Summary
여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.
Abstract
모든 인간 적인 전사체의 반은 microRNAs에 의해 통제되기 위하여 생각됩니다. 따라서 microRNA 발현을 정량화하면 질병 상태의 기본 메커니즘을 밝히고 치료 대상 및 바이오마커를 제공할 수 있습니다. 여기서는 마이크로RNA를 정확하게 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 간단히 말해서, 이 방법은 microRNAs를 분리하고, 고처리량 시퀀싱에 적합한 어댑터에 합착하고, 최종 제품을 증폭하고, 샘플 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이어서, 얻어진 시퀀싱 읽기를 마이크로RNA 헤어핀에 정렬하고, 정량화, 정규화 및 차등 발현을 계산하는 방법을 설명한다. 다재다능하고 견고한 이 결합된 실험 워크플로우와 생물정보학 분석을 통해 사용자는 조직 추출을 시작하고 microRNA 정량화로 마무리할 수 있습니다.
Introduction
1993년에 처음발견된 1, 현재 거의 2000개의 마이크로RNA가 인간 게놈2에존재하는 것으로 추정된다. MicroRNAs는 전형적으로 21-24 뉴클레오티드 긴 작은 비코딩 RNA입니다. 그(것)들은 단백질 발현을 억압하고 mRNA를 저하시키기 위하여 표적 유전자의 3-번역되지 않은 지역 (3-UTR)에 있는 상보적인 사이트에 수시로 결합하는 유전자 발현의 사후 전사 조절자입니다. 마이크로RNA를 정량화하면 유전자 발현에 대한 귀중한 통찰력을 제공할수 있으며 이 목적을 위해 여러 프로토콜이 개발되었습니다 3.
당사는 작은 RNA 시퀀싱을 위한 정의되고 재현 가능하며 오래 지속되는 프로토콜을 개발했으며, 오픈 소스 생물정보학 도구를 사용하여 정규화된 판독을 분석했습니다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 내인성 microRNAs와 외인성 으로 마이크로RNA 와 같은 종을 생성하는 생성물 모두를 동시에 식별할 수 있게 하는 동시에, 리보솜 RNA를 포함한 다른 작은 RNA 종에 대한 지도를 최소화하는 동시에 ( rRNA), RNA 유래 작은 RNA(tsRNAs), 반복 유래 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물을 전달한다. 다행히, microRNAs는 5-인산화 및 2-3 하이드록시레이트4,이러한 다른 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물로부터 이들을 분리하는 데 활용할 수 있는 특징이다. 종종 멀티플렉스에 더 빠르고 쉽게 마이크로RNA 복제 및 시퀀싱을 위한 몇몇 상업적인 선택권존재; 그러나 키트 시약의 독점적 특성과 빈번한 수정으로 인해 샘플 실행을 비교하기가 어렵습니다. 우리의 전략은 아크릴아미드와 아가로즈 젤 정제 단계를 통해 정확한 크기의 마이크로RNA만 수집을 최적화합니다. 이 프로토콜에서는 오픈 소스 도구를 사용하여 시퀀스 읽기를 microRNAs에 정렬하는 절차도 설명합니다. 이 지침 세트는 라이브러리 준비 방법또는 상용 방법이 사용되는지 여부에 관계없이 초보자 정보학 사용자에게 특히 유용합니다.
이 프로토콜은 여러 출판 된 연구에서 사용 되었습니다. 예를 들어, Dicer 효소가 줄기 루프 구조의 내부 루프로부터 2개의 뉴클레오티드의 거리에서 작은 헤어핀 RNA를 절단하는 메커니즘을 식별하기 위해사용되었다 - 소위 "루프 카운팅 규칙"5. 우리는 또한 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 (rAAv)에서 발현된 전달된 작은 머리핀 RNAs (shRNA)의 상대적인 풍부를 확인하기 위하여 이 방법을 따랐습니다, 간 이전에 용납될 수 있는 shRNA 발현의 임계값을 확인하기 위하여 과잉 shRNA 발현과 관련된 독성6. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 또한 microRNA-122의 부재에 반응하는 간에서 microRNA를 확인했습니다 - 고도로 발현된 간microRNA - 또한 이 microRNA 7의 분해 패턴을 특성화하는 동안. 우리는 수많은 실험에서 우리의 프로토콜을 일관되게 사용했기 때문에, 우리는 종로적으로 견본 준비를 관찰하고, 확인할 수 있는 배치 효력이 없다는 것을 볼 수 있었습니다.
이 프로토콜을 공유하는 우리의 목표는 사용자가 저렴한 장비 및 시약, 무료 생물 정보학 도구를 사용하여 거의 모든 조직 또는 세포주에서 microRNAs의 고품질, 재현 가능한 정량화를 생성 할 수 있도록하는 것입니다.
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Protocol
동물 실험은 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
작은 RNA 라이브러리 준비
1. RNA 격리
- 표준 RNA 격리 시약 또는 마이크로RNA를 농축하는 키트를 사용하여 생물학적 공급원으로부터 RNA를 분리합니다. 조직의 경우 액체 질소에서 스냅 냉동 시료로 시작하여 미리 냉각 된 모르타르와 유봉을 사용하여 분말로 분쇄하는 것이 가장 좋습니다.
- RNA를 정량화하고 RNA 무결성 번호(RIN)를 제공할 수 있는 기기에서 각 샘플의 RNA 무결성을 측정합니다. Rin은 >7이어야 합니다.
2. 3' 어댑터 결찰
- PCR 스트립 튜브에서 결찰 반응을 준비: RNA 11 μL (1-3 μg, 각 샘플에 대해 동일한 양을 사용), 1.5 μL의 10x T4 RNA 리가제 반응 완충제, ATP 무료, 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG) 1 μL, 및 0.5 μL의 3'링커 (100m 00ml 커)를 참조하십시오.
참고: ATP가 없으면 miRNA를 풍부하게 하고 mRNA 분해 제품의 복제를 최소화할 수 있습니다. PEG는 분자 군중 에이전트의 역할을, 성공적인 결찰을 강화. 범용 miRNA 클로닝 링커는 5' 말단에서 RNA에 대한 자가 결찰, 순환화 및 결찰을 방지하기 위해 3' 차단기(amine)를 가지고 있다. - 샘플을 30-40초 동안 열자전거에 95°C에서 가열합니다. 1 분간 얼음에 냉각. T4 RNA ligase 2의 1 μL을 추가하고 2 시간 동안 실온에서 배양하십시오.
참고 : 실온에서 의 인큐베이션은 링커 링커 결찰을 방지하는 데 도움이됩니다. 우리는 또한 성공적으로 T4 RNA 리가제 1을 사용했습니다. - 8 M 우레아 (20x20 cm 젤의 경우)와 15 % 폴리 아크릴 아미드 젤의 30 mL을 준비 : 14.4 g의 요소, 10 x 트리스 완충제 에틸렌디아 미네 테 아세트산 (TBE),11.2 mL 의 40 % 19 : 1아크릴아미드, H 20. 용액은 42°C에서 가장 잘 용해됩니다. 주조 직전에, 중합을 위해 10% 황황산 암모늄(APS)과 테트라메틸틸렌디아민(TEMED)의 30 μL을 첨가합니다.
- 플라스틱 주조에 0.8mm 분리 된 유리 판을 붓고 빗을 삽입하십시오. 겔이 고화되면 (약 20 분), 0.5 x TBE를 탱크에 넣고 활발하게 파이펫팅하여 잔류 우레아의 우물을 씻습니다.
- 우레아가 젤에 들어갈 수 있도록 샘플없이 25 분 동안 일정한 375 V에서 젤을 미리 실행한 다음 우물을 다시 씻으십시오.
참고: 사용되는 전원 공급 장치 및 전기 동공 시스템의 유형에 따라 전압양을 줄여야 할 수 있습니다. - 시료가 결찰이 완료되면, 15 μL의 아크릴아미드 로딩 염료를 샘플에 추가한 다음(1:1 비율의 경우), 열순환기에서 95°C에서 5분 동안 변성합니다.
- 한 부분아크릴아미드 로딩 염료로 희석한 37 및 44bp 크기의 마커 25ng/μL을 준비합니다. 시퀀스는 표1에 나열됩니다.
- 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 로드하여 각 샘플 사이에 적어도 하나의 레인을 남깁니다. 젤 방향을 추적하기 위해 비대칭 패턴으로 적어도 두 세트의 마커를 20 μL로드하십시오.
- 처음 15분 동안 일정한 375V에서 겔을 실행한 다음 나머지 실행에 대해 일정한 425V로 증가시다. 브로모페놀 블루가 바닥에서 약 1-4cm가 될 때까지 달리면 약 2시간이 걸립니다.
참고: 필요한 경우, 브로모페놀 블루가 바닥에서 약 1-4cm가 될 때까지 더 낮은 일정한 전압으로 겔을 실행할 수 있다. - 플레이트 세퍼레이터를 사용하여 유리 판에서 젤을 제거하고 플라스틱 페이지 보호기 위에 젤을 놓습니다. 증류수 500 μL에서 에티듐 브로마이드 5 μL을 희석하고, 피펫을 상단 연한 파란색 마커 바로 위에 있는 마커 레인에 대십시오(그림 1A참조).
주의: 에티듐 브로마이드에 장갑을 사용하고 현지 규정에 따라 폐기물을 폐기하십시오. 5분 동안 앉습니다. - 자외선(UV) 빛 아래에서 깨끗한 면도날을 사용하여 각 레인의 마커를 위에서 아래로 잘라냅니다(그림 1A참조). 실험실 밀봉 필름의 4 x 4cm 사각형으로 옮김을 옮은 다음 약 4 컷으로 젤을 가로로 3 개 자르고 수직으로 3 개를 잘라 12 개의 작은 사각형을 생성합니다 (그림 1B참조).
- 피펫 400 μL 의 0.3 M NaCl을 밀봉 필름 정사각형에, 및 1.5 mL 실리콘 튜브로 깔때기 겔 조각(도 1C참조). 밤새 4°C에서 영양기에서 샘플을 교반합니다.
참고: 다른 저보유1.5mL 튜브는 실리콘 튜브로 대체할 수 있습니다. - 4 °C에서 적어도 12 시간 의 교반 후, 샘플을 회수하고 100 % 에탄올의 원엽 튜브와 함께 얼음에 넣습니다.
- 400 μL의 상구체를 새로운 튜브로 옮은 다음 1 00% 에탄올 1 mL과 15 mg/mL 글리코겐 응침제 1 μL을 추가합니다. 4 °C에서 회전하고 필요에 따라 더 많은 파이펫팅, 가능한 한 많은 상급을 수집해야합니다. 1시간 동안 -80°C, 2시간 이상 -20°C에 놓습니다. 글리코겐 응침제는 펠릿 가시성과 회복을 향상시킵니다.
- 20-30 분 동안 17,000 x g에서 4 °C에서 회전하십시오.
3. 5' 링커 결찰
- 6.5 μL의 뉴클레아제 없는 물에 파이펫팅하여 펠릿을 다시 현탁시합니다. 펠릿을 먼저 몇 분 동안 물에 담그면 다시 서스펜션에 도움이 됩니다.
- 펠릿을 회전시키고 물에 다시 일시 중단한 후 0.5 μL의 100 μM 5'-링커(바코드 사용; 표 1참조), T4 RNA 리가제 완충제 1μL, 10 mM ATP 1μL, PEG 1 μL을 추가합니다. 90°C에서 30초 동안 가열한 다음 얼음 위에 놓습니다. T4 RNA 리가제 1μL을 넣고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 400 μL의 0.3 M NaCl을 추가하고 400 μL의 산 페놀 / 클로로포름을 넣습니다. 소용돌이 30 s - 1 분 (용액은 흐린 것처럼 보입니다),다음 미세 원심 분리기에서 최대 속도로 10-15 분 동안 4 °C에서 회전합니다 (~17,000 x g). 상단 층을 끄고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치합니다.
주: 아래쪽 도면층 중 어느 쪽도 파이펫팅하지 마십시오. - 클로로폼, 와류 350 μL을 짧게 추가한 다음 4°C에서 최대 속도(~17,000 x g)로 10분 동안 회전합니다. 나중에 상단을 끄고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치하십시오. 글리코겐 응침제 1.5 μL과 100% 에탄올 1 mL를 첨가합니다.
참고: 다시, 바닥 레이어 중 어느 쪽도 파이펫팅하지 마십시오. - 소용돌이를 짧게, 적어도 1 시간 동안 -80 °C, 또는 -20 °C 하룻밤 동안 놓는다.
4. 역전사 (RT)
- 42°C 의 열 블록을 켭니다. 샘플을 4°C에서 ~ ~17,000 x g에서 20-30 분 동안 돌립니다.
- 8.25 μL의 뉴클레아제 없는 물에 펠릿 샘플을 다시 일시 중단한 다음, cDNA 합성 키트에서100 μM RT 프라이머(표 1)의 0.5 μL 및 2x RT 반응 믹스5 μL을 첨가합니다. 42°C에서 3분 동안 배양합니다.
- 각 샘플에 1.5 μL의 10x RT 효소를 넣고 열전자전거에서 30분 동안 42°C에서 배양합니다. -20°C에 두거나 가수분해 및 중화를 계속하십시오.
참고: 단계 4.2 및 4.3에 여러 RT 키트를 사용할 수 있습니다. - 알칼리성 가수분해 및 중화 수행: 1mL의 1mL의 수산화칼륨(KOH) 용액(1M KOH 150 μL, 1 M Tris Base pH 7.5, 830 μL 의H2O) 및 1mL의 1mL(HCl 15L 및 H5L 의 HCl) H2O)의
- 시료에 첨가하기 전에 KOH 용액을 중화하는 데 필요한 HCl의 양을 결정합니다. 일반적으로, HCl의 약 20-24 μL은 KOH의 25 μL을 중화시킬 것이다. pH 스트립의 조합을 확인하여 올바른 범위(pH 7.0 ~ 9.5)에 있는지 확인합니다.
- 150 mM KOH 용액의 25 μL을 첨가하여 샘플을 가수 분해하고 95 °C에서 10 분 동안 배양합니다.
- 4.4단계에서 결정된 150 mM HCl의 양을 첨가하여 샘플을 중화시키고, 7.0 및 9.5 사이의 최종 샘플 pH를 얻었다.
5. PCR 증폭
- 중화 후, PCR 반응을 준비: 물 29.5 μL, 10x Taq 버퍼의 5 μL, dNTP의 1 μL,2 μL의 2 μL 25 μM 앞으로 프라이머 (표 1), 2 μL의 2 μL 의 2 μL (표1),Taq의 0.5 μL, 및 역전사 cDNA의 0.5 μL .
- 다음 의 PCR 반응을 실행: 94°C 에 대 한 2 분, 다음 20 사이클 94°C의 94 s에 대 한 45 s, 50 °C 75 s에 대 한 그리고 72°C 60 s에 대 한.
- 5.2단계에서 5 μL의 제품을 사용하여 약 2-4사이클의 두 번째 PCR 반응을 실행한다. 혼합: 물 34.8 μL, 10x Taq 완충제 의 5 μL, dNTP의 1 μL, 25 μM 전진 프라이머의 1 μL (표1),25 μM 역프라이머의 1 μL (표1),및 0.2 μL의 Taq 폴리머라제. 5.2단계에서 설명한 것과 동일한 열자전거 매개변수를 따릅니다.
참고: 두 개의 PCR 반응을 수행하는 목적은 20사이클에 대한 첫 번째 와 2-4주기에 대한 두 번째 - 증폭된 cDNA의 양이 동적 범위(즉, 포화 양이 아님)에 있는지 확인하는 것입니다.
6. 아가로즈 젤 정제
- 저용해 아가로즈를 가진 4% 아가로즈 젤을 준비합니다. 로딩 염료와 함께 40 μL 이상의 PCR 제품을 젤에 적재하십시오. 100bp 및 25bp 크기 마커를 로드합니다.
참고 : 25 bp 사다리는 링커 링커 결찰 제품에서 증폭 된 제품을 구별하는 데 도움이됩니다. 저용융 아가로즈 젤은 기존의 아가로즈 젤보다 더 세게 주조해야 하므로 제조업체의 지침을 철저히 따라야 합니다. - 젤 추출의 경우 젤에 표시되지만 포화되지 않은 주기 번호를 선택합니다(일반적으로 22-24사이클). 여러 샘플을 실행할 때 비슷한 강도 밴드를 선택합니다.
- 125bp 대역 위에 있는 밴드를 잘라냅니다(25bp 래더의 어두운 밴드; 그림 1D참조). 젤 추출 키트를 사용하여 4% 젤을 기반으로 완충액을 추가하기 위한 제조업체의 지침을 따르고 흔들어 실온에서 완충액으로 아가로즈를 녹입니다.
참고: 55°C에서 용해되면 링커-링커 결찰의 가능성이 높아진다. - 제조업체의 젤 추출 지침을 따르고 용출 완충제 또는 물 30 μL로 용출하십시오. 제품이 젤에 약해 보였다면 용출을 20 μL로 줄입니다.
- 민감한 기술을 사용하여 cDNA 농도를 측정하고 시퀀싱을 위한 샘플 라이브러리를 준비합니다. 준비는 사용되는 시퀀싱의 유형에 따라 달라집니다.
참고: 시퀀싱 라이브러리에 대한 최소 요구 사항은 일반적으로 10 μM 제품의 10 μL 부피입니다. 농도가 너무 낮으면, 풀과 에탄올은 원하는 농도로 라이브러리를 가지고 샘플을 침전. - 사용 가능한 장비를 사용하여 샘플을 순서를 정합니다. 일반적인 예는 50bp 단일 읽기용 키트를 사용하여 샘플을 실행하여 FASTQ 출력 형식으로 약 15-25백만 개의 읽기를 가져오는 것입니다.
작은 RNA 서열 정렬 및 생물 정보학
7. 데이터 업로드
- 각 시퀀싱 실행에서 생성된 FASTQ 파일을 다운로드합니다. miRbase.org 8,9,10에서마이크로RNA 헤어 핀 시퀀스 목록을 다운로드합니다.
- www.usegalaxy.org 갤럭시 계정을 생성하고 이 계정에 읽는 순서의 FASTQ 파일을 업로드합니다.
- 텍스트 파일로 사용할 수 있는 barcodes.txt와 같은 바코드 시퀀스의 텍스트 파일을 Galaxy 계정에 업로드합니다(보충표1).
- miRBase.org 같은 데이터베이스에서 갤럭시 계정에 마이크로 RNA 헤어 핀의 FASTA 파일을 업로드합니다. 마우스(mousehairpins.fa) 또는 인간(humanhairpins.fa) microRNA 전구체의 예는 보충표 2 및 보충표3에 제공된다.
8. 어댑터 제거, 바코드 정렬 및 트림
- 왼쪽 탭에서 게놈 파일 조작 > FASTA/FASTQ > 클립 어댑터 시퀀스로이동합니다.
- FASTA 또는 FASTQ형식의 입력 파일에서 드롭다운 목록에서 FASTQ 파일을 입력합니다. 최소 시퀀스 길이를 18로 변경합니다. 사용자 지정 시퀀스를입력하려면 소스를 변경합니다. CTGTAGGC를입력합니다. 다른 모든 기본 매개 변수를 유지합니다. 실행을클릭합니다.
참고: 18개 뉴클레오티드보다 짧은 서열 판독은 마이크로RNA에 고유하게 매핑하기 어렵고 많은 분해 생성물을 함유한다. - 왼쪽 탭에서 게놈 파일 조작 > FASTA/FASTQ > 바코드 스플리터로이동합니다.
참고: Galaxy 함수와 헤더는 주기적으로 업데이트되므로 검색 기능이 동등한 도구 또는 해당 위치를 찾는 데 필요할 수 있습니다. 인덱싱된 프라이머를 사용하는 상용 키트는 이미 바코드별로 정렬되는 경우가 많습니다. 따라서 상용 키트로부터 시작하는 경우 이 단계와 바코드 트림 단계가 필요하지 않습니다. - 바코드를 사용하려면 barcodes.txt를 가리킵니다. 라이브러리를 분할하려면이전 단계에서 생성된 데이터 파일에 대한 클립을 사용합니다. 허용된 불일치수에서 1을입력합니다. 실행을클릭합니다.
- 처음 4 개의 뉴클레오티드를 트리밍 : 텍스트 조작으로 이동 > 선행 또는 후행 문자를잘라. 입력 데이터집합의 경우 데이터 집합 모음인 폴더 아이콘을 클릭합니다. 데이터에 바코드 스플리터레이블이 포함된 샘플의 일괄 처리 파일을 선택합니다. 이 위치까지 처음부터 트림에서 5를입력합니다. 에서 입력 데이터 집합FASTQ 형식으로? 실행을클릭합니다. 실행은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
9. 마이크로RNA에 대한 읽기 정렬
- 갤럭시에서, 유전체학 분석으로 이동 > RNA-Seq > 돛새치 성적 증명서 정량화11.
- 질문의 경우 기록에서 참조 전사체를 선택하거나 기본 제공 인덱스를 사용합니까? 기록에서 하나를 선택합니다. 드롭다운 목록에서 업로드된 파일 마우스헤어핀스.fa를 입력합니다. FASTA/Q 파일에서 폴더 아이콘을 클릭하여 데이터 집합 컬렉션을 사용하고 컬렉션에트림이 포함된 파일을 선택합니다. 실행을클릭합니다. 실행은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 오른쪽의 히스토리 탭에서 19개의 아이템이 있는 목록인 컬렉션의 돛새치를 클릭합니다. 각 개별 파일을 클릭하고 디스크 아이콘을 클릭하여 로컬 컴퓨터에 저장합니다. 개별적으로 다운로드한 파일은 먼저 압축해제해야 합니다. 또한 스프레드시트로 가져오기 위해 .txt 확장으로 다시 저장해야 할 수도 있습니다.
- 각 스프레드시트 파일을 열고 NumReads 열의 이름을 치료 조건으로 다시 지정합니다. 열을 함께 병합하여 첫 번째 열에서 microRNAs 행렬을 생성하고 후속 열의 조건당 읽기 횟수를 계산합니다.
- 각 치료 조건에 대해 차별화된 발현 된 microRNAs를 계산하려면 DESeq212와같은 프로그램에 대한 입력으로 raw microRNA 읽기 카운트가있는 파일을 사용합니다. DESeq2는 유전체학 분석 > RNA-seq > DESeq2 탭에서 은하계에 존재한다.
- 원시 읽기를 정규화된 microRNA 읽기 개수로 변환합니다. 카운트는 다음 계산을 통해 라이브러리의 라이브러리 서열 깊이로 정규화됩니다: [(원시 읽기/총 microRNA 읽기) * (1,000,000 – 계산된 microRNAs 수) + 1].
참고: 이 계산은 데이터 집합 및 생물학적 조건 간에 비교할 수 있는 백만(RPM) 매핑된 microRNAs당 정규화된 판독을 제공합니다. 출력은 탭으로 구분된 파일입니다. 돛새치는 tpm 출력 열을 제공하지만 이 값은 microRNA 헤어핀 길이로 정규화되지만 이 컨텍스트에서는 필요하지 않습니다. - 관련성이 있는 경우 사용자 지정 입력 시퀀스(예: 벡터)와 정렬을 반복하여 shRNAs와 같은 전달된 구문에 해당 맵을 읽는 것을 식별합니다.
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Representative Results
라이브러리 준비와 관련된 단계의 회로도
작은 RNA 추출, 시퀀싱 및 정렬의 전반적인 회로도는 그림2에 설명되어 있습니다.
1마리의 수컷 마우스와 1마리의 암컷 마우스로부터의 간 샘플을 수집하고 액체 질소로 냉동 스냅하였다. 총 RNA를 추출하고 품질 및 농도에 대해 평가하였다.
작은 RNA 시퀀싱은 시퀀싱을 위한 충분한 RNA를 산출합니다.
2개의 독립적인 RNA 추출으로부터 3 μg의 RNA를 작은 RNA 염기서열 분석의 시작 물질로서 사용하였습니다. 샘플을 아크릴아미드 겔상에서 실행하고 RNA의 17-28 nt에 해당하는 크기 마커사이를 잘라냈다(도 1A). 샘플을 RNA 단리(도1B)를위한 단편으로 다진 후 저보유 1.5 mL 원심분리관으로 옮겼다(도1C). 바코드 bc7 및 bc17(표 1)을 작은 RNA의 5' 말단에 결찰하였다. 작은 RNA 라이브러리는 각각 8.0 및 11.2 ng/μL 생성을 수율화하기 위해 22사이클의 PCR을 사용하여 PCR증폭되었다. 샘플을 풀링하고 50 bp 판독 길이를 사용하여 고처리량 시퀀싱을 위해 10nM 풀링된 샘플을 제출하였다.
MiR-122는 마우스 간에서 가장 풍부한 microRNA입니다.
바코드 정렬 후, 851,931 판독간 샘플 1및 간 샘플 2에서 650,154에서 바코드를 포함. 판독중, 83.5% 및 90.0%는 각각 microRNAs에 매핑되었고, 나머지 판독은 rRNAs(각각 1.8% 및 0.6%)로 매핑됨), tRNA 및 mRNA 분해 단편을 매핑하였다. 인간 microRNA 헤어핀에 정렬 한 후, 우리는 각 복제에서 microRNA 읽기 카운트 사이의 강한 일치를 관찰 (R2 = 0.998; 그림3). 총 306개의 마이크로RNA 종을 검출하였고, 가장 많은 수의 판독이 miR-122로 매핑되었다(보충표 4). MicroRNA 풍부는 남성과 여성 간 샘플 사이 유사 했다.
그림 1. 아크릴아미드 겔에서 작은 RNA의 추출. (A) 아크릴아미드 겔 및 마이크로RNA의 크기에 해당하는 절단 부위. (B) 더 작은 조각으로 자르기 전후에 젤 조각. (C) 겔 조각을 실리콘 튜브로 옮기는 공정. (D) 저용융 아가로즈 젤에 대한 PCR 반응은 링커 링커 제품 및 불포화(22사이클) 대 포화(24사이클) 샘플과 비교하여 정확한 복제 제품을 입증하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 프로토콜의 회로도. 프로시저와 관련된 주요 단계를 보여 주면 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 2개의 독립적인 RNA 추출에서 결과의 재현성. microRNA 의 산점도는 log10 기반 척도를 사용하여 암컷 마우스 간(y축)과 비교하여 수컷 마우스 간(x축)으로부터 카운트된다. 각 포인트는 각 개별 마이크로RNA에 대한 백만(RPM) 매핑된 마이크로RNA 카운트당 판독을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 뇌관 | 시퀀스 | |
| 3' 링커 1 | rAppCTGTAGGCACCATCAAT- NH2 | |
| 낮은 크기 마커 | rArUrCrGrCrUrGrUrGrArCrUrUrUrUrUrUrUrUrArCrarggTAACCATGCGCGCGCC | |
| 상부 크기 마커 | 라아라우르크라그라그라그라그라그라그러루어러라라라라라라라라라라크루라크라라라라커라라라라라라라라라라라라라라라그타카카트GCGCGCGCGCGCGCC | |
| 바코드1 | /5AmMC6/아크CTCTTCCGCTrArGrCrG | |
| 바코드2 | /5AmMC6/아크CTCTTCTGAtCTrCrUrC | |
| 바코드3 | /5AmMC6/아크CTCTTCTTGCTrCrUrGrG | |
| 바코드4 | /5AmMC6/아크CTCTTCCGATCTrArCrurU | |
| 바코드5 | /5AmMC6/아크CTCTTCCGATTTrGrGrU | |
| 바코드6 | /5AmMC6/아CGCTCTTCTGAtTTrGrUrA | |
| 바코드7 | /5AmMC6/아CGCTCTCTTGTTrUrUrG | |
| 바코드8 | /5AmMC6/아크CTCTTCTTGCTrUrCrGrC | |
| 바코드9 | /5AmMC6/아크CTCTTCCGCTrGrCrArG | |
| 바코드10 | /5AmMC6/아CGCTCTCTTC트트라라크 | |
| 바코드11 | /5AmMC6/아크CTCTTCTGAtCTrUrCrU | |
| 바코드12 | /5AmMC6/아크CTCTTCCGAtCTrCrArU | |
| 바코드13 | /5AmMC6/아CGCTCTCTTGAtCTrArGrA | |
| 바코드14 | /5AmMC6/아CGCTCTCTTGAtCTrUrGrA | |
| 바코드15 | /5AmMC6/ACGCTCTTCTGTTrUrGrG | |
| 바코드16 | /5AmMC6/아CGCTCTTCTGTTrUrG | |
| 바코드17 | /5AmMC6/아크CTCTTCCGATCTrUrUrUrUrU | |
| 바코드18 | /5AmMC6/아크CTCTTCCGATCTrGrUrU | |
| RT 프라이머 | 아티가트그그CCTACAG | |
| PCR 프라이머 F | AATGATACGGCGACCACCCTCTCTACACCGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT | |
| PCR 프라이머 R | 카가가가가가가가가가가카그카카타CTCTCTTGCCTACAG | |
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Discussion
20 년 전13년 전 microRNAs의 확인에도 불구하고, microRNA 시퀀싱의 과정은 힘든 남아 있고 전문 장비를 필요로, 일상적으로 사내 프로토콜을 채택에서 실험실을 방해14. 그밖 기술은 microRNA 마이크로어레이 및 다중화한 표현 패널 같이 microRNA를 동시에 평가할 수 있습니다; 그러나, 이러한 접근법은 그들의 프로브 세트에 존재하는 microRNAs만 정량화한다는 점에서 제한된다. 이 때문에, 그들은 새로운 microRNA의 식별과 같은 작은 RNA 시퀀싱의 중요한 특징을 놓치고, 마이크로 RNA 이소폼 -중요한 생물학적 기능을 가질 수있는 뉴클레오시드 변화 6,7,15 .
새 실험을 시작할 때 상용 공급업체를 사용하는 것이 기술 지원과 사용 편의성을 제공하기 때문에 가장 쉬운 경우가 많습니다. 마이크로RNA 시퀀싱에는 여러 가지 상용 옵션을 사용할 수 있으며, 이는 많은 수의 샘플(>100)을 처리할 때 워크로드를 줄이기 위해 다중화될 수 있습니다. 이러한 상용 키트는 지속적으로 개선되고 있으며, 이는 장점과 단점모두입니다. 한편으로는, 이 키트를 만드는 회사는 새로운 microRNA 포획 방법을 개발했습니다, 예를 들면, 그들의 5및 3 끝의 순환을 통해 서열화 또는 결찰 편향을 감소시키기 위하여 각 끝에 무작위 순서를 가진 퇴화 한 링커를 사용하여. 그들은 또한 이중 가닥 어댑터의 결찰 또는 상보적 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 통해 어댑터-이머머를 제거하는 방법을 개발했습니다. 반면에 상용 키트는 모든 단계의 수정 또는 변경에 대해 권장합니다. 따라서 키트를 업데이트하는 경우 이전 버전과 새 버전의 키트에서 파생된 데이터와 다른 상용 공급업체의 키트에서 파생된 데이터를 비교하는 것은 어렵거나 불가능합니다. 여기에서는 상업적 대안에 직면하여 전력을 유지하는 프로토콜을 설명했습니다. 젤 정제 단계에 대한 우리의 초점은 프로토콜에 시간을 추가하는 동안 우리가 수년 동안 일관된 microRNA 포획 및 재현성을 가능하게 합니다. 상용 키트와 사내 프로토콜 사이의 재현성에 대한 몇 가지 평가가 이루어졌으며, 우리는 이러한 연구16,17,18,19의몇 가지 연구에 독자를 참조한다. 중요한 것은, 마이크로RNA의 생물 정보학 분석을 위해 우리가 설명하는 단계는 키트 또는 사내 프로토콜의 선택에 관계없이 채택될 수 있습니다.
MicroRNA 염기서열 분석은 종종 바코드의 선택에 의해 고민된다: 어떤 경우에, 다양한 바코드의 결찰 효율은 샘플(20)에서서열의 편향된 분포로 이어지는 동등하지 않을 수 있다. 이제 특정 microRNAs21,22의결찰 편향을 최소화하기 위해 5 및 3 단부에서 퇴화 염기를 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서는 이러한 결찰 문제를 관찰하지 않았으며 다른 바코드 5,6,7,23으로평가된 기술 및 생물학적 복제에 대한 일관된 판독을 관찰했습니다. 그러나 그들을 인식하는 것이 중요합니다. 결찰 편향을 피하는 방법은 PCR 프라이머에 인덱스 프라이머의 혼입, 또는 5 어댑터 서열의 3 단말에하나 이상의 임의RNA 뉴클레오시드를 추가하는 것을 포함한다(표 1). C. elegans miR-39 microRNA24와같은 하나 이상의 합성 스파이크 인 RNA를 도입하는 것은 또한 엑소좀에서 microRNAs를 정량화하는 것과 같은 낮은 수율 상황에 매우 중요한 정상화 목적을 위한 옵션입니다. 마찬가지로, RNA 결찰을 위해, 우리는 성공적으로 T4 RNA ligase 1을 사용했지만, 덜 바이어스를 가진 결찰은 T4 RNA 리가제 225의잘린 형태에 대해 입증되었다. 마지막으로, Superscripts III 및 IV는 우리가 문제없이 사용한 대체 역 전사 효소입니다.
microRNA 데이터베이스의 선택은 또한 최종 정규화된 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 마이크로RNA 데이터베이스를 큐레이팅하는 과제는 마이크로RNA로 나열된 여러 개의 새로운 작은 RNA가 실제로 반복 요소의 단편이며 선의의 microRNAs2가아니라는 것입니다. 표준 기준을 준수하지 않는 microRNA를 폐기하여 다음 버전의 microRNA 데이터베이스가 보다 정교해지도록 노력했습니다. 그러나 다음 반복에는 확인이 필요한 새 후보도 포함됩니다. 반복 파생 된 microRNAs 정렬에 포함 된 경우 결과 왜곡 하 고 기존 microRNAs에서 데이터를 압도 수 있습니다. 따라서, 다른 종에서 microRNAs의 잘 선별 된 데이터 세트의 사용은 필수적이다26,27. 우리는 작은 RNA 시퀀싱 읽기를 보존 된 microRNAs의 선별 된 목록에 정렬 할 때 가장 큰 재현성을 경험했으며 보충 표 2 및 보충 표 3에이러한 머리핀을 포함시켰습니다. 이들 리스트는 인간 게놈 2,26에서약500개의 고신뢰도 마이크로RNA의 추정치와 일치한다.
다른 기술과 마찬가지로, 결과는 직교 접근법으로 확인되어야합니다. 우리는 성공적으로 후보 microRNAs6,7,23의크기와 상대적 풍부를 확인하기 위해 방사성 표지 프로브를 통합 작은 RNA 북부 얼룩작은 RNA 시퀀싱 결과를 재현했다. 분할 판독 시퀀싱을 사용하는 마이크로RNA의 정량적 PCR 및 qPCR 및 웨스턴 블로팅을 사용한 표적 mRNA 변경 확인은 유효성 검사를 위한 다른 옵션입니다.
요약하자면, 우리는 microRNA를 분리하고 서열화하고 기존 microRNA 데이터베이스에 대하여 정렬을 수행하는 방법을 제공했습니다. 시약 과 장비의 경제성과 분석을 위한 오픈 소스 도구의 사용은 누구나 이 프로토콜에 접근할 수 있도록 해야 합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 모든 조직 또는 세포주에서 사용될 수 있어 고도로 재현성이 높고 고품질의 판독을 산출할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 앤드류 화재와 마크 케이의 실험실의 구성원에게 지침과 제안에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
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