Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.
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Artigo de método
Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto
Neste artigo
Resumo
Resumo
A metade de todas as transcrições humanas é pensada para ser regulada por microRNAs. Portanto, a quantificação da expressão de microRNA pode revelar mecanismos subjacentes nos Estados de doença e fornecer alvos terapêuticos e biomarcadores. Aqui, detalhamos como quantificar com precisão microRNAs. Resumidamente, este método descreve isolando microRNAs, ligando-os a adaptadores adequados para sequenciamento de alta taxa de transferência, amplificando os produtos finais e preparando uma biblioteca de exemplo. Em seguida, explicamos como alinhar as leituras de sequenciamento obtidas aos grampos de cabelo microRNA e quantificar, normalizar e calcular sua expressão diferencial. Versátil e robusto, este fluxo de trabalho experimental combinado e a análise Bioinformatica permitem que os usuários comecem com a extração do tecido e termine com quantificação de microRNA.
Introdução
Descoberto pela primeira vez em 19931, estima-se agora que cerca de 2000 microRNAs estão presentes no genoma humano2. MicroRNAs são pequenos não-codificando RNAs que são tipicamente 21-24 nucleotídeos longo. São reguladores pós-transcripcionais da expressão gênica, muitas vezes vinculando-se a sítios complementares na região 3-não traduzida (3-UTR) de genes alvo para reprisarem a expressão protéica e degradar o mRNA. Quantificando microRNAs pode dar uma visão valiosa sobre a expressão gênica e vários protocolos foram desenvolvidos para esta finalidade3.
Nós desenvolvemo....
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Protocolo
Experimentos com animais foram autorizados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Washington.
Preparação pequena da biblioteca do RNA
1. isolação do RNA
- Isole o RNA de uma fonte biológica usando um reagente padrão do isolamento do RNA, ou um jogo que enriquece para microRNAs. Para os tecidos, é melhor começar com amostras snap-congelado em nitrogênio líquido e terra a um pó usando um almofariz pré-resfriado e pilão.
- Meça a integridade do RNA de cada amostra em um instrumento que possa quantificar o RNA e forneça um número da in....
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Resultados
Esquema das etapas envolvidas na preparação da biblioteca
Um esquema geral de extração, seqüenciamento e alinhamento de RNA pequeno é descrito na Figura 2.
Amostras de fígado de um macho e de um rato fêmea foram coletadas e estalaram congelado no nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído e avaliado quanto à qualidade e concentração.
O sequenciamento de RNA pequeno p.......
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Discussão
Apesar da identificação de microRNAs há mais de 20 anos,13, o processo de sequenciamento de microRNA permanece trabalhoso e requer equipamentos especializados, impedindo que os laboratórios adotem rotineiramente os protocolos em casa14. Outras técnicas podem simultaneamente avaliar microRNAs, como Microarrays microRNA e painéis de expressão multiplexados; Entretanto, estas aproximações são limitadas que quantificam somente o microRNAs atual em seu jogo da ponta de prova. De.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios de Andrew Fire e Mark Kay por orientação e sugestões.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Escada de DNA de 100 bp | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrilamida | Millipore Sigma | A9926 | |
| Escada de DNA de 25 bp | Promega | G4511 | |
| Ácido fenol/clorofórmio | ThermoFisher | AM9720 | |
| Corante de carregamento de RNA de acrilamida | ThermoFisher | R0641 | |
| Persulfato de amônio (APS) | Instrumento bioanalisador Biorad | 161-0700 | |
| Agilent | G2991AA | Para avaliar a qualidade e concentração de RNA | |
| Clorofórmio | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Etanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | A cor azul ajuda na visualização do pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA kit de isolamento | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | Para gerar pequenos dados |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve agarose de baixo ponto de fusão | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (filme de vedação de laboratório) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Polietilenoglicol 8000 | NEB | incluído com M0204 | |
| ProtoScript II Kit de Síntese de cDNA de primeira fita | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Kit de extração | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorômetro | ThermoFisher | Q33226 | Para quantificar a concentração de DNA |
| Qubit RNA HS Kit de ensaio | ThermoFisher | Q32855 | |
| Lâminas de barbear | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1,5 ml tubos | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncado K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | Para avaliar a qualidade e concentração do RNA |
| Taq DNA Polimerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7,5 | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA tampolado com Tris | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| brometo de etídio ultrapuro (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Ligante universal de clonagem de miRNA | NEB | S1315S | |
| Ureia | Sigma | U5378 |
Referências
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., B....
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Reimpressões e permissões
