Summary
Здесь мы описываем пошаговую стратегию изоляции малых РНК, обогащения микроРНК и подготовки образцов для секвенирования высокой пропускной способности. Затем мы описываем, как обрабатывать последовательность читает и выравнивать их к микроРНК, используя инструменты с открытым исходным кодом.
Abstract
Половина всех человеческих стенограмм, как полагают, регулируется микроРНК. Таким образом, количественные выражения микроРНК может выявить основные механизмы в состоянии болезни и обеспечить терапевтические цели и биомаркеры. Здесь мы подробно описываем, как точно количественно осмотреть микроРНК. Вкратце, этот метод описывает изоляцию микроРНК, привязывая их к адаптерам, пригодным для секвенирования высокой пропускной способности, усилению конечных продуктов и подготовке библиотеки образцов. Затем мы объясняем, как выровнять полученные считывания последовательности с микроРНК шпильками, а также количественно, нормализовать и вычислить их дифференциальную экспрессию. Универсальный и надежный, этот комбинированный экспериментальный рабочий процесс и биоинформатический анализ позволяет пользователям начать с извлечения тканей и закончить с количественной микроРНК.
Introduction
Впервые обнаружен в 1993году 1, в настоящее время оценивается, что почти 2000 микроРНК присутствуют в геноме человека2. МикроРНК представляют небольшие некодивающие РНК, которые, как правило, 21-24 нуклеотидов в длину. Они являются посттранскрипционными регуляторами экспрессии генов, часто связывающимися с дополнительными участками в 3-непереведенном регионе (3-UTR) генов-мишеней для подавления экспрессии белка и деградации мРНК. Количественная микроРНК может дать ценную информацию о экспрессии генов и несколько протоколов были разработаны для этой цели3.
Мы разработали определенный, воспроизводимый и давний протокол для мелкого секвенирования РНК, а также для анализа нормализованных считываний с использованием инструментов биоинформатики с открытым исходным кодом. Важно отметить, что наш протокол позволяет одновременно идентифицировать как эндогенные микроРНК, так и экзогенно доставленные конструкции, которые производят микроРНК-подобные виды, при этом минимизируя считывая эту карту другим малым видам РНК, включая рибосомные РНК ( РНК), передачи РНК-производных малых РНК (tsRNAs), повторных полученных малых РНК, и мРНК продуктов деградации. К счастью, микроРНК 5-фосфорилированных и 2-3 гидроксилированных4, функция, которая может быть использована, чтобы отделить их от этих других небольших РНК и мРНК продуктов деградации. Существует несколько коммерческих вариантов клонирования и секвенирования микроРНК, которые зачастую быстрее и проще в мультиплексе; однако, запатентованные характер реагентов комплекта и их частые изменения делают сравнение проб работает сложной задачей. Наша стратегия оптимизирует сбор только правильный размер микроРНК с помощью акриламида и шагов по очищению агарозного геля. В этом протоколе мы также описываем процедуру выравнивания последовательности считывается на микроРНК с помощью инструментов с открытым исходным кодом. Этот набор инструкций будет особенно полезен для начинающих пользователей информатики, независимо от того, используется наш метод подготовки библиотеки или коммерческий метод.
Этот протокол был использован в нескольких опубликованных исследованиях. Например, он использовался для определения механизма, с помощью которого фермент Dicer расщепляет небольшие ШПильки РНК на расстоянии двух нуклеотидов от внутренней петли структуры стволовой петли - так называемого "правила подсчета петли"5. Мы также следовали этим методам, чтобы определить относительное изобилие доставленных небольших РНК шпильки (SHRNA), выраженных от рекомбинантных адено-ассоциированных вирусных векторов (rAAVs), чтобы определить порог экспрессии shRNA, которые могут быть переновлены до печени токсичность, связанная с избыточным выражением shRNA6. Используя этот протокол, мы также определили микроРНК в печени, которые реагируют на отсутствие микроРНК-122 - высоко выраженной печеночной микроРНК - в то же время характеризуя узор деградации этой микроРНК7. Поскольку мы последовательно использовали наш протокол в многочисленных экспериментах, мы смогли наблюдать за пробными препаратами продольно и видеть, что нет заметных эффектов партии.
При совместном использовании этого протокола, наша цель заключается в том, чтобы позволить пользователям генерировать высокое качество, воспроизводимую количественную оценку микроРНК практически в любой ткани или клеточной линии, используя доступное оборудование и реагенты, а также бесплатные инструменты биоинформатики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были санкционированы Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Вашингтона.
Подготовка библиотеки малой РНК
1. Изоляция РНК
- Изолировать РНК от биологического источника с помощью стандартного реагента изоляции РНК, или комплект, который обогащает для микроРНК. Для тканей, лучше всего начать с образцов оснастки заморожены в жидком азоте и землю в порошок с помощью предварительно охлажденный раствор и пестик.
- Измерьте целостность РНК каждого образца на инструменте, который может количественно оценить РНК и обеспечить число целостности РНК (RIN). RINs должны быть
2. 3' перевязка адаптера
- Подготовьте реакцию перевязки в прокладочных трубках ПЦР, объединив: 11 л РНК (1-3 мкг, используя то же количество для каждого образца), 1,5 кЛ 10x T4 RNA буфер реакции лигазы, АТФ-бесплатно, 1 Л полиэтиленгликоль (PEG), и 0,5 qL 3'linker (10RN кер).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие АТФ помогает обогащать миРНК и сводит к минимуму клонирование продуктов деградации мРНК. ПЭГ действует как молекулярный скученный агент, усиливая успешную перевязку. Универсальный связующего miRNA имеет 3' блокирующую группу (амин) для предотвращения самолиги, круговой, и перевязки рнки в 5'. - Нагрейте образцы при температуре 95 градусов по Цельсию на термоцикле 30-40 с. Охладите на льду в течение 1 мин. Добавить 1 кЛ T4 РНК лигаза 2 и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч. Подготовьте гель (шаг 2.3), пока образцы инкубируются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация при комнатной температуре помогает предотвратить перевязку linker-linker. Мы также успешно использовали T4 RNA ligase 1. - Приготовьте 30 мл 15% полиакриламидного геля с 8 М мочевины (для геля 20х20 см): 14,4 г мочевины, 3 мл 10x Трис-буферизированной этилендиаминтетраацетической кислоты (ТБЕ), 11,2 мл 40% 19:1 арилхидамида и H2O до 30 мл. Раствор лучше всего растворять при 42 градусах Цельсия. Непосредственно перед литьем добавьте 150 л 10% аммония persulfate (APS) и 30 Зл тетраметилэтилениамин (TEMED) для полимеризации.
- Налейте между 0,8 мм разделенных стеклянных пластин в пластиковый литый и вставить гребень. После того, как гель затвердеет (около 20 мин), добавить 0,5x TBE в бак и мыть колодцы остаточной мочевины путем труба энергичный.
- Предварительно запустить гель на постоянной 375 V в течение 25 минут без образцов, чтобы мочевина может войти в гель, а затем мыть колодцы снова.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество напряжения, возможно, потребуется уменьшить в зависимости от типа питания и электрофорез системы, которая используется. - После того, как образцы сделаны ligating, добавить 15 qL акриламида загрузки красителя в образцы (для 1:1 соотношение), затем денатурации в течение 5 мин при 95 градусов по Цельсию на термоциклер.
- Приготовьте 25 нг/л из 37 и 44 bp маркеров размера, разбавленных одной частью акриламида погрузочного красителя. Последовательности перечислены в таблице 1.
- Загрузите образцы на полиакриламидгель, оставив по крайней мере одну полосу между каждым образцом. Загрузите 20 ЗЛ, по крайней мере, двух наборов маркеров, в асимметричном рисунке, чтобы отслеживать ориентацию геля.
- Выполнить гель на постоянной 375 V в течение первых 15 минут, а затем увеличить до постоянного 425 V для оставшегося запуска. Бегите до тех пор, пока бромофенол синий составляет около 1-4 см от дна, который занимает около 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости гель может работать при более низком постоянном напряжении в течение более длительного периода времени до тех пор, пока голубой бромофенол не будет находиться примерно на 1-4 см от дна. - Снимите гель со стеклянных пластин с помощью сепаратора пластины и поместите гель на пластиковый протектор страницы. Разбавить 5 зл бромистого этидия в 500 л дистиллированной воды, и пипетки на маркер полосы чуть выше верхней светло-голубой маркер (см. Рисунок 1A).
ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки для бромистого этидия и утилизировать отходы в соответствии с местными правилами. Пусть сидите в течение 5 минут. - Под ультрафиолетовым (УФ) светом, вырезать гели от верхнего до нижнего маркера в каждой полосе с помощью чистого лезвия бритвы (см. Рисунок 1A). Передача на 4 х 4 см квадрат лабораторной пленки уплотнения, а затем вырезать гель около 4 сокращений горизонтально и 3 вертикально производить 12 небольших квадратов (см. Рисунок 1B).
- Пипетка 400 л 0,3 М NaCl на уплотнения площади пленки, и кусочки геля воронки в 1,5 мл силиконовых труб (см. Рисунок 1C). Агитировать образцы на nutator на 4 градуса х на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие трубы с низким удержанием 1,5 мл могут быть заменены силиконовыми трубками. - После по крайней мере 12 ч агитации при 4 градусах Цельсия, получить образцы и положить их на лед, вместе с конической трубки 100% этанола.
- Перенесите 400 л супернатанта в новую трубку, а затем добавьте 1 мл 100% этанола и 1 л из 15 мг/мл гликогена coprecipitant. Убедитесь, что собрать как можно больше супернатант, как это возможно, спиннинг вниз на 4 кВ и pipetting больше по мере необходимости. Место при -80 градусах по Цельсию на 1 ч, или -20 градусов по Цельсию в течение 2 ч или дольше. Гликоген копреципиант улучшает видимость гранул и восстановление.
- Спин при 4 градусах по Цельсию при 17 000 х г в течение 20-30 мин. Удалите все следы этанола и дайте гранулы воздуха высохнуть в течение 5 мин.
3. 5' перевязка связующим звеном
- Повторно приостановить гранулы путем pipetting в 6,5 л без нуклеазы воды. Сдача гранулы сидеть в воде в течение нескольких минут в первую очередь поможет с повторной подвески.
- После вращения гранул ы и повторной приостановки в воде, добавить 0,5 л 100 мкм 5'-linker (со штрих-кодами; см.Таблица 1 ), 1 кЛ T4 РНК лигаз буфера, 1 л 10 мМ АТФ, и 1 л ПЭГ. Нагрейте при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 30 с, затем поместите на лед. Добавьте 1 кл/л T4 РНК ligase 1 и дайте инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Добавьте 400 л 0,3 М NaCl, а затем 400 л кислоты фенол /хлороформ. Вихрь 30 с - 1 мин (решение будет выглядеть облачно), а затем спина на 4 кв 10-15 мин на максимальной скорости в микроцентрифуге (17000 х г). Нарисуйте верхний слой и поместите в новую трубку 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пайпетки любого из нижнего слоя. - Добавьте 350 л хлороформа, вихрь кратко, а затем вращайтесь при 4 градусах по Цельсию в течение 10 минут с максимальной скоростью (17 000 х г). Нарисуйте сверху позже и поместите в новую трубку 1,5 мл. Добавьте 1,5 л сопреципипана гликогена и 1 мл 100% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, избегайте пайпетирования любого из нижнего слоя. - Вихрь кратко, затем место на -80 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 ч, или -20 градусов на ночь.
4. Обратная транскрипция (RT)
- Включите теплоблок 42 градусов по Цельсию. Спин образцы на 4 кв и 17000 х г в течение 20-30 мин. Удалите все супернатант и дайте гранул ы высохнуть в течение 5 мин.
- Повторно приостановить гранулированный образец в 8,25 л безнужной воды, а затем добавить: 0,5 л 100 мкм RT грунтовки (Таблица 1), и 5 л 2x RT Реакция Mix из комплекта синтеза кДНК. Инкубировать при 42 градусах по Цельсию в течение 3 мин.
- Добавьте 1,5 кЛ 10-кратного фермента RT к каждому образцу и инкубировать при 42 градусах По Цельсия в течение 30 минут в термоциклере. Место при -20 градусах или продолжить гидролиз и нейтрализацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько комплектов RT могут быть использованы для шагов 4.2 и 4.3. - Выполните щелочный гидролиз и нейтрализацию: Сделать 1 мл 10 мм гидроксида калия (KOH) раствор (150 м кЛ 1 М КЛ, 20 кЛ 1 М Tris Base pH 7.5, и 830 Л Л H2O) и 1 мл 150 мМ гидрокислоты (HCl) (150 МЛ Л л H2O).
- Перед добавлением в образцы определите количество HCl, необходимое для нейтрализации раствора KOH. Как правило, около 20-24 л HCl нейтрализует 25 кЛ KOH. Проверьте комбинацию на полосе рН, чтобы убедиться, что она находится в правильном диапазоне (pH 7,0 до 9,5).
- Гидролизуем образцы, добавляя 25 кЛ раствора 150 мМ КН и инкубировать в течение 10 мин при 95 градусах Цельсия.
- Нейтрализовать образцы, добавив количество 150 мМ HCl определяется в шаге 4.4, чтобы получить окончательный рН образца между 7,0 и 9,5.
5. Усиление ПЦР
- После нейтрализации подготовьте реакцию ПЦР с: 29,5 л воды, 5 qL 10x Taq буфера, 1 л dNTP, 2 qL из 25 мкм передний грунт (Таблица 1, 2 qL из 25 мкм реверсивная грунтовка (Таблица 1), 0,5 л Taq, и 10 л обратного transcribed cDNA от шага 6.6.6 .
- Выполнить следующую реакцию ПЦР: 94 градусов по Цельсию в течение 2 мин, затем 20 циклов 94 градусов по Цельсию для 45 с, 50 градусов по Цельсию для 75 с и 72 градусов по Цельсию за 60 с.
- Запустите вторую реакцию ПЦР около 2-4 больше циклов, используя 5 qL продукта от шага 5.2. Смешение: 34,8 л воды, 5 qL 10x Taq буфера, 1 л dNTP, 1 л из 25 мкм вперед грунтовка (Таблица 1), 1 кВ 25 мЛ обратной грунтовки (Таблица 1), и 0,2 л Taq полимераза. Следуйте тем же параметрам термоциклоза, изложенным в шаге 5.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель выполнения двух реакций ПЦР - с первой в течение 20 циклов и второй всего за 2-4 больше - заключается в том, чтобы количество кДНА усиливается в динамическом диапазоне (т.е. не насыщенное количество).
6. Очищение геля Агарозе
- Приготовьте 4% агарозный гель с низкоплавивой агарозой. Загрузите 40 qL или более продукта ПЦР на гель, наряду с погрузочным красителем. Загрузите 100 bp и 25 bp маркеров размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: 25 bp лестница помогает отличить усиленный продукт от linker-linker перевязки продуктов. Низкоплавящие гели агарозы должны быть отлиты с большей осторожностью, чем традиционные гели агарозы, поэтому внимательно следуйте инструкциям производителя. - Для извлечения геля выберите число циклов, которое видно на геле, но не насыщено (обычно 22–24 цикла). Выберите группы аналогичной интенсивности при запуске нескольких образцов.
- Вырежьте полосу, которая находится выше диапазона 125 bp (темная полоса на 25 bp лестницы; см. Рисунок 1D). Используя комплект извлечения геля, следуйте инструкциям производителя для добавления буфера на основе 4% геля, а затем встряхнуть, чтобы растворить агарозу в буфере при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворение при 55 градусах Цельсия увеличивает потенциал перевязки linker-linker. - Следуйте инструкциям производителя по извлечению геля и выясните 30 злиционного буфера или воды. Если продукт выглядел слабым на гель, а затем уменьшить elution до 20 Зл.
- Измерьте концентрацию кДНК с помощью чувствительной техники и подготовьте библиотеку образцов для секвенирования. Подготовка будет зависеть от типа используемого последовательности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальные требования к библиотеке секвенирования, как правило, 10 юл объем 10 мкм продукта. Если концентрации слишком низки, бассейн и этанол осаждает образцы, чтобы довести библиотеку до нужной концентрации. - Последовательность образцов с использованием имеющегося оборудования. Общим примером может быть запуск образцов с использованием комплекта для 50 bp односчитывает, чтобы получить примерно 15-25 миллионов считывает в формате fast' выход.
Небольшая выравнивание последовательности РНК и биоинформатика
7. Загрузка данных
- Скачать файлы FAST, генерируемые с каждого запуска последовательности. Скачать список микроРНК шпильки последовательности изmiRbase.org8,9,10.
- Создайте учетную запись Galaxy в www.usegalaxy.org и загрузите файл последовательности FAST' в эту учетную запись.
- Загрузите текстовый файл последовательностей штрих-кодов на учетную запись Galaxy, например, barcodes.txt, который доступен в виде текстового файла(Дополнительная таблица 1).
- Загрузите файл шпильки FASTA микроРНК на учетную запись Galaxy из базы данных, как miRBase.org. Примеры мыши (mousehairpins.fa) или человека (humanhairpins.fa) микрорнки прекурсоров приведены в дополнительной таблице 2 и дополнительной таблице 3.
8. Удаление адаптора, сортировка штрих-кода и отделка
- В левой вкладке, перейдите к геномной манипуляциифайла
- В вводимых файлах в формате FASTA или FAST'введите файл FAST из списка выпадающих. Изменение минимальной длины последовательности до 18. Изменение источника для ввода пользовательской последовательности. Введите CTGTAGGC. Сохраняйте все остальные параметры по умолчанию. Нажмите Выполнить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность читает, что короче, чем 18 нуклеотидов трудно сопоставить однозначно микроРНК и содержат много продуктов деградации. - В левой вкладке, перейдите к геномнойманипуляции файла
ПРИМЕЧАНИЕ: Функции Галактики и заголовки периодически обновляются, поэтому функция поиска может потребоваться для поиска эквивалентного инструмента или его местоположения. Коммерческие комплекты с использованием индексированных грунтовок часто уже сортируются по штрих-коду. Таким образом, этот шаг и штрих-код отделка шаг не являются необходимыми, если, начиная с коммерческого комплекта. - Для штрих-кодов дляиспользования, укажите на barcodes.txt. Для разделениябиблиотеки используйте Clip на файле данных, произведенном на предыдущем этапе. В количестве разрешенных несоответствий,введите 1. Нажмите Выполнить.
- Обрезать первые 4 нуклеотидов: перейти к Текст манипуляции (gt; Обрезка ведущих или задних символов. Для набора входных данныхнажмите на значок папки, который представляет собой сбор набора данных. Выберите пакетный файл образцов, который включает в себя сплиттер штрих-кода на данных. В Trim от начала до этойпозиции, введите 5. В Наборе входных данных в формате FAST? введите Да. Нажмите Выполнить. Выполнение может занять несколько минут.
9. Выравнивание считываемых считываемых смикроРН
- В Галактике, перейдите к геномике Анализ (RNA-Seq)
- Для вопроса Выберите ссылку транскриптом из вашей истории или использовать встроенный индекс? Выберите Используйте один из истории. Введите загруженный файл mousehairpins.fa из списка выпадающих. В файле FASTA/я щелкните значок папки, чтобы использовать набор наборов данных и выберите файл, включающий trim oncollection. Нажмите Выполнить. Выполнение может занять несколько минут.
- В истории вкладка справа, нажмите на Sailfish на коллекцию ..., который представляет собой список с 19 пунктов. Нажмите на каждый отдельный файл и нажмите значок диска, чтобы сохранить на локальном компьютере. Индивидуально загруженные файлы сначала должны быть расжаты. Они также могут быть повторно сохранены с расширением .txt для целей импорта в электронную таблицу.
- Откройте каждый файл электронной таблицы и переименуйте столбец NumReads в состояние лечения. Слияние столбцов вместе для создания матрицы микроРНК в первом столбце и чтения рассчитывает на состояние в последующих столбцах.
- Для расчета дифференциально выраженных микроРНК для каждого условия лечения, используйте файл с необработанными микроРНК читать рассчитывает в качестве ввода для программ, таких как DESeq212. DESeq2 присутствует в Галактике в геномике Анализ (RU) РНК-сек.; DESeq2 вкладка.
- Преобразуйте сырые считыватели в нормализованные подсчеты считываемых микроРНК. Подсчеты нормализуются в глубину библиотечной последовательности библиотеки через следующий расчет: (сырое читает/общее микроРНК читает)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот расчет обеспечивает нормализованные считываемые считываемые микроРНК на миллион (RPM), которые можно сравнить между наборами данных и биологическими условиями. Вывод — это файл делебина вкладок. Sailfish обеспечивает столбец выходного столбца tpm, хотя это значение нормализуется по длине шпильки microRNA, что не является необходимым в этом контексте. - Если это уместно, повторите выравнивание с пользовательскими последовательностями ввода (например, вектор), чтобы определить считываемые данные карты для поставленных конструкций, таких как shRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема шагов, связанных с подготовкой библиотеки
Общая схема мелкой экстракции РНК, секвенирования и выравнивания изложена на рисунке 2.
Образцы печени одного самца и одной самки мыши были собраны и заморожены в жидком азоте. Всего РНК была извлечена и оценена на качество и концентрацию.
Небольшое секвенирование РНК дает достаточную РНК для секвенирования
3 мкг РНК из двух независимых извлечений РНК были использованы в качестве исходного материала для мелкого секвенирования РНК. Образцы были запущены на гель акриламида и вырезаны между маркерами размера, соответствующими 17-28 nt РНК(рисунок 1A). Образцы были измельчены на фрагменты для изоляции РНК(рисунок 1B) и переданы в низкоудерживаемую 1,5 мл центрифуги трубки (рисунок1C). Штрих-коды bc7 и bc17(Таблица 1) были ligated к концу 5' малого RNA. Небольшие библиотеки РНК были усилены ПЦР с использованием 22 циклов ПЦР, чтобы дать 8,0 и 11,2 нг/Л продукт, соответственно. Образцы были объединены и 10 нМ объединенных выборка была представлена для высокой пропускной способности секвенирования с использованием 50 bp читать длину.
MiR-122 является наиболее распространенным микроРНК в печени мыши
После сортировки штрих-кодов, 851,931 считывает содержащиеся штрих-коды из печени образца 1 и 650 154 из пробы печени 2. Из считываемых 83,5% и 90,0% отображено на микроРНК соответственно, а остальные считывались на rRNA (1,8% и 0,6% соответственно), тРНК и фрагменты деградации мРНК. После выравнивания к шерлям микроРНК человека, мы наблюдали сильное согласование между микроРНК считывая отсчетами в каждой репликации (R2 и 0.998; Рисунок 3). В общей сложности было обнаружено 306 видов микроРНК, при этом наибольшее количество считывающих карт на miR-122(Дополнительная таблица 4). Изобилие микроРНК было схожим между образцами мужской и женской печени.
Рисунок 1. Извлечение небольших РНК из геля акриламида. (A) Акриламид гель и области, которая вырезана соответствующая размеру микроРНК. (B) Гель штук до и после разрезания на мелкие фрагменты. (C) Процесс передачи фрагментов геля в силиконовые трубки. (D) ПЦР реакция на низкорасплавленный гель агарозы, демонстрируя правильный клонированный продукт по сравнению с связующим продуктом и ненасыщенными (22 циклов) по сравнению с насыщенными (24 циклов) образцами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Схема протокола. Хронология, показывающая основные шаги, участвующие в процедуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Воспроизводимость результатов двух независимых извлечений РНК. Scatterplot микроРНК читать рассчитывает от мужской печени мыши (x-оси) по сравнению с женской печени мыши (y-оси) с помощью log10 основе масштаба. Каждая точка представляет считывание на миллион (RPM) отображенное микроРНК для каждого отдельного микроРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Грунтовка | Последовательности | |
| 3' связующий 1 | rAppCTGTAGGCATCAAT-NH2 | |
| маркер более низкого размера | rArurCrCrCrArurGrCrCrArCrArCrRGGTAGCGCGCGTCCC | |
| верхний маркер размера | rArArUrCrCrGrgrgrgrarururcrarurgrarararArArCrArararGGTAACCGCCATGCGTCCCCC | |
| barcode1 | /5AMMC6/ACGCTTGATTTTARCrCrG | |
| штрих-код2 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATTCrGRURC | |
| barcode3 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATCRCRGG | |
| barcode4 | /5AMMC6/ACGCTTCTGATTTARCrUrU | |
| barcode5 | /5AMMC6/ACGCTTCTGATTGRGRGrGRU | |
| штрих-код6 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATTGRURURA | |
| штрих-код7 | /5AMMC6/ACGCTTGATCTGATTTGATURUrurg | |
| barcode8 | /5AMMC6/ACGCTTGATCGATTCRCrC | |
| штрих-код9 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATTGRCrArg | |
| barcode10 | /5AMMC6/ACGCTTCTGATTTGATARArarC | |
| barcode11 | /5AMMC6/ACGCTTGATCTGATTTTTTTTTTURCrU | |
| штрих-код12 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATTCRAru | |
| barcode13 | /5AMMC6/ACGCTTCTGATTGATTARArgra | |
| штрих-код14 | /5AMMC6/ACGCTTCTGATTGATTTRURGRara | |
| штрих-код15 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATTTRGRGrG | |
| штрих-код16 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATTARUrurG | |
| штрих-код17 | /5AMMC6/ACGCTTGATTGATTURCrAru | |
| штрих-код18 | /5AMMC6/ACGCTTCTGATTGATTGRGRURAru | |
| RT грунтовка | АТТГАТГТГЦЦТАКАГ | |
| ПЦР грунтовка F | ААТГАТАКХАККАКСАКТАКАЦТАКАЦТАКТАККСТТТЦЦТАКАККККККККТКТГКТККТКККТККККККТККККККТККККТКККККТККККТКККТ | |
| ПЦР грунтовка R | КААГКААГААГААГАЗГАЗККАТАКАКТАККТКТТАТТАТГАТГТГКЦЦТАКАГАГ | |
Таблица 1. Список грунтовок.
Дополнительная таблица 1. Список последовательностей штрих-кодов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 2. Куратор список мыши микроРНК предшественникпоследовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 3. Куратор список человеческих последовательностей прекурсоров микроРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 4. Сырые и нормализованные микроРНК считывает. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на выявление микроРНК более 20 лет назад13, процесс секвенирования микроРНК остается трудоемким и требует специализированного оборудования, препятствуя лабораториям от регулярного принятия внутренних протоколов14. Другие методы могут одновременно оценивать микроРНК, такие как микрорнки микроаррей и мультиплексированные панели выражения; однако эти подходы ограничены тем, что они лишь количественно очисляют микроРНК, присутствующие в их наборе зондов. Из-за этого, они упускают важные особенности небольшого секвенирования РНК, как идентификация новых микроРНК, и микроРНК изоформы - нуклеозидные изменения, которые могут иметь важную биологическую функцию6,7,15 .
При запуске нового эксперимента использование коммерческого поставщика часто является простым, поскольку они обеспечивают техническую поддержку и простоту использования. Несколько коммерческих вариантов доступны для секвенирования микроРНК, которые могут быть мультиплексированы, чтобы уменьшить рабочую нагрузку при обработке большого количества образцов (Nogt;100). Эти коммерческие наборы постоянно совершенствуются, что является как преимуществом, так и недостатком. С одной стороны, компании, которые делают эти комплекты разработали новые методы улавливания микроРНК, например, путем круговой 5 и 3 концов до секвенирования или с помощью дегенеративных связующих со случайными последовательностями на каждом конце, чтобы уменьшить уклон перевязки. Они также разработали методы удаления адаптер-димеров, например, путем перевязки двухцепочечных адаптеров или гибридизации дополнительных олигонуклеотидов. С другой стороны, коммерческие комплекты рекомендуют не изменять или изменять любой шаг. Поэтому, если какие-либо обновления вносятся в комплект, трудно или невозможно сопоставить данные, полученные из старых и новых версий комплектов, а также данные, полученные из комплектов от различных коммерческих поставщиков. Здесь мы описали протокол, который имеет выносливость перед лицом коммерческих альтернатив. Наше внимание на шаги очистки геля - в то время как они добавляют время к протоколу - позволяет последовательного улавливания микроРНК и воспроизводимости в течение многих лет мы использовали его. Было проведено несколько оценок воспроизводимости между коммерческими комплектами и внутренние протоколы, и мы ссылаемся на читателя к некоторым из этих исследований16,17,18,19. Важно отметить, что шаги, которые мы намечаем для биоинформатического анализа микроРНК, могут быть использованы независимо от выбора комплекта или штатного протокола.
Секвенирование микроРНК часто беспокоит выбор штрих-кодов: в некоторых случаях эффективность перевязки различных штрих-кодов может не быть эквивалентной, что приводит к предвзятому распределению последовательностей в образцах20. В настоящее время рекомендуется использовать дегенеративные базы на 5 и 3 конца, чтобы свести к минимуму перевязки смещения конкретных микроРНК21,22. В этом протоколе, мы не наблюдали эти вопросы перевязки и наблюдали последовательные считывания для технических и биологических репликации оценивается с различными штрих-кодами5,6,7,23, но важно знать о них. Методы, чтобы избежать перевязки смещения включают включение индекса праймеров в ПЦР праймеры, или добавить один или несколько случайных нуклеозидов РНК на 3 конца 5 адаптер последовательность (Таблица 1). Введение одного или нескольких синтетических шипов РНК, таких как C. elegans miR-39 микроРНК24, также является вариантом для целей нормализации, что имеет решающее значение для низкодоходных ситуаций, таких как количественное значение микроРНК от экзосомы. Аналогичным образом, для перевязки РНК, мы успешно использовали T4 РНК лигаза 1, но лигация с меньшим уклоном было продемонстрировано для усеченной форме T4 РНК лигаза 225. Наконец, Superscripts III и IV являются альтернативными ферментами обратной транскрипции, которые мы использовали без проблем.
Выбор базы данных микроРНК также может повлиять на окончательные нормализованные результаты. Проблема с кураторством микроРНК баз данных заключается в том, что несколько новых небольших РНК, перечисленных в качестве микроРНК на самом деле фрагменты повторяющихся элементов, а не добросовестных микроРНК2. Предпринимаются усилия по выходу из системы микроРНК, которые не соответствуют стандартным критериям, с тем чтобы следующая версия базы данных микроРНК была более уточнена; однако следующая итерация также содержит новых кандидатов, которые нуждаются в подтверждении. Когда микроРНК, полученные из повторного получения, включаются в ряды, они могут исказить результаты и перегрузить данные существующих микроРНК. Таким образом, использование хорошо курируемых наборов данных микроРНК от различных видов имеет важное значение26,27. Мы испытали наибольшую воспроизводимость при выравнивании небольшой РНК секвенирования читает куратор списки сохраненных микроРНК и включили эти шпильки в дополнительной таблице 2 и дополнительной таблице 3. Эти списки совпадают оценки около 500 высокой достоверности микроРНК в геноме человека2,26.
Как и в любой технике, результаты должны быть подтверждены с ортогональным подходом. Мы успешно воспроизвели небольшие результаты секвенирования РНК с небольшими РНК северных помарки, которые включают радиомаркировки зондов для подтверждения размера и относительного изобилия кандидатов микроРНК6,7,23. Количественные ПЦР микроРНК с использованием секьюрити и подтверждения целевых изменений мРНК с использованием qPCR и западного промотирования являются другими вариантами проверки.
Таким образом, мы предоставили метод изоляции и последовательности микроРНК и выполнения выравниваний против существующих баз данных микроРНК. Доступность реагентов и оборудования и использование инструментов с открытым исходным кодом для анализа должны сделать этот протокол доступным для всех. Наконец, этот протокол может быть использован в любой ткани или клеточной линии, чтобы дать высоко воспроизводимые, высококачественные чтения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Эндрю Файр и Марка Кей за рекомендации и предложения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P.
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C.
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S.
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
