रमशः 8.0 और 11.2 एनजी/जेडएल उत्पाद उपज के लिए पीसीआर प्रवर्धित किया गया। नमूने जमा किए गए थे और एक 10 एनएम जमा नमूना एक 50 बीपी पढ़ने की लंबाई का उपयोग कर उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया गया था।

MIR-122 माउस जिगर में सबसे प्रचुर मात्रा में microRNA है
बारकोड छँटाई के बाद, 851,931 जिगर नमूना 1 और जिगर नमूना 2 से 650,154 से बारकोड निहित पढ़ता है. में से, 83.5% और 90.0% क्रमशः microRNAs के लिए मैप, शेष के साथ rRNAs के लिए मानचित्रण पढ़ता (1.8% और 0.6% क्रमशः), tRNAs और MRNA गिरावट टुकड़े. मानव microRNA hairpins के लिए संरेखण के बाद, हम microRNA प्रत्येक प्रतिकृति में गिनती पढ़ने के बीच मजबूत सामंजस्य मनाया (आर2 $ 0.998; चित्र 3) . कुल 306 microRNA प्रजातियों का पता लगाया गया, miR-122 (पूरकतालिका 4) के लिए मानचित्रण की सबसे बड़ी संख्या के साथ. MicroRNA बहुतायत पुरुष और महिला जिगर के नमूनों के बीच समान था.

Figure 1
चित्र 1. एक acrylamide जेल से छोटे आरएनए का निष्कर्षण। (ए) ऐक्रिलमाइड जेल और क्षेत्र जो माइक्रोआरएन के आकार के अनुरूप काटा जाता है। (बी) जेल के टुकड़े छोटे टुकड़ों में काटने से पहले और बाद में। (ग) सिलिकॉनीकृत ट्यूबों में जेल के टुकड़े स्थानांतरित करने की प्रक्रिया। (डी) कम-मेल्ट अगारोस जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया लिंकर-लिंकर उत्पाद और असंतृप्त (22 चक्र) बनाम संतृप्त (24 चक्र) नमूनों की तुलना में सही क्लोन उत्पाद का प्रदर्शन करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. प्रोटोकॉल की योजना. प्रक्रिया में शामिल प्रमुख चरणों को दर्शाने वाली एक समयरेखा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. दो स्वतंत्र आरएनए निष्कर्षणों से परिणामों की पुन: उत्पादनीयता। microRNA के स्कैटरप्लॉट एक पुरुष माउस जिगर से गिना जाता है (x-अक्ष) एक महिला माउस जिगर के साथ तुलना में (y-अक्ष) एक log10-आधारित पैमाने का उपयोग कर. प्रत्येक बिंदु प्रत्येक व्यक्ति microRNA के लिए प्रति मिलियन (RPM) मैप microRNA गिनती पढ़ता का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमर अनुक्रम
3' लिंकर 1 RAPPGTGTAGGCACCATCAAT-NH2
निम्न आमाप चिह् नक rArUrCrCrCrUrGrCrCrCrGrUrUrUrUrRagTAACCCATGCGTC
उपरि आमाप चिह् नक rArArUrCrArGrCrGrGrGrGrUrUrGrArArCrGrUrArArArGTAACCCATCATGCGCC
बारकोड1 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTCrRG
बारकोड2 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCCCrCrGrUrC
बारकोड3 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCCCrCrUrGrG
बारकोड4 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTCrUrU
बारकोड5 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTrGrGrU
बारकोड6 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTGrUrA
बारकोड7 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTruUrG
बारकोड8 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTCrGrGrC
बारकोड9 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTCrCrArG
बारकोड10 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTraURArC
बारकोड11 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTCrUrCrU
बारकोड12 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCCTrCrArU
बारकोड13 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTraArGrA
बारकोड14 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTruGrA
बारकोड15 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTruGrGG
बारकोड16 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTTArUrG
बारकोड17 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTCrUrU
बारकोड18 /5AmMC6/ACGCTCTCCGATCTGrGrUrU
आरटी प्राइमर ATTGATGGTGCCTACAG
पीसीआर प्राइमर एफ AATGATACGGCGACCGAGATTCTACTACCTCCTACTCCGCTCTCT
पीसीआर प्राइमर आर कैगकागागगगकाचगगगसीटीसीटीसीटीसीटीगगटगटगगटजीसीटीकाग

तालिका 1. प्राइमर की सूची.

पूरक तालिका 1. बारकोड दृश्यों की सूची. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2. माउस microRNA अग्रदूत दृश्यों की Curated सूची. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 3. मानव microRNA अग्रदूत दृश्यों की Curated सूची. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 4. कच्चे और सामान्यीकृत microRNA पढ़ें मायने रखता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

20 साल पहले13से अधिक microRNAs की पहचान के बावजूद , microRNA अनुक्रमण की प्रक्रिया कठिन बनी हुई है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, नियमित रूप से घर में प्रोटोकॉल14अपनाने से प्रयोगशालाओं में बाधा . अन्य तकनीकों को एक साथ microRNA मूल्यांकन कर सकते हैं, microRNA microarrays और multiplexed अभिव्यक्ति पैनलों की तरह; हालांकि, इन दृष्टिकोणों में सीमित हैं कि वे केवल अपने जांच सेट में मौजूद microRNAs मात्रा. इस वजह से, वे छोटे आरएनए अनुक्रमण की महत्वपूर्ण विशेषताओं को याद करते हैं, उपन्यास microRNAs की पहचान की तरह, और microRNA isoforms - न्यूक्लिओसाइड परिवर्तन है कि महत्वपूर्ण जैविक समारोह6,7,15 हो सकता है .

एक नया प्रयोग शुरू करते समय, एक वाणिज्यिक विक्रेता का उपयोग अक्सर आसान है क्योंकि वे तकनीकी सहायता और उपयोग में आसानी प्रदान करते हैं. कई वाणिज्यिक विकल्प microRNA अनुक्रमण के लिए उपलब्ध हैं, जो काम का बोझ को कम करने के लिए multiplexed किया जा सकता है जब बड़ी संख्या में प्रसंस्करण (gt; 100) नमूने की. इन वाणिज्यिक किट लगातार सुधार किया जा रहा है, जो दोनों एक लाभ और नुकसान है. एक तरफ, कंपनियों को जो इन किट बनाने उपन्यास microRNA कब्जा तरीकों विकसित किया है, उदाहरण के लिए, अनुक्रमण से पहले उनके 5 और 3 समाप्त होता है के परिपत्र के माध्यम से या प्रत्येक अंत में यादृच्छिक दृश्यों के साथ अपभ्रष्ट linkers का उपयोग करने के लिए लिगेशन पूर्वाग्रह को कम. उन्होंने एडेप्टर-डिमर्स को हटाने के लिए भी तरीके विकसित किए हैं, उदाहरण के लिए, डबल-स्लेड एडेप्टर के लिगेशन के माध्यम से या पूरक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के संकरीकरण के माध्यम से। दूसरी ओर, वाणिज्यिक किट संशोधन या किसी भी कदम के परिवर्तन के खिलाफ सलाह देते हैं. इसलिए, यदि किसी भी अद्यतन एक किट के लिए बना रहे हैं, यह मुश्किल या किट के पुराने और नए संस्करणों से व्युत्पन्न डेटा की तुलना करने के लिए असंभव है, साथ ही विभिन्न वाणिज्यिक विक्रेताओं से किट से प्राप्त डेटा. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि वाणिज्यिक विकल्प के चेहरे में सत्ता में रह गया है वर्णित है. जेल शुद्धि कदम पर हमारा ध्यान - जब कि वे प्रोटोकॉल के लिए समय जोड़ने - लगातार microRNA कब्जा और कई वर्षों हम इसे इस्तेमाल किया है पर reproducibility सक्षम बनाता है. वाणिज्यिक किट और घर में प्रोटोकॉल के बीच reproducibility के कई मूल्यांकन किए गए हैं, और हम इन अध्ययनों में से कुछ को देखें16,17,18,19. महत्वपूर्ण बात, कदम हम microRNAs के bioinformatics विश्लेषण के लिए रूपरेखा किट या घर में प्रोटोकॉल के चुनाव की परवाह किए बिना नियोजित किया जा सकता है.

MicroRNA अनुक्रमण अक्सर बारकोड के चुनाव से परेशान है: कुछ मामलों में, विभिन्न बारकोड के लिगेशन दक्षता बराबर नहीं हो सकता है, नमूनों में अनुक्रम के पक्षपाती वितरण के लिए अग्रणी20. अब यह सिफारिश की जाती है कि विशिष्ट माइक्रोआरएन 21,22के लिगिंग पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए 5 और 3 छोर पर अपभ्रष् ट आधारों का उपयोग किया जाए . इस प्रोटोकॉल में, हमने इन लिगिंग मुद्दों का पालन नहीं किया है और विभिन्न बारकोड5,6,7,23के साथ मूल्यांकन किए गए तकनीकी और जैविक प्रतिकृतियां के लिए संगत रीडआउट देखे हैं , लेकिन यह उनके बारे में पता होना महत्वपूर्ण है. लिगेशन बायस से बचने के तरीकों में पीसीआर प्राइमर में इंडेक्स प्राइमर का समावेश शामिल है, या 5 अनुकूलक अनुक्रम के 3 छोर पर एक या अधिक यादृच्छिक आरएनए न्यूक्लिओसाइड जोड़ने के लिए (तालिका 1)। एक या अधिक सिंथेटिक स्पाइक-इन आरएनए का परिचय, जैसे सी एलिगन miR-39 microRNA24,सामान्यीकरण उद्देश्यों के लिए भी एक विकल्प है, जो कम उपज स्थितियों के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे एक्सोसोम से माइक्रोआरएन की मात्रा निर्धारित करना। इसी प्रकार, आरएनए लिगेशन के लिए हमने टी4 आरएनए लिगेस 1 का सफलतापूर्वक उपयोग किया है, लेकिन कम पूर्वाग्रह के साथ लिगेशन का प्रदर्शन टी4 आरएनए लिगेस 225के एक छोटा-सा रूप के लिए किया गया है। अंत में, Superscripts III और चतुर्थ वैकल्पिक रिवर्स प्रतिलेखन एंजाइमों कि हम मुद्दे के बिना इस्तेमाल किया है.

microRNA डेटाबेस की पसंद भी अंतिम सामान्यीकृत परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं. microRNA डेटाबेस के इलाज के साथ एक चुनौती यह है कि कई उपन्यास छोटे RNAs microRNAs के रूप में सूचीबद्ध वास्तव में दोहराने तत्वों के टुकड़े कर रहे हैं और नहीं सदाशयी microRNAs2. microRNAs कि मानक मानदंडों के अनुरूप नहीं है रिटायर करने के लिए प्रयास किए गए हैं, ताकि एक microRNA डेटाबेस के अगले संस्करण और अधिक परिष्कृत है; हालांकि, अगले पुनरावृत्ति भी पुष्टि की जरूरत है कि नए उम्मीदवारों में शामिल हैं। जब दोहराने व्युत्पन्न microRNAs संरेखण में शामिल हैं, वे परिणाम तिरछा और मौजूदा microRNAs से डेटा डूब सकते हैं. इसलिए, विभिन्न प्रजातियों से माइक्रोआरएन के सुविख्यात डेटासेट का उपयोग आवश्यक है26,27। हमने छोटे आरएनए अनुक्रमण को संरक्षित माइक्रोआरएन की क्यूरेट की गई सूचियों के साथ संरेखित करते समय सबसे अधिक पुनरुत्पादनीयता का अनुभव किया है और इन हेयरपिनों को अनुपूरक सारणी 2 और अनुपूरक तालिका 3में शामिल किया है। इन सूचियों में मानव जीनोम2,26में लगभग 500 उच्च विश्वास माइक्रोआरएन के अनुमानों से मेल खाता है .

किसी भी तकनीक के साथ के रूप में, परिणाम एक लंबकोणीय दृष्टिकोण के साथ की पुष्टि की जानी चाहिए. हमने छोटे आरएनए अनुक्रमण परिणामों को सफलतापूर्वक पुनरुत्पादित किया है जिसमें छोटे आरएनए उत्तरी ब्लॉट्स शामिल हैं , जो उम्मीदवार माइक्रोआरएन6,7,23के आकार और सापेक्ष बहुतायत की पुष्टि करने के लिए रेडियो लेबल वाली जांच को शामिल करते हैं . विभाजित पढ़ने अनुक्रमण का उपयोग microRNAs की मात्रात्मक पीसीआर, और लक्ष्य MRNA परिवर्तन की पुष्टि QPCR और पश्चिमी blotting का उपयोग कर सत्यापन के लिए अन्य विकल्प हैं.

सारांश में, हम अलग करने के लिए एक विधि प्रदान की है और microRNAs अनुक्रम और मौजूदा microRNA डेटाबेस के खिलाफ संरेखण प्रदर्शन. अभिकर्मकों और उपकरणों की सामर्थ्य और विश्लेषण के लिए खुले स्रोत उपकरणों के उपयोग को इस प्रोटोकॉल को किसी के लिए भी सुलभ बनाना चाहिए। अंत में, इस प्रोटोकॉल किसी भी ऊतक या सेल लाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है उच्च reproduible उपज, उच्च गुणवत्ता पढ़ता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम मार्गदर्शन और सुझावों के लिए एंड्रयू फायर और मार्क Kay की प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 bp DNA ladder NEB N3231
19:1 bis-acrylamide Millipore Sigma A9926
25 bp DNA step ladder Promega G4511
Acid phenol/chloroform ThermoFisher AM9720
Acrylamide RNA loading dye ThermoFisher R0641
Ammonium persulfate (APS) Biorad 161-0700
Bioanalyzer instrument Agilent G2991AA For assessing RNA quality and concentration
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Ethanol (100%) Sigma E7023
Gel Loading Buffer II ThermoFisher AM8547
GlycoBlue ThermoFisher AM9516 Blue color helps in visualizing pellet
HCl Sigma 320331
KOH Sigma P5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm Genesee 45-109
miRVana microRNA isolation kit ThermoFisher AM1560
miSeq system Illumina SY-410-1003 For generating small RNA sequencing data
NaCl Fisher Scientific S271-500
Nusieve low-melting agarose Lonza 50081
Parafilm (laboratory sealing film) Millipore Sigma P7793
Poly-ethylene glycol 8000 NEB included with M0204
ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit NEB E6560S
QIAquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Qubit Fluorometer ThermoFisher Q33226 For quantifying DNA concentration
Qubit RNA HS Assay kit ThermoFisher Q32855
Razor Blades Fisher Scientific 12640
Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes Fisher Scientific 02-681-331
T4 RNA ligase 1 NEB M0204
T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q NEB M0351S
TapeStation Agilent G2939BA For assessing RNA quality and concentration
Taq DNA Polymerase NEB M0273X
TEMED Biorad 161-0800
Tris Base pH 7.5 Sigma 10708976001
Tris-buffered EDTA Sigma T9285
Trizol ThermoFisher 15596026
UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) Invitrogen 15585-011
Universal miRNA cloning linker NEB S1315S
Urea Sigma U5378

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References

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