Summary
Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.
Abstract
A metade de todas as transcrições humanas é pensada para ser regulada por microRNAs. Portanto, a quantificação da expressão de microRNA pode revelar mecanismos subjacentes nos Estados de doença e fornecer alvos terapêuticos e biomarcadores. Aqui, detalhamos como quantificar com precisão microRNAs. Resumidamente, este método descreve isolando microRNAs, ligando-os a adaptadores adequados para sequenciamento de alta taxa de transferência, amplificando os produtos finais e preparando uma biblioteca de exemplo. Em seguida, explicamos como alinhar as leituras de sequenciamento obtidas aos grampos de cabelo microRNA e quantificar, normalizar e calcular sua expressão diferencial. Versátil e robusto, este fluxo de trabalho experimental combinado e a análise Bioinformatica permitem que os usuários comecem com a extração do tecido e termine com quantificação de microRNA.
Introduction
Descoberto pela primeira vez em 19931, estima-se agora que cerca de 2000 microRNAs estão presentes no genoma humano2. MicroRNAs são pequenos não-codificando RNAs que são tipicamente 21-24 nucleotídeos longo. São reguladores pós-transcripcionais da expressão gênica, muitas vezes vinculando-se a sítios complementares na região 3-não traduzida (3-UTR) de genes alvo para reprisarem a expressão protéica e degradar o mRNA. Quantificando microRNAs pode dar uma visão valiosa sobre a expressão gênica e vários protocolos foram desenvolvidos para esta finalidade3.
Nós desenvolvemos um protocolo definido, reprodutível, e de longa data para o sequenciamento de RNA pequeno, e para analisar leituras normalizadas usando ferramentas de Bioinformática de código aberto. É importante ressaltar que nosso protocolo possibilita a identificação simultânea de microRNAs endógenos e construções exogenamente entregues que produzem espécies semelhantes a microRNA, enquanto minimiza leituras que mapeiam para outras espécies de RNA pequenas, incluindo RNAs ribossômicas ( rRNAs), transferir RNAs pequenas derivadas de RNA (tsRNAs), RNAs pequenas derivadas de repetição e produtos de degradação de mRNA. Felizmente, os microRNAs são 5-fosforilados e 2-3 hidroxilados4, um recurso que pode ser aproveitado para separá-los dessas outras pequenas RNAs e produtos de degradação de mRNA. Existem várias opções comerciais para a clonagem e sequenciamento do microRNA que muitas vezes são mais rápidas e fáceis de multiplexação; no entanto, a natureza proprietária de reagentes de kit e suas modificações freqüentes faz comparando amostra corre desafiador. Nossa estratégia otimiza a coleta apenas o tamanho correto de microRNAs através de acrilamida e etapas de purificação de gel de agarose. Neste protocolo, também descrevemos um procedimento para alinhar leituras de sequência a microRNAs usando ferramentas de código aberto. Este conjunto de instruções será especialmente útil para usuários de informática novatos, independentemente de se o nosso método de preparação de biblioteca ou um método comercial é usado.
Este protocolo tem sido utilizado em vários estudos publicados. Por exemplo, ele foi usado para identificar o mecanismo pelo qual a enzima Dicer cliva pequenas RNAs hairpin a uma distância de dois nucleotídeos do laço interno da estrutura de loop-tronco-a chamada "regra de contagem de loop"5. Nós igualmente seguimos estes métodos para identificar a abundância relativa de RNAs pequenos entregados do hairpin (shRNA) expressado dos vetores virais adeno-associados de recombinação (rAAVs), para identificar o ponto inicial da expressão de shRNA que pode ser tolerada antes do fígado toxicidade associada à expressão excessiva de shRNA6. Usando este protocolo, nós igualmente identificamos microRNAs no fígado que respondem à ausência de microRNA-122-um microRNA hepatic altamente expressado-ao igualmente caracterizar o teste padrão da degradação deste microRNA7. Porque nós usamos nosso protocolo consistentemente em experiências numerosas, nós pudemos observar longitudinalmente preparações da amostra, e vemos que não há nenhum efeito discernível do grupo.
Ao compartilhar este protocolo, nosso objetivo é permitir que os usuários gerem alta qualidade, quantificação reprodutível de microRNAs em praticamente qualquer linha de tecido ou célula, usando equipamentos e reagentes acessíveis e ferramentas de Bioinformática gratuitas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentos com animais foram autorizados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Washington.
Preparação pequena da biblioteca do RNA
1. isolação do RNA
- Isole o RNA de uma fonte biológica usando um reagente padrão do isolamento do RNA, ou um jogo que enriquece para microRNAs. Para os tecidos, é melhor começar com amostras snap-congelado em nitrogênio líquido e terra a um pó usando um almofariz pré-resfriado e pilão.
- Meça a integridade do RNA de cada amostra em um instrumento que possa quantificar o RNA e forneça um número da integridade do RNA (RIN). RINs devem ser > 7.
2.3 ' ligadura do adaptador
- Prepare uma reação de ligadura em tubos de tiras de PCR, combinando: 11 μL de RNA (1-3 μg, usando a mesma quantidade para cada amostra), 1,5 μL de tampão de reação da ligase de RNA de 10x T4, ATP-livre, 1 μL de Poli-etileno glicol (PEG) e 0,5 μL de 3 '-Linker (100 μM universal miRNA clonagem Lin de um doente).
Nota: a ausência de ATP ajuda a enriquecer para miRNAs e minimiza a clonagem de produtos de degradação de mRNA. PEG atua como um agente de aglomeração molecular, melhorando a ligadura bem sucedida. O vinculador universal do clonagem de Mirna tem um grupo de obstrução 3 ' (Amine) para impedir o Self-ligadura, a circularização, e a ligadura ao RNA na extremidade 5 '. - Aqueça as amostras a 95 ° c num termociclador para 30-40 s. arrefecer no gelo durante 1 min. adicionar 1 μL de RNA de T4 ligase 2 e incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Prepare o gel (passo 2,3) enquanto as amostras estão incubando.
Nota: incubação à temperatura ambiente ajuda a evitar ligadura linker-linker. Nós igualmente usamos com sucesso a ligase do RNA T4 1. - Prepare 30 mL de um gel de poliacrilamida a 15% com ureia de 8 M (para um gel de 20x20 cm): 14,4 g de ureia, 3 mL de 10x ácido etilenodiaminotraacético com tampão Tris (TBE), 11,2 mL de 40% 19:1 acrilamida e H2o a 30 ml. A solução é melhor dissolvida a 42 ° c. Imediatamente antes da fundição, adicione 150 μL de persulfato de amônio a 10% (APS) e 30 μL de tetrametilenodiamina (TEMED) para polimerização.
- Despeje entre 0,8 mm separados placas de vidro em um molde de plástico e inserir pente. Uma vez que o gel é solidificado (aproximadamente 20 minutos), adicione 0.5 x TBE ao tanque e lave poços da ureia residual introduzindo com pipting vigorously.
- Pre-Run o gel em uma constante 375 V por 25 min sem amostras para que a ureia pode entrar no gel, em seguida, lave os poços novamente.
Nota: a quantidade de tensão pode precisar de ser reduzida dependendo do tipo de fonte de alimentação e do sistema da electroforese que é usado. - Uma vez que as amostras são feitas de ligadura, adicione 15 μL de corante de carga de acrilamida para as amostras (para uma proporção de 1:1), em seguida, desnaturar por 5 min a 95 ° c em um termociclador.
- Prepare 25 ng/μL de 37 e 44 BP marcadores de tamanho, diluído com uma parte de acrilamida corante de carga. As sequências estão listadas na tabela 1.
- Coloque as amostras no gel de poliacrilamida, deixando pelo menos uma faixa entre cada amostra. Carregar 20 μL de pelo menos dois conjuntos de marcadores, num padrão assimétrico para acompanhar a orientação do gel.
- Execute o gel em uma constante 375 V para os primeiros 15 min e, em seguida, aumente para uma constante 425 V para a execução restante. Corra até que o azul do bromofenol esteja aproximadamente 1-4 cm da parte inferior, que toma aproximadamente 2 h.
Nota: se necessário, o gel pode ser executado em uma tensão constante mais baixa por um período de tempo mais longo até que o azul do bromofenol esteja aproximadamente 1-4 cm da parte inferior. - Retire o gel das placas de vidro usando um separador de placa, e coloque o gel em um protetor de página de plástico. Diluir 5 μL de brometo de etídio em 500 μL de água destilada e pipetar para as vias do marcador logo acima do marcador azul claro superior (ver Figura 1a).
PRECAUÇÃO: Utilize luvas para brometo de etídio e elimine os resíduos de acordo com as regulamentações locais. Deixe descansar por 5 min. - a luz ultravioleta (UV), corte os géis de cima para baixo marcador em cada pista usando lâmina de barbear limpa (ver Figura 1a). Transferir para um quadrado de 4 x 4 cm de filme de vedação de laboratório, em seguida, cortar o gel com cerca de 4 cortes horizontalmente e 3 verticalmente para produzir 12 pequenos quadrados (ver Figura 1b).
- Pipete 400 μL de 0,3 M de NaCl para o quadrado do filme de vedação e peças em gel de funil em tubos siliconizados de 1,5 mL (ver Figura 1C). Agitar as amostras em um pulverizador a 4 ° c durante a noite.
Nota: outros tubos de 1,5 mL de baixa retenção podem ser substituídos por tubos siliconizados. - Após pelo menos 12 h de agitação a 4 ° c, recupere as amostras e coloque-as no gelo, juntamente com um tubo cônico de etanol a 100%.
- Transfira 400 μL de sobrenadante para um novo tubo e, em seguida, adicione 1 mL de etanol a 100% e 1 μL de coprecipitante de glicogênio 15 mg/mL. Assegure-se de recolher o máximo de sobrenadante possível, girando para baixo a 4 ° c e pipetando mais conforme necessário. Coloc em-80 ° c para 1 h, ou-20 ° c por 2 h ou mais por muito tempo. O coprecipitant do glycogen melhora a visibilidade e a recuperação da pelota.
- Gire a 4 ° c a 17.000 x g por 20-30 min. Remova todos os traços de etanol e deixe secar o ar da pelota por 5 min.
3.5 ' ligadura do vinculador
- Resuspenda o pellet introduzindo pipetagem em 6,5 μL de água sem nuclease. Deixar o pellet sentar-se na água por alguns minutos primeiro vai ajudar com a re-suspensão.
- Depois de girar o pellet e ressuscite na água, adicione 0,5 μL de 100 μM 5 '-Linker (com códigos de barras; ver tabela 1), 1 μL de tampão de LIGASE de RNA T4, 1 ΜL de ATP de 10 mm e 1 ΜL de Peg. Aqueça a 90 ° c por 30 s, depois coloque no gelo. Adicionar 1 μL de RNA de T4 ligase 1 e deixar incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
- Adicionar 400 μL de 0,3 M de NaCl, seguido de 400 μL de fenol ácido/clorofórmio. Vortex 30 s-1 min (solução vai olhar nublado), e depois girar a 4 ° c para 10-15 min na velocidade máxima em uma microcentrífuga (~ 17.000 x g). Desenhe a camada superior e coloque no novo tubo de 1,5 mL.
Nota: Evite Pipetar qualquer uma das camadas inferiores. - Adicione 350 μL de clorofórmio, vórtice brevemente e, em seguida, gire a 4 ° c por 10 min na velocidade máxima (~ 17.000 x g). Desenhe o topo mais tarde e coloque no novo tubo de 1,5 mL. Adicionar 1,5 μL de coprecipitante de glicogênio e 1 mL de etanol a 100%.
Nota: mais uma vez, evite pipetagem de qualquer camada inferior. - Vortex brevemente, em seguida, coloque em-80 ° c por pelo menos 1 h, ou-20 ° c durante a noite.
4. transcrição reversa (RT)
- Ligue o bloco de calor de 42 ° c. Gire as amostras a 4 ° c e ~ 17.000 x g por 20-30 min. Remova todo o sobrenadante e deixe o ar da pelota secar por 5 min.
- Re-suspender a amostra peletizada em 8,25 μL de água sem nuclease, em seguida, adicionar: 0,5 μL de 100 μM RT Primer (tabela 1), e 5 μL de 2x RT Reaction mix de um kit de síntese de cDNA. Incubar a 42 ° c durante 3 min.
- Adicionar 1,5 μL de enzima 10x RT a cada amostra e incubar a 42 ° c durante 30 min num termocicer. Coloc em-20 ° c ou continue com hidrólise e neutralização.
Nota: vários kits RT podem ser utilizados para as etapas 4,2 e 4,3. - Realize a hidrólise alcalina e a neutralização: faça 1 mL de solução de hidróxido de potássio (KOH) de 150 mM (150 μL de 1 m de KOH, 20 μL de 1 M Tris base pH 7,5 e 830 μL de H2O) e 1 ml de ácido clorídrico de 150 mm (HCL) (150 μL de 1 m HCl e 850 μl de H2O).
- Antes de adicionar às amostras, determine a quantidade de HCl necessária para neutralizar a solução de KOH. Geralmente, cerca de 20-24 μL de HCl neutralizarão os 25 μL de KOH. Verifique a combinação em uma tira do pH para assegurar-se de que esteja na escala direita (pH 7,0 a 9,5).
- Hydrolyze as amostras adicionando 25 μL de solução de KOH de 150 mM e incubar por 10 min a 95 ° c.
- Neutralize as amostras adicionando a quantidade de 150 mM HCl determinada na etapa 4,4, para obter uma amostra final pH entre 7,0 e 9,5.
5. amplificação do PCR
- Após a neutralização, prepare uma reação de PCR com: 29,5 μL de água, 5 μL de tampão Taq 10x, 1 μL de dNTP, 2 μL de primer de 25 μM para a frente (tabela 1), 2 μL de primer reverso de 25 μm (tabela 1), 0,5 μL de Taq e 10 μl do cDNA transcrito reverso da etapa 4,6 .
- Execute a seguinte reacção de PCR: 94 ° c por 2 min, depois 20 ciclos de 94 ° c para 45 s, 50 ° c para 75 s e 72 ° c para 60 s.
- Execute uma segunda reação do PCR de aproximadamente 2-4 mais ciclos usando 5 μL do produto da etapa 5,2. Mistura: 34,8 μL de água, 5 μL de tampão Taq 10x, 1 μL de dNTP, 1 μL de primer de 25 μM para a frente (tabela 1), 1 μL de primer reverso de 25 μm (tabela 1) e 0,2 μL de Taq polimerase. Siga os mesmos parâmetros do termociclador esboçados na etapa 5,2.
Nota: a finalidade de fazer duas reações do PCR-com o primeiro para 20 ciclos e o segundo para apenas 2-4 mais-é assegurar-se de que a quantidade de cDNA amplificada esteja em uma escala dinâmica (isto é, não uma quantidade saturada).
6. purificação do gel do agarose
- Prepare um gel de agarose 4% com agarose de baixa fusão. Carga 40 μL ou mais do produto do PCR no gel, junto com o corante do carregamento. Carga 100 BP e 25 BP marcadores de tamanho.
Nota: a escada de 25 BP ajuda a distinguir produto amplificado de produtos de ligadura linker-linker. Os géis de agarose de baixa fusão devem ser fundidos com maior cuidado do que os géis de agarose tradicionais, seguindo atentamente as instruções do fabricante. - Para a extração do gel, selecione o número do ciclo que é visível no gel mas não está saturado (geralmente 22 – 24 ciclos). Escolha bandas de intensidade semelhantes ao executar várias amostras.
- Corte a faixa que está acima da faixa de 125 BP (a faixa mais escura na escada de 25 BP; ver Figura 1D). Usando um kit de extração de gel, siga as instruções do fabricante para adicionar buffer com base em um gel de 4%, em seguida, agitar para dissolver agarose em buffer à temperatura ambiente.
Nota: dissolver a 55 ° c aumenta o potencial de ligadura linker-linker. - Siga as instruções de extração de gel do fabricante e eluir em 30 μL de tampão de eluição ou água. Se o produto parecia fraco no gel, em seguida, reduzir a eluição de 20 μL.
- Meça a concentração do cDNA usando uma técnica sensível, e prepare a biblioteca da amostra para arranjar em seqüência. A preparação dependerá do tipo de sequenciamento utilizado.
Nota: os requisitos mínimos para uma biblioteca de sequenciamento são tipicamente um volume de 10 μL de produto de 10 μM. Se as concentrações são demasiado baixas, a associação e o etanol precipitam amostras para trazer a biblioteca à concentração desejada. - Sequenciar as amostras usando o equipamento disponível. Um exemplo comum seria executar amostras usando um kit para 50 BP leituras únicas, para obter aproximadamente 15-25 milhões de leituras em um formato de saída FASTQ.
Alinhamento de seqüência de RNA pequeno e bioinformática
7. upload de dados
- Transfira arquivos FASTQ gerados de cada execução de sequenciamento. Faça o download de uma lista de seqüências de hairpin microRNA de miRbase.org8,9,10.
- Gere uma conta Galaxy em www.usegalaxy.org e carregue um ficheiro FASTQ de leituras de sequência para esta conta.
- Carregue um arquivo de texto de sequências de código de barras para a conta Galaxy, como o barcodes. txt, que está disponível como um arquivo de texto (tabela complementar 1).
- Faça o upload de um arquivo FASTA de grampos microRNA para a conta Galaxy de um banco de dados como miRBase.org. Exemplos de mouse (mousehairpins. FA) ou humanos (humanhairpins. FA) os precursores de microRNA são fornecidos na tabela complementar 2 e na tabela complementar 3.
8. remoção do adaptador, tipo do código de barras, e guarnição
- Na guia à esquerda, navegue até a manipulação de arquivos genômica > FASTA/FASTQ > seqüências do adaptador de clipe.
- No arquivo de entrada no formato FASTA ou fastq, insira o arquivo fastq na lista suspensa. Mude o comprimento de seqüência mínimo a 18. Altere Source para Inserir sequência personalizada. Digite Ctgtaggc. Mantenha todos os outros parâmetros padrão. Clique em executar.
Observação: leituras de seqüência que são menores que 18 nucleotídeos são difíceis de mapear exclusivamente para microRNAs e contêm muitos produtos de degradação. - Na guia à esquerda, navegue até a manipulação de arquivos genômica > FASTA/fastq ≫ Barcode Splitter.
Nota: as funções do Galaxy e os cabeçalhos são actualizados periodicamente, pelo que a função de procura pode ser necessária para encontrar uma ferramenta equivalente ou a respectiva localização. Kits comerciais usando primers indexados muitas vezes já são classificados por código de barras. Conseqüentemente, esta etapa e a etapa da guarnição do código de barras não são necessárias se partindo de um jogo comercial. - Para códigos de barras para usar, aponte para barcodes. txt. Para que a biblioteca seja dividida, use clip no arquivo de dados produzido na etapa anterior. Em número de incombinações permitidas, insira 1. Clique em executar.
- Aparar os primeiros 4 nucleotídeos: Navegue até manipulações de texto ≫ aparar caracteres à esquerda ou à direita. Para o conjunto de dados de entrada, clique no ícone de pasta, que é uma coleção de conjunto de dados. Selecione o arquivo em lotes de amostras, que inclui o divisor de código de barras de rótulo em dados. Em aparar desde o início até esta posição, insira 5. No é o conjunto de dados de entrada no formato FASTQ? digite Sim. Clique em executar. A execução pode demorar vários minutos.
9. alinhamento de leituras para microRNAs
- No Galaxy, navegue para análise de genômica > RNA-Seq > quantificação de transcrição sailfish11.
- Para a pergunta Selecione um transcriptoma de referência de seu histórico ou use um índice interno? selecione usar um do histórico. Insira o arquivo carregado mousehairpins. FA na lista suspensa. No arquivo FASTA/Q, clique no ícone de pasta para usar uma coleção de conjunto de dados e selecione o arquivo que inclui Trim na coleção. Clique em executar. A execução pode demorar vários minutos.
- Na guia histórico à direita, clique em sailfish na coleção... que é uma lista com 19 itens. Clique em cada arquivo individual e clique no ícone de disco para salvar no computador local. Os arquivos baixados individualmente primeiro precisam ser descompactados. Eles também podem precisar ser salvos novamente com uma extensão. txt com a finalidade de importar para uma planilha.
- Abra cada arquivo de planilha e renomeie a coluna Numreads para a condição de tratamento. Mesclar as colunas juntas para gerar uma matriz de microRNAs na primeira coluna e ler contagens por condição em colunas subseqüentes.
- Para calcular microRNAs diferencialmente expressas para cada condição de tratamento, use o arquivo com contagens de leitura de microRNA RAW como entrada para programas como DESeq212. DESeq2 está presente no Galaxy na análise de genômica > RNA-seq ≫ DESeq2 Tab.
- Converta leituras RAW para contagens de leitura microRNA normalizadas. As contagens são normalizadas para a profundidade da sequência de biblioteca da biblioteca através do seguinte cálculo: [(leituras brutas/leituras totais de microRNA) * (1 milhão – número de microRNAs contados) + 1].
Nota: este cálculo fornece uma leituras normalizadas por milhão (RPM) mapeadas microRNAs que podem ser comparadas entre conjuntos de dados e condições biológicas. A saída é um arquivo delimitado por tabulação. Sailfish fornece uma coluna de saída do TPM , embora esse valor seja normalizado pelo comprimento do hairpin microRNA, o que não é necessário neste contexto. - Se relevante, repita o alinhamento com sequências de entrada personalizadas (por exemplo, um vetor) para identificar as leituras que mapeiam para construções entregues, como shRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esquema das etapas envolvidas na preparação da biblioteca
Um esquema geral de extração, seqüenciamento e alinhamento de RNA pequeno é descrito na Figura 2.
Amostras de fígado de um macho e de um rato fêmea foram coletadas e estalaram congelado no nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído e avaliado quanto à qualidade e concentração.
O sequenciamento de RNA pequeno produz RNA suficiente para sequenciamento
3 μg do RNA de duas extrações independentes do RNA foram usados como o material começar para arranjar em seqüência pequeno do RNA. As amostras foram executadas em gel de acrilamida e cortadas entre os marcadores de tamanho correspondendo a 17-28 NT de RNA (Figura 1a). As amostras foram cortadas em fragmentos para isolamento de RNA (Figura 1b) e transferidas para um tubo de centrífuga de baixa retenção de 1,5 ml (Figura 1C). Os códigos de barras bc7 e bc17 (tabela 1) foram ligados à extremidade 5 ' do RNA pequeno. As bibliotecas pequenas do RNA eram PCR amplificada usando 22 ciclos do PCR para render o produto 8,0 e 11,2 ng/μL, respectivamente. As amostras foram agrupadas e uma amostra agrupada de 10 nM foi submetida para sequenciamento de alta taxa de transferência usando um comprimento de leitura de 50 BP.
MiR-122 é o microRNA mais abundante no fígado do rato
Após a triagem de código de barras, 851.931 leituras contidas códigos de barras da amostra de fígado 1 e 650.154 da amostra de fígado 2. Das leituras, 83,5% e 90,0% mapearam para microRNAs, respectivamente, com o mapeamento de leituras restantes para rRNAs (1,8% e 0,6% respectivamente), fragmentos de degradação de tRNAs e mRNA. Após o alinhamento aos grampos de cabelo humanos de microRNA, observamos concordância forte entre as contagens de leitura de microRNA em cada repetição (R2 = 0,998; Figura 3). Um total de 306 espécies de microRNA foram detectados, com o maior número de leituras mapeadas para miR-122 (tabela complementar 4). A abundância de MicroRNA foi semelhante entre as amostras de fígado masculino e feminino.
Figura 1. Extração de pequenas RNAs de um gel de acrilamida. (A) gel de acrilamida e região que é cortada correspondente ao tamanho de microRNAs. (B) peças de gel antes e depois do corte em fragmentos menores. (C) processo de transferência de fragmentos de gel em tubos siliconizados. (D) reação do PCR no gel do Agarose do baixo-derretimento que demonstra o produto clonado correto comparado com o produto do linker-linker e as amostras insaturadas (de 22 ciclos) versus saturados (24 ciclos). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esquema do protocolo. Uma linha do tempo mostrando as principais etapas envolvidas no procedimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Reprodutibilidade dos resultados de duas extrações independentes do RNA. O scatterplot de microRNA leu contagens de um fígado masculino do rato (eixo x) comparado com um fígado fêmea do rato (y-linha central) usando uma escala de baseado em-$. Cada ponto representa as leituras por milhão (RPM) mapeadas contagem microRNA para cada microRNA individual. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Primer | Seqüência | |
| 3 ' linker 1 | rAppCTGTAGGCACCATCAAT – de | |
| marcador de tamanho inferior | rArUrCrGrCrArUrGrCrUrGrArCrGrUrArCrUrArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| marcador de tamanho superior | rArArUrCrArGrCrGrGrArUrUrGrCrArUrGrArArCrGrUrArCrArUrArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| barcode1 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArGrCrG | |
| barcode2 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrGrUrC | |
| barcode3 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrUrGrG | |
| barcode4 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArCrUrU | |
| barcode5 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrGrGrU | |
| barcode6 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrUrA | |
| barcode7 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrArUrG | |
| barcode8 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrGrC | |
| barcode9 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrCrArG | |
| barcode10 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrArC | |
| barcode11 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrUrCrU | |
| barcode12 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrArArU | |
| barcode13 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArArGrA | |
| barcode14 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrArA | |
| barcode15 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrGrG | |
| barcode16 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrUrG | |
| barcode17 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrArU | |
| barcode18 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrArU | |
| Primer RT | ATTGATGGTGCCTACAG | |
| Primer F do PCR | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |
| Primer PCR R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG | |
Tabela 1. Lista de primers.
Tabela suplementar 1. Lista de sequências de código de barras. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 2. Lista curadoria de seqüências de precursor do mouse microRNA. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 3. Lista curated de seqüências humanas do precursor de microRNA. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 4. Contagens de leitura de microRNA RAW e normalizadas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apesar da identificação de microRNAs há mais de 20 anos,13, o processo de sequenciamento de microRNA permanece trabalhoso e requer equipamentos especializados, impedindo que os laboratórios adotem rotineiramente os protocolos em casa14. Outras técnicas podem simultaneamente avaliar microRNAs, como Microarrays microRNA e painéis de expressão multiplexados; Entretanto, estas aproximações são limitadas que quantificam somente o microRNAs atual em seu jogo da ponta de prova. Devido a isso, eles perdem características importantes de sequenciamento de RNA pequeno, como a identificação de microRNAs novela, e de microRNA isoformas-nucleosídeo alterações que podem ter importante função biológica6,7,15 .
Ao iniciar um novo experimento, usar um fornecedor comercial é muitas vezes mais fácil porque eles oferecem suporte técnico e facilidade de uso. Várias opções comerciais estão disponíveis para sequenciamento microRNA, que pode ser multiplexado para reduzir a carga de trabalho ao processar grandes números (> 100) de amostras. Estes kits comerciais estão continuamente a ser melhorado, o que é uma vantagem e desvantagem. Por um lado, as empresas que fazem esses kits desenvolveram novos métodos de captura de microRNA, por exemplo, por meio da circularização de suas extremidades 5 e 3 antes do sequenciamento ou do uso de linkers degenerados com sequências aleatórias em cada extremidade para reduzir o viés de ligadura. Igualmente desenvolveram métodos para remover o adaptador-dímeros, por exemplo, com a ligadura de adaptadores dobro-encalhados ou a hibridação de oligonucleotides complementares. Por outro lado, kits comerciais recomendam contra modificação ou alteração de qualquer etapa. Portanto, se todas as atualizações são feitas para um kit, é difícil ou impossível comparar dados derivados de versões antigas e novas de kits, bem como dados derivados de kits de diferentes fornecedores comerciais. Aqui, descrevemos um protocolo que tem a capacidade de permanecer em face de alternativas comerciais. Nosso foco em etapas de purificação de gel-enquanto eles adicionam tempo para o protocolo-permite consistente microRNA captura e reprodutibilidade ao longo dos muitos anos que temos usado. Várias avaliações da reprodutibilidade entre kits comerciais e protocolos in-House foram feitas, e encaminhá-lo para alguns desses estudos16,17,18,19. É importante ressaltar que as etapas que delineamos para a análise de Bioinformática de microRNAs podem ser empregadas independentemente da escolha do kit ou do protocolo em casa.
Sequenciamento MicroRNA muitas vezes é incomodado pela escolha de códigos de barras: em alguns casos, a eficiência de ligadura dos vários códigos de barras pode não ser equivalente, levando a distribuições tendenciosas de seqüências nas amostras20. Recomenda-se agora usar bases degenerados na extremidade 5 e 3 para minimizar vieses da ligadura de microRNAs específicos21,22. Neste protocolo, não observamos esses problemas de ligadura e observamos leituras consistentes para repetições técnicas e biológicas avaliadas com diferentes códigos de barras5,6,7,23, Mas é importante estar ciente deles. Métodos para evitar viés de ligadura incluem a incorporação de primers de índice nos primers de PCR, ou para adicionar um ou mais nucleosídeos de RNA aleatórios na extremidade 3 da seqüência de 5 adaptadores (tabela 1). A introdução de um ou mais RNA sintético de espiga, como o C. elegans miR-39 microRNA24, também é uma opção para fins de normalização, o que é crítico para situações de baixo rendimento, como quantificar microRNAs de exosomas. Do mesmo modo, para a ligadura do RNA, nós usamos com sucesso a ligase 1 do RNA T4, mas a ligadura com menos polarização foi demonstrada para um formulário truncado da ligase 225do RNA T4. Finalmente, superscripts III e IV são alternativas de transcrição reversa enzimas que temos usado sem problema.
A escolha do banco de dados microRNA também pode influenciar os resultados normalizados finais. Um desafio com A curadoria bancos de dados microRNA é que vários novos RNAs pequenos listados como microRNAs são realmente fragmentos de elementos de repetição e não bona fide microRNAs2. Esforços foram feitos para aposentar microRNAs que não estão em conformidade com critérios padrão, de modo que a próxima versão de um banco de dados microRNA é mais refinado; no entanto, a próxima iteração também contém novos candidatos que precisam de confirmação. Quando microRNAs derivados de repetição são incluídos em alinhamentos, eles podem distorcer os resultados e sobrecarregar os dados de microRNAs existentes. Portanto, o uso de conjuntos de dados bem curados de microRNAs de diferentes espécies é essencial26,27. Nós experimentamos a maior reprodutibilidade ao alinhar leituras pequenas do sequenciamento do RNA às listas curadoria de microRNAs conservadas e incluímos estes grampos de cabelo na tabela complementar 2 e na tabela complementar 3. Estas listas correspondem a estimativas de cerca de 500 microRNAs de alta confiança no genoma humano2,26.
Como em qualquer técnica, os resultados devem ser confirmados com uma abordagem ortogonal. Nós reproduzimos com sucesso o RNA pequeno que seqüenciamos resultados com os borrões do norte do RNA pequeno que incorporam pontas de prova radiolabeled para confirmar o tamanho e a abundância relativa do candidato microRNAs6,7,23. A PCR quantitativa de microRNAs usando o sequenciamento de leitura dividida e a confirmação de alterações de mRNA alvo usando qPCR e western blotting são outras opções de validação.
Em resumo, fornecemos um método para isolar e sequenciar microRNAs e executar alinhamentos contra bancos de dados microRNA existentes. A acessibilidade dos reagentes e equipamentos e o uso de ferramentas de código aberto para análise devem tornar este protocolo acessível a qualquer pessoa. Finalmente, este protocolo pode ser usado em qualquer tecido ou linha celular para produzir leituras altamente reprodutíveis e de alta qualidade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios de Andrew Fire e Mark Kay por orientação e sugestões.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P.
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C.
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S.
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
