Summary
Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.
Abstract
Tüm insan transkriptlerinin yarısının mikroRNA'lar tarafından düzenlendiği düşünülmektedir. Bu nedenle, mikroRNA ekspresyonu nicel hastalık durumlarında altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarabilir ve terapötik hedefler ve biyobelirteçler sağlayabilir. Burada, mikroRNA'ların doğru bir şekilde nasıl ölçültüldeceğiz ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Kısaca, bu yöntem mikroRNA'ları izole etmeyi, yüksek işlem lisi diziliş için uygun adaptörlere bağlamayı, son ürünleri güçlendirmeyi ve örnek bir kitaplık hazırlamayı tanımlar. Daha sonra, elde edilen sıralama okumalarını mikroRNA saç tokalarına nasıl hizalayacağımızı ve diferansiyel ifadelerini nasıl ölçeceğimize, normalleştireceğimize ve hesaplayacağımızı açıklarız. Çok yönlü ve sağlam, bu kombine deneysel iş akışı ve biyoinformatik analiz kullanıcıların doku çıkarma ile başlamak ve mikroRNA nicelik ile bitirmek sağlar.
Introduction
İlk olarak 1993 yılında keşfedilen1, şimdi yaklaşık 2000 mikroRNA'ların insan genomu 2'de bulunduğu tahmin edilmektedir. MikroRNA'lar genellikle 21-24 nükleotit uzunluğunda olan kodlamayan küçük RNA'lardır. Bunlar gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenleyicileridir, genellikle protein ekspresyonunu bastırmak ve mRNA'yı düşürmek için hedef genlerin 3-untranslated bölgesindeki (3-UTR) tamamlayıcı bölgelere bağlanır. MikroRNA'ların ölçülmesi gen ekspresyonu hakkında değerli bilgiler verebilir vebu amaçla çeşitli protokoller geliştirilmiştir 3.
Küçük RNA sıralaması ve açık kaynak biyoinformatik araçları kullanarak normalleştirilmiş okumaları analiz etmek için tanımlanmış, tekrarlanabilir ve uzun süreli bir protokol geliştirdik. Daha da önemlisi, protokolümüz hem endojen mikroRNA'ların hem de mikroRNA benzeri türler üreten dışa dönük olarak teslim edilen yapılarla eşzamanlı olarak tanımlanmasını sağlarken, bu haritayı ribozomal RNA'lar da dahil olmak üzere diğer küçük RNA türlerine en aza indirgemektedir ( rRNA'lar), RNA türetilmiş küçük RNA'ları (tsRNA'lar), tekrartüretilen küçük RNA'ları ve mRNA bozunma ürünlerini aktarın. Neyse ki, mikroRNA'lar 5 fosforilve 2-3hidroksile 4, bu diğer küçük RNA ve mRNA bozunma ürünlerinden ayırmak için kaldıraçlı bir özelliktir. MikroRNA klonlama ve sıralama için genellikle daha hızlı ve çok katlı daha kolay olan çeşitli ticari seçenekler mevcuttur; ancak, kit reaktiflerinin tescilli doğası ve sık sık yapılan değişiklikler numune çalıştırmalarını karşılaştırmayı zorlaştırır. Stratejimiz akrilamid ve agarose jel arıtma adımları ile mikroRNA'ların sadece doğru boyutunu toplama optimize eder. Bu protokolde, açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumalarını mikroRNA'lara hizalama yordamı da açıklıyoruz. Bu yönergeler kümesi, kütüphane hazırlama yöntemimiz veya ticari bir yöntemin kullanılıp kullanılmadığına bakılmaksızın, özellikle acemi bilişim kullanıcıları için yararlı olacaktır.
Bu protokol yayınlanmış birçok çalışmada kullanılmıştır. Örneğin, Dicer enziminin küçük saç tokası RNA'larını kök-döngü yapısının iç halkasından iki nükleotit uzaklıkta niskenin de bıraktığı mekanizmayı tanımlamak için kullanılmıştır - sözde "döngü sayma kuralı"5. Ayrıca rekombinant adeno ilişkili viral vektörlerden (rAAV) ifade edilen teslim edilen küçük saç tokası RNA'larının (shRNA) göreceli bolluğunu belirlemek ve karaciğerden önce tolere edilebilen shRNA ekspresyonunun eşiğini belirlemek için de bu yöntemleri uyguladık. aşırı shRNA ekspresyonu6 ile ilişkili toksisite . Bu protokolü kullanarak, karaciğerde mikroRNA-122 'nin yokluğuna yanıt veren mikroRNA'lar tespit ettik - yüksek derecede ifade edilmiş hepatikmikroRNA - aynı zamanda bu mikroRNA 7'nin bozulma paterni karakterize ederken. Protokolümüzü çok sayıda deneyde tutarlı bir şekilde kullandığımız için, numune hazırlıklarını boylamolarak gözlemleyebildik ve fark edilebilir bir toplu iş etkisi olmadığını gördük.
Bu protokolü paylaşırken amacımız, kullanıcıların uygun fiyatlı ekipman ve reaktifler ve ücretsiz biyoinformatik araçları kullanarak, hemen hemen her doku veya hücre hattında mikroRNA'ların yüksek kaliteli, tekrarlanabilir niceliksel olarak üretebilmelerini sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
Küçük RNA kitaplık hazırlığı
1. RNA yalıtımı
- Standart bir RNA izolasyon reaktifi veya mikroRNA'lar için zenginleşen bir kit kullanarak RNA'yı biyolojik bir kaynaktan izole edin. Dokular için, önceden soğutulmuş harç ve havan topu kullanarak sıvı nitrojen ve zemin de dondurulmuş numuneler ile başlamak en iyisidir.
- Her numunenin RNA bütünlüğünü, RNA'yı ölçebilen ve rna bütünlük numarası (RIN) sağlayan bir alet üzerinde ölçün. RINs >7 olmalıdır.
2. 3' adaptör ligasyonu
- PCR şerit tüplerinde bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın: 11 μL RNA (1-3 μg, her numune için aynı miktarda kullanılarak), 10x T4 RNA ligaz reaksiyon arabelleği 1,5 μL, ATP içermeyen, 1 μL poli-etilen glikol (PEG) ve 0,5 μL 3'-linker (100 μM Evrensel miRNA klonlama lin ker).
NOT: ATP'nin olmaması miRNA'ların zenginleşmesine yardımcı olur ve mRNA bozunma ürünlerinin klonlamasını en aza indirir. PEG moleküler bir kalabalık ajanı olarak hareket eder ve başarılı bir ligasyon geliştirir. Universal miRNA klonlama bağlayıcısı, 5' sonunda rna'ya kendi kendine bağlanmayı, daireselleşmeyi ve ligasyonu önlemek için 3' blokaj grubuna (amin) sahiptir. - Numuneleri 95 °C'de bir termocycler üzerinde 30-40 s. 1 dk. 1 dk. 1 μL T4 RNA ligaz 2 ekleyin ve 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatın. Numuneler kuluçkaya yatarken jeli (adım 2.3) hazırlayın.
NOT: Oda sıcaklığında kuluçka linker-linker ligasyonu önlemeye yardımcı olur. Ayrıca T4 RNA ligaz 1'i de başarıyla kullandık. - 8 M üre (20x20 cm jel için): 14,4 g üre, 3 mL 10x Tris-tamponlu etilentetraasetik asit (TBE), 11,2 mL %40 19:1 akrilamid ve H2O 30 mL içeren %15 poliakrilamid jelin 30 mL'sini hazırlayın. Çözelti en iyi 42 °C'de çözülür. Dökümden hemen önce polimerizasyon için %10 amonyum persülfat (APS) ve 30 μL tetrametilentilediamin (TEMED) ekleyin.
- Plastik bir döküm ve eklemek tarak 0,8 mm ayrılmış cam plakalar arasında dökün. Jel katılaştırıladıktan sonra (yaklaşık 20 dk), tanka 0,5x TBE ekleyin ve pipetleme yaparak artık üre kuyularını yıkayın.
- Üre jel girebilirsiniz, böylece örnek olmadan 25 dakika için sabit bir 375 V jel önceden çalıştırın, sonra tekrar kuyuları yıkayın.
NOT: Kullanılan güç kaynağı ve elektroforez sisteminin türüne bağlı olarak gerilim miktarının azaltılması gerekebilir. - Numuneler bağlama yapıldıktan sonra, numunelere 15 μL akrilamid yükleme boyası ekleyin (1:1 oranı için), ardından bir termocycler üzerinde 95 °C'de 5 dk denatüre.
- 37 ve 44 bp boyutunda 25 ng/μL, bir parça akrilamid yükleme boyası ile seyreltilmiş hazırlayın. Diziler Tablo1'de listelenmiştir.
- Örnekleri poliakrilamid jelinüzerine yükleyin ve her numunenin arasında en az bir şerit bırakın. Jel yönünü takip etmek için asimetrik bir desenle en az iki işaretçi kümesinden 20 μL yükleyin.
- Jeli ilk 15 dakika boyunca sabit 375 V'de çalıştırın ve kalan çalışma için sabit 425 V'a yükseltin. Bromofenol mavisi yaklaşık 2 saat sürer alt, yaklaşık 1-4 cm olana kadar çalıştırın.
NOT: Gerekirse, bromofenol mavisi alttan yaklaşık 1-4 cm olana kadar jel daha uzun bir süre daha düşük sabit voltajda çalıştırılabilir. - Bir plaka ayırıcı kullanarak cam plakalar jel çıkarın ve plastik bir sayfa koruyucu üzerine jel yerleştirin. 500 μL distile suda 5 μL ethidyum bromür seyreltin ve pipet üst açık mavi markerin hemen üzerindeki marker şeritlerine (Bkz. Şekil 1A).
DİkKAT: Ethidium bromür için eldiven kullanın ve atıkları yerel yönetmeliklere uygun olarak atın. 5 dakika oturalım. - Ultraviyole (UV) ışığı altında, jelleri her şeritte üstten alt kaleme kadar temiz jilet kullanarak kesin (Bkz. Şekil 1A). Laboratuvar sızdırmazlık filminin 4 x 4 cm karekarına aktarın, ardından jeli yatay olarak yaklaşık 4 kesik ve 12 küçük kare üretmek için dikey olarak 3 kesim ile kesin (Bkz. Şekil 1B).
- Pipet 400 μL 0.3 M NaCl sızdırmazlık film kare üzerine, ve huni jel parçaları içine 1.5 mL silikonlu tüpler (Şekil 1Cbakınız). Numuneleri bir gecede 4 °C'de bir nutator üzerinde çalkalayın.
NOT: Diğer düşük bekletme 1.5 mL tüpler silikonlu tüpler ikame edilebilir. - 4 °C'de en az 12 saat ajitasyondan sonra, numuneleri alın ve %100 etanollü konik tüple birlikte buza koyun.
- Yeni bir tüpe 400 μL süpernatant aktarın ve sonra 1 mL %100 etanol ve 1 000 15 mg/mL glikojen kantini ekleyin. 4 °C'de aşağı doğru dönerek ve gerektiğinde daha fazla boru lama ile mümkün olduğunca süpernatant topladığız danatant ı topladığız danemin. 1 saat için -80 °C'de veya 2 saat veya daha uzun süre -20 °C'ye yerleştirin. Glikojen coprecipitant pelet görünürlüğünü ve iyileşmesini artırır.
- 4 °C'de 17.000 x g'de 20-30 dk. Etanol ün tüm izlerini çıkarın ve pelet havasının 5 dk kurumasına izin verin.
3. 5' bağlayıcı ligasyon
- 6,5 μL'lik nükleaz içermeyen su yla boru lar içerek peleti yeniden askıya alın. Peletin birkaç dakika suda yatmasına izin vermek, önce yeniden süspansiyona yardımcı olacaktır.
- Peletin aşağı döndürüldükten ve suda yeniden susülettikten sonra, 0,5 μL 100 μM 5'-linker ekleyin (barkodlu; bakınız Tablo 1), 1 μL T4 RNA ligase tampon, 1 μL 10 mM ATP ve 1 μL PEG. Isı 90 °C'de 30 s, sonra buz üzerine yerleştirin. 1 μL T4 RNA ligaz 1 ekleyin ve 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- 0,3 M NaCl 400 μL ekleyin, ardından asit fenol / kloroform 400 μL. Vortex 30 s - 1 dk (çözelti bulutlu görünecektir), ve sonra bir mikrocentrifuge (~ 17.000 x g) maksimum hızda 10-15 dakika için 4 °C spin . Üst katmanı çizin ve yeni 1,5 mL tüp yerleştirin.
NOT: Alt tabakadan herhangi birini pipetlemekten kaçının. - 350 μL kloroform ekleyin, girdap kısaca, ve sonra 4 °C'de 10 dakika maksimum hızda (~17.000 x g) döndürün. Daha sonra üstten çekin ve yeni 1,5 mL tüpe yerleştirin. Glikojen coprecipitant 1.5 μL ve 1 mL% 100 etanol ekleyin.
NOT: Yine, alt tabakadan herhangi birini pipetleme kaçının. - Girdap kısaca, daha sonra -80 °C'de en az 1 saat veya -20 °C'de bir gecede yerleştirin.
4. Ters transkripsiyon (RT)
- 42 °C'lik ısı bloğunu açın. Örnekleri 20-30 dk boyunca 4 °C ve ~17.000 x g'de döndürün.
- 8,25 μL nükleaz içermeyen sudaki peletli numuneyi yeniden askıya alın, sonra şunu ekleyin: 0,5 μL 100 μM RT astar (Tablo1), ve cDNA sentez kitinden 5 μL 2x RT Reaksiyon Karışımı. 42 °C'de 3 dk kuluçkaya yatırın.
- Her numuneye 1,5 μL 10x RT enzimi ekleyin ve 42 °C'de 30 dakika boyunca bir termocycler içinde kuluçkaya yatırın. -20 °C'ye yerleştirin veya hidroliz ve nötralizasyon ile devam edin.
NOT: 4.2 ve 4.3 adımları için birkaç RT kitleri kullanılabilir. - Alkali hidroliz ve nötralizasyon gerçekleştirin: 1 mL 150 mM potasyum hidroksit (KOH) çözeltisi (150 μL 1 M KOH, 20 μL 1 M Tris Base pH 7.5 ve 830 μL H2O) ve 1 mL 150 mm hidroklorik asit (HCl) (150 μL 1 M HCl ve 850 μL h2O).
- Numunelere eklemeden önce, KOH çözeltisini nötralize etmek için gereken HCl miktarını belirleyin. Genellikle, yaklaşık 20-24 μL HCl KOH 25 μL nötralize edecektir. Doğru aralıkta olduğundan emin olmak için pH şeridindeki kombinasyonu kontrol edin (pH 7.0 - 9.5).
- Numuneleri 150 mM KOH çözeltisi 25 μL ekleyerek hidrolize edin ve 95 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- 7.0 ile 9.5 arasında son bir numune pH elde etmek için, adım 4.4'te belirlenen 150 mM HCl miktarını ekleyerek numuneleri nötralize edin.
5. PCR amplifikasyon
- Nötralizasyondan sonra, 29,5 l su, 5 μL 10x Taq tamponu, 1 μL dNTP, 2 μL 25m ileri astar (Tablo1), 2 0 00L 25 mm ters astar (Tablo 1), 0,5 μL Taq ve 10 μL ters transkripsiyonu cDNA 4.6'dan .
- Aşağıdaki PCR reaksiyonu çalıştırın: 2 dk için 94 °C, 45 s için 94 °C'nin 20 döngüsü, 75 s için 50 °C ve 60 s için 72 °C.
- Adım 5.2'den 5 μL ürün kullanarak yaklaşık 2-4 döngü daha ikinci bir PCR reaksiyonu çalıştırın. Karışım: 34.8 μL su, 5 μL 10x Taq tampon, 1 μL dNTP, 1 μL 25m ileri astar (Tablo 1), 1 μL 25 μM ters astar (Tablo 1), ve 0.2 μL Taq polimeraz. Adım 5.2'de belirtilen termocycler parametrelerini takip edin.
NOT: İki PCR reaksiyonu yapmanın amacı - ilki 20 döngü, ikincisi ise sadece 2-4 daha fazla olmak üzere - güçlendirilmiş cDNA miktarının dinamik aralıkta olmasını sağlamaktır (yani doymuş bir miktar değil).
6. Agarose jel arıtma
- Düşük eriyen agarose ile% 4 agarose jel hazırlayın. PcR ürününün 40 μL veya daha fazlasını jelüzerine yükleyin ve boyayı yükleyin. 100 bp ve 25 bp boyut işaretleri yükleyin.
NOT: 25 bp merdiven linker-linker ligasyon ürünleri amplifikatör ürün ayırt etmek için yardımcı olur. Düşük eriyen agarose jelleri geleneksel agarose jelleri daha büyük bir özenle döküm olmalıdır, bu yüzden yakından üreticinin talimatları izleyin. - Jel ekstraksiyonu için, jel üzerinde görünen ancak doygun olmayan çevrim numarasını seçin (genellikle 22-24 döngü). Birden çok örnek çalıştırırken benzer yoğunluk bantlarını seçin.
- 125 bp bandının üzerindeki bandı kesin (25 bp merdivendeki koyu bant; bkz. Şekil 1D). Bir jel çıkarma kiti kullanarak, % 4 jel dayalı tampon eklemek için üreticinin talimatları izleyin, sonra oda sıcaklığında tampon agarose eritmek için sallamak.
NOT: 55 °C'de çözünme, linker-linker ligasyonu potansiyelini artırır. - Üreticinin jel çıkarma talimatlarına uyun ve 30 μL elüsyon tamponu veya su ile ellayın. Ürün jel üzerinde zayıf görünüyordu, o zaman 20 μL elüasyonu azaltmak.
- CDNA konsantrasyonu hassas bir teknik kullanarak ölçün ve sıralama için örnek kitaplığı hazırlayın. Hazırlık kullanılan sıralama türüne bağlıdır.
NOT: Sıralama kitaplığı için minimum gereksinimler genellikle 10 μL'lik 10 μL'lik bir ürün hacmidir. Konsantrasyonlar çok düşükse, kütüphaneyi istenilen konsantrasyona ulaştırmak için havuz ve etanol çökelti örnekleri. - Mevcut ekipmanı kullanarak örnekleri sırala. Yaygın bir örnek, fastq çıkış biçiminde yaklaşık 15-25 milyon okuma elde etmek için, 50 bp tek okuma için bir kit kullanarak örnekleri çalıştırmak olacaktır.
Küçük RNA dizi hizalama ve biyoinformatik
7. Veri yükleme
- Her sıralama çalışmasından oluşturulan FASTQ dosyalarını indirin. 8,9,10miRbase.org mikroRNA saç tokası dizilerinin listesini indirin.
- www.usegalaxy.org bir Galaxy hesabı oluşturun ve bu hesaba bir FASTQ sırası dosyası yükleyin.
- Metin dosyası olarak kullanılabilen barkod.txt gibi barkod dizilerinden oluşan bir metin dosyasını Galaxy hesabına yükleyin (EkTablo1).
- miRBase.org gibi bir veritabanından Galaxy hesabına microRNA saç tokaları fasta dosyası yükleyin. Ek Tablo 2 ve Ek Tablo3'te fare (mousehairpins.fa) veya insan (humanhairpins.fa) mikroRNA öncülleri örnekleri verilmiştir.
8. Adaptör kaldırma, barkod sıralama ve kırpma
- Sol sekmede Genomik dosya işleme > FASTA/FASTQ > Klip bağdaştırıcı dizilerinegidin.
- FASTA veya FASTQ formatında Giriş dosyasına,açılan listeden FASTQ dosyasını girin. Minimum dizi uzunluğunu 18 olarak değiştirin. Özel sırayı girmekiçin Kaynağı değiştirin. CTGTAGGCgirin. Diğer tüm varsayılan parametreleri saklayın. Yürüt'etıklayın.
NOT: 18 nükleotitten daha kısa olan sıra okumaların mikroRNA'larla benzersiz olarak haritalanması zordur ve birçok bozulma ürünü içerir. - Sol sekmede Genomik dosya işleme > FASTA/FASTQ > BarkodAyırıcı'ya gidin.
NOT: Gökada işlevleri ve üstbilgi düzenli olarak güncellenir, bu nedenle eşdeğer bir aracı veya konumunu bulmak için arama işlevi gerekebilir. Dizine eksita kullanan ticari kitler genellikle barkoda göre sıralanır. Bu nedenle, ticari bir kitten başlayarak bu adım ve barkod döşeme adımı gerekli değildir. - Barkodların kullanmasıiçin, barkodlar.txt'yeişaret edin. Kitaplık'ın bölünmesi içinönceki adımda üretilen veri dosyasında Clip'i kullanın. İzin verilen uyuşmazlık sayısı, 1girin . Yürüt'etıklayın.
- İlk 4 nükleotiti kırpın: Metin Manipülasyonları > Kırpma satır aralığı na veya sondakikarakterlere gidin. Giriş veri kümesiiçin, bir veri kümesi koleksiyonu olan klasör simgesine tıklayın. Verilerde Barkod ayırıcıetiketini içeren örneklerin toplu dosyasını seçin. Trim başından bu konuma kadar, 5girin . IN IN FASTQ formatında giriş veri seti var mı? Yürüt'etıklayın. Yürütme birkaç dakika sürebilir.
9. Okumaların mikroRNA'lara hizalanması
- Galakside Genomik Analizi > RNA-Seq > Sailfish transkript nicelemesi11'e gidin.
- Soru için geçmişinizden bir referans transkriptomu seçin veya yerleşik bir dizin kullanın? Yüklenen dosyayı farehairpins.fa açılır listesinden girin. FASTA/Q dosyasında, bir veri kümesi koleksiyonunu kullanmak için klasör simgesini tıklatın ve koleksiyonda Kırpmaiçeren dosyayı seçin. Yürüt'etıklayın. Yürütme birkaç dakika sürebilir.
- Sağdaki tarih sekmesinde, koleksiyondaki Sailfish'e tıklayın... 19 öğeli bir liste. Her bir dosyaya tıklayın ve yerel bilgisayara kaydetmek için disk simgesini tıklatın. Tek tek indirilen dosyaların önce sıkıştırılmamış olması gerekir. Ayrıca, elektronik tabloya aktabilmek için .txt uzantısı ile yeniden kaydedilmesi gerekebilir.
- Her elektronik tablo dosyasını açın ve NumReads sütununu tedavi durumuna yeniden adlandırın. İlk sütunda mikroRNA matrisi oluşturmak ve sonraki sütunlarda durum başına sayımları okumak için sütunları birleştirin.
- Her tedavi koşulu için farklı olarak ifade edilen mikroRNA'ları hesaplamak için, deSeq212gibi programlar için giriş olarak ham mikroRNA okuma sayılarını kullanarak dosyayı kullanın. DESeq2 Genomik Analizi > RNA-seq > DESeq2 sekmesinde Galaxy mevcuttur.
- Ham okumaları normalleştirilmiş microRNA okuma sayılarına dönüştürün. Sayımlar aşağıdaki hesaplama ile kitaplığın kitaplık sıra derinliğine normalleştirilmiştir: [(ham okuma/toplam mikroRNA okuma) * (1.000.000 – sayılan mikroRNA sayısı) + 1].
NOT: Bu hesaplama, veri kümeleri ve biyolojik koşullar arasında karşılaştırılabilir milyon (RPM) eşlenmiş mikroRNA'lar başına normalleştirilmiş bir okuma sağlar. Çıktı, sekme delimited bir dosyadır. Yelken balığı bir tpm çıkış sütunu sağlar, ancak bu değer mikroRNA saç tokası uzunluğu ile normale döndürülebilir, bu bağlamda gerekli değildir. - Alakalıysa, shRNA'lar gibi teslim edilen yapılara göre bu haritayı belirlemek için özel giriş dizileriyle (örneğin, bir vektör) hizalamayı tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kütüphane hazırlığında yer alan adımların şeması
Küçük RNA çıkarma, sıralama ve hizalamanın genel şeması Şekil2'de özetlenmiştir.
Bir erkek ve bir dişi fareden karaciğer örnekleri toplandı ve sıvı nitrojeniçinde dondurulmuş olarak tutturdu. Toplam RNA çıkarıldı ve kalite ve konsantrasyon açısından değerlendirildi.
Küçük RNA sıralama, sıralama için yeterli RNA verimi verir
Küçük RNA sıralamaiçin başlangıç malzemesi olarak iki bağımsız RNA ekstraksiyonundan 3 μg RNA kullanılmıştır. Örnekler akrilamid jel üzerinde çalıştırıldı ve RNA 17-28 nt karşılık gelen boyut belirteçleri arasında kesilmiş (Şekil1A). Numuneler RNA izolasyonu (Şekil1B)için parçalara bölündü ve düşük bekletme 1.5 mL santrifüj tüpüne (Şekil1C)aktarıldı. Barkodlar bc7 ve bc17 (Tablo1)küçük RNA'nın 5' ucuna bağlandı. Küçük RNA kütüphaneleri, sırasıyla 8.0 ve 11.2 ng/μL ürün elde etmek için 22 çevrim PCR kullanılarak PCR güçlendirilmiştir. Örnekler bir araya getirildi ve 50 bp okuma uzunluğu kullanılarak yüksek iş eldeli sıralama için 10 nM havuzlu bir örnek gönderildi.
MiR-122 fare karaciğerinde en bol bulunan mikroRNA'dır.
Barkod sıralamasonra, 851.931 okuma karaciğer örneği 1 ve 650.154 karaciğer örnek 2 barkodlar içeriyordu. Okumaların %83,5'i ve %90,0'ı sırasıyla mikroRNA'lara eşlenirken, geri kalan okumalar rRNA'lara (%1,8 ve %0,6), TRNA ve mRNA bozunma parçalarına eşlendi. İnsan mikroRNA saç tokaları hizaladıktan sonra, her çoğaltma (R2 = 0.998; Şekil 3). Toplam 306 mikroRNA türü tespit edildi ve en fazla okuma sayısı miR-122 'ye (EkTablo4) çıkarıldı. MikroRNA bolluğu erkek ve kadın karaciğer örnekleri arasında benzerdi.
Şekil 1. Akrilamid jelden küçük RNA'ların çıkarılması. (A) Akrilamid jel ve mikroRNA boyutuna karşılık gelen kesilir bölge. (B) Jel parçaları önce ve sonra küçük parçalar halinde kesme. (C) Jel parçalarının silikonlu tüplere aktarılması işlemi. (D) düşük erimiş agarose jel üzerinde PCR reaksiyonu, linker-linker ürünü ve doymamış (22 döngü) ile karşılaştırıldığında doğru klonlanmış ürünü gösteren doymuş (24 döngü) numuneler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Protokol şeması. Yordamda yer alan önemli adımları gösteren bir zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. İki bağımsız RNA çıkarma sonuçlarının tekrarlanabilirliği. MicroRNA dağılım bir erkek fare karaciğer (x-ekseni) bir günlük 10 tabanlı ölçek kullanarak bir kadın fare karaciğer (y-ekseni) ile karşılaştırıldığında sayıları okuyun. Her nokta, her bir mikroRNA için milyon (RPM) eşlenen mikroRNA sayısını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar | Sıra | |
| 3' bağlayıcı 1 | rAppCTGTAGGCACCACAAT-NH2 | |
| alt boy işaretleyici | rArUrCrCrCrArUrCrUrGrArCrRUrArGGTAACCCATCATCGTC | |
| üst boy marker | rArArUrCrArGrGrGrUrUrGrCrCrArArCrGrUrArCrUrArCrCrArArARGGTAACCCATCATCGTC | |
| barkod1 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArgrcrg | |
| barkod2 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrGrUrC | |
| barkod3 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrurgrg | |
| barkod4 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArCruru | |
| barkod5 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrGrGrU | |
| barkod6 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrUrA | |
| barkod7 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrUrUrUrUrG | |
| barkod8 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrcrgrC | |
| barkod9 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrCrArG | |
| barkod10 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArurArC | |
| barkod11 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrurcru | |
| barkod12 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrArArU | |
| barkod13 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArargra | |
| barkod14 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrgrArA | |
| barkod15 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrgrgrgg | |
| barkod16 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArururg | |
| barkod17 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrArU | |
| barkod18 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrAru | |
| RT astar | ATTGATGGTGCCTACAG | |
| PCR astar F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |
| PCR astar R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG | |
Tablo 1. Astarlistesi.
Ek Tablo 1. Barkod dizileri listesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Tablo 2. Fare mikroRNA öncül dizilerinin küratörlü listesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Tablo 3. İnsan mikroRNA öncül dizilerinin küratörlüğünü yaptığı liste. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Tablo 4. Ham ve normalleştirilmiş mikroRNA okuma sayıları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
20 yıl önce13üzerinde mikroRNA belirlenmesine rağmen , mikroRNA sıralama süreci zahmetli kalır ve özel ekipman gerektirir, rutin in-house protokolleri benimseyen laboratuvarları engelleyen14. Diğer teknikler aynı anda mikroRNA'ları değerlendirebilir, mikroRNA mikrodizileri ve çok katlı ekspresyon panelleri gibi; ancak, bu yaklaşımlar sadece sonda setlerinde bulunan mikroRNA'ları ölçtükleri için sınırlıdır. Bu nedenle, onlar küçük RNA sıralama önemli özellikleri özledim, yeni mikroRNA ların belirlenmesi gibi, ve mikroRNA izoformların - önemli biyolojik işlevi olabilir nükleozit değişiklikleri6,7,15 .
Yeni bir deneme başlatırken, teknik destek ve kullanım kolaylığı sundukları için ticari bir satıcı kullanmak genellikle en kolayıdır. Çok sayıda (>100) numune işlenirken iş yükünü azaltmak için çok katlı olabilecek mikroRNA sıralaması için çeşitli ticari seçenekler mevcuttur. Bu ticari kitleri sürekli bir avantaj ve dezavantaj hem de geliştirilmiş ediliyor. Bir yandan, bu kitleri yapan şirketler yeni mikroRNA yakalama yöntemleri geliştirdik, örneğin, onların 5 ve 3 uçları siralama önce daireselleştirme yoluyla veya ligasyon önyargı azaltmak için her ucunda rasgele dizileri ile dejenere bağlayıcılar kullanarak. Ayrıca adaptör-dimerkaldırmak için yöntemler geliştirdik, örneğin, çift iplikli adaptörlerin ligasyonu veya tamamlayıcı oligonükleotidhibridizasyon yoluyla. Diğer taraftan, ticari kitleri herhangi bir adım değişiklik veya değişiklik karşı öneririz. Bu nedenle, bir kit için herhangi bir güncelleştirme yapılırsa, kitlerin eski ve yeni sürümlerinden türetilen verilerin yanı sıra farklı ticari satıcılardan alınan kitlerden türetilen verileri karşılaştırmak zor veya imkansızdır. Burada, ticari alternatifler karşısında gücü elinde olan bir protokol tanımladık. Jel arıtma adımlarına odaklanmamız - protokole zaman eklerken - kullandığımız uzun yıllar boyunca tutarlı mikroRNA yakalama ve tekrarlanabilirlik sağlar. Ticari kitleri ve şirket içi protokoller arasında tekrarlanabilirlik çeşitli değerlendirmeler yapılmıştır, ve biz bu çalışmaların birkaç okuyucu bakın16,17,18,19. Daha da önemlisi, mikroRNA'ların biyoinformatik analizi için ana hatladığımız adımlar, kit veya şirket içi protokol seçimine bakılmaksızın kullanılabilir.
MicroRNA sıralama genellikle barkod seçimi ile sorunlu: bazı durumlarda, çeşitli barkodların ligasyon verimliliği eşdeğer olmayabilir, örnekleri20dizileri önyargılı dağılımları yol açan . Şimdi belirli mikroRNA'ların ligasyon önyargılarını en aza indirmek için 5 ve 3 ucunda dejenere bazlar kullanılması tavsiye edilir21,22. Bu protokolde, bu ligasyon sorunları gözlenmemiş ve farklıbarkodlar5,6,7,23ile değerlendirilen teknik ve biyolojik çoğaltmalar için tutarlı okumalar gözlenmiştir , ama bunların farkında olmak önemlidir. Ligasyon sapmasını önlemek için yöntemler arasında PCR astarlarına indeks astarlarının eklenmesi veya 5 bağdaştırıcı dizisinin 3 ucuna bir veya daha fazla rasgele RNA nükleoziti eklenmesi yer almaktadır (Tablo 1). C. elegans miR-39 microRNA24gibi bir veya daha fazla sentetik ani RNA'nın tanıtılması, ekzozomlardan mikroRNA'ların ölçülmesi gibi düşük verimli durumlar için kritik öneme sahip olan normalleştirme amaçları için de bir seçenektir. Aynı şekilde, RNA ligasyonu için, biz başarıyla T4 RNA ligaz 1 kullandık, ama daha az önyargı ile ligasyon T4 RNA ligase 225kesilmiş bir form için gösterilmiştir . Son olarak, Superscripts III ve IV biz sorun olmadan kullanmış alternatif ters transkripsiyon enzimleri vardır.
MikroRNA veritabanı seçimi de son normalleştirilmiş sonuçları etkileyebilir. MikroRNA veritabanları küratörlük ile bir meydan okuma birkaç yeni küçük RNA mikroRNA olarak listelenen aslında tekrar elemanlarının parçaları ve iyi niyetli microRNA2olmasıdır. MikroRNA veritabanının bir sonraki sürümü daha rafine olmak için standart kriterlere uymayan mikroRNA'ların emekliye ayrılması için çaba gösterilmiştir; ancak, bir sonraki yineleme de onay gerektiren yeni adaylar içerir. Tekrartüretilen mikroRNA'lar hizalamalara dahil edildiğinde, sonuçları çarpıtabilir ve mevcut mikroRNA'lardan elde edilen verileri bastırabilirler. Bu nedenle, farklı türlerden mikroRNA'ların iyi seçilmiş veri kümelerinin kullanımı esastır26,27. Küçük RNA sıralama okumalarını korunmuş mikroRNA'ların küratörlü listelerine hizalarken en büyük tekrarlanabilirliği yaşadık ve bu saç tokalarını Ek Tablo 2 ve Ek Tablo 3'te de dahil ettik. Bu listeler insan genomu2,26yaklaşık 500 yüksek güven mikroRNA tahminleri maç .
Herhangi bir teknikte olduğu gibi, sonuçlar ortogonal bir yaklaşımla doğrulanmalıdır. Biz başarıyla aday microRNA6,7,23boyutunu ve göreceli bolluk onaylamak için radiolabeled problar dahil küçük RNA kuzey lekeleri ile küçük RNA sıralama sonuçları çoğaltılabilir . Bölünmüş okuma sıralaması nı kullanan mikroRNA'ların sayısal PCR'leri ve qPCR ve western blotting kullanılarak hedef mRNA değişikliklerinin teyidi diğer doğrulama seçenekleridir.
Özetle, mikroRNA'ları izole etmek ve sıralamak ve mevcut mikroRNA veritabanlarına karşı hizalamalar gerçekleştirmek için bir yöntem sağladık. Reaktiflerin ve ekipmanların karşılanabilirliği ve analiz için açık kaynak araçlarının kullanılması bu protokolü herkes için erişilebilir hale getirmelidir. Son olarak, bu protokol herhangi bir doku veya hücre hattı son derece çoğaltılabilir, yüksek kaliteli okuma verim için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz rehberlik ve öneriler için Andrew Fire ve Mark Kay laboratuvarları üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P.
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C.
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S.
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
