Summary
Her beskriver vi en trinvis strategi for isolering af små RNAs, berigende for microRNAs og klargøring af prøver til sekvensering med høj gennemløb. Vi beskriver derefter, hvordan man behandler sekvens læsninger og justerer dem til microRNAs ved hjælp af open source-værktøjer.
Abstract
Halvdelen af alle menneskelige udskrifter menes at være reguleret af microRNAs. Derfor kan kvantificering af microRNA-ekspression afsløre underliggende mekanismer i sygdomstilstande og give terapeutiske mål og biomarkører. Her, vi detaljer, hvordan man præcist kvantificere microRNAs. Kort, denne metode beskriver isolerende microRNAs, ligating dem til adaptere egnet til high-gennemløb sekvensering, forstærke de endelige produkter, og forberede et eksempel bibliotek. Derefter forklarer vi, hvordan man justerer de opnåede sekvensering læser til microRNA Hårnåle, og kvantificere, normalisere, og beregne deres differens udtryk. Alsidig og robust, denne kombinerede eksperimentelle workflow og bioinformatik analyse giver brugerne mulighed for at begynde med vævs ekstraktion og finish med MicroRNA kvantificering.
Introduction
Først opdaget i 19931, det anslås nu, at næsten 2000 microRNAs er til stede i det menneskelige genom2. Micrornas er små ikke-kodning RNAs, der typisk er 21-24 nukleotider lang. De er post-transkriptionelle regulatorer af genekspression, ofte bindende til komplementære steder i den 3-ikke-oversat region (3-UTR) af Target gener til at undertrykke protein udtryk og forringe mRNA. Kvantificering af microRNAs kan give værdifuld indsigt i genekspression, og flere protokoller er blevet udviklet til dette formål3.
Vi har udviklet en defineret, reproducerbar og mangeårig protokol til små RNA-sekvensering og til analyse af normaliserede læsninger ved hjælp af open source bioinformatik værktøjer. Vigtigere er, at vores protokol muliggør samtidig identifikation af både endogene microRNAs og eksogent leverede konstruktioner, der producerer microRNA-lignende arter, mens minimere læser, der kort til andre små RNA arter, herunder ribosomale RNAs ( rRNAs), overførsel af RNA-afledte små RNAs (tsRNAs), gentagne afledte små RNAs-og mRNA-nedbrydningsprodukter. Heldigvis, microRNAs er 5-phosphorylated og 2-3 hydroxyleret4, en funktion, der kan udnyttes til at adskille dem fra disse andre små RNAs og mRNA nedbrydningsprodukter. Flere kommercielle muligheder findes for microRNA kloning og sekvensering, der er ofte hurtigere og lettere at multiplex; men den proprietære karakter af kit reagenser og deres hyppige modifikationer gør sammenligning prøvekørsler udfordrende. Vores strategi optimerer indsamlingen kun den korrekte størrelse af microRNAs gennem acrylamid og agrose gel rensning trin. I denne protokol beskriver vi også en procedure for justering af sekvens læsninger til microRNAs ved hjælp af open source-værktøjer. Dette sæt af instruktioner vil være særligt nyttigt for nybegyndere Informatik brugere, uanset om vores bibliotek forberedelse metode eller en kommerciel metode anvendes.
Denne protokol er blevet anvendt i flere offentliggjorte undersøgelser. For eksempel, det blev brugt til at identificere den mekanisme, hvormed Dicer enzym spalter små hårnål RNAs i en afstand af to nukleotider fra den interne løkke af stammen-loop struktur-den såkaldte "loop-Counting regel"5. Vi har også fulgt disse metoder til at identificere den relative overflod af leverede små hårnål RNAs (shRNA) udtrykt fra rekombinant adeno-associerede virale vektorer (rAAVs), at identificere tærsklen for shRNA udtryk, der kan tolereres før leveren toksicitet forbundet med overskydende shRNA-udtryk6. Ved hjælp af denne protokol, vi også identificeret microRNAs i leveren, der reagerer på fraværet af microRNA-122-en højt udtrykt hepatisk microRNA-samtidig kendetegner nedbrydningen mønster af denne microRNA7. Fordi vi har brugt vores protokol konsekvent i talrige eksperimenter, har vi været i stand til at observere prøve præparater i længderetningen, og se, at der ikke er nogen mærkbar batch effekter.
I deling af denne protokol, vores mål er at give brugerne mulighed for at generere høj kvalitet, reproducerbar kvantificering af microRNAs i stort set alle væv eller cellelinje, ved hjælp af overkommelige udstyr og reagenser, og gratis bioinformatik værktøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev godkendt af det institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg under University of Washington.
Forberedelse af små RNA-biblioteker
1. RNA-isolation
- Isoler RNA fra en biologisk kilde ved hjælp af et standard RNA-isolations reagens eller et sæt, der beriger for microRNAs. For væv, er det bedst at starte med prøver snap-frosne i flydende kvælstof og jorden til et pulver ved hjælp af en præ-kølet mørtel og Pestle.
- Mål hver prøves RNA-integritet på et instrument, der kan kvantificere RNA og give et RNA-integritets nummer (RIN). RINs skal være > 7.
2.3 ' adapter ligering
- Der fremstilles en ligations reaktion i PCR-Strip rørene ved at kombinere: 11 μL RNA (1-3 μg, med samme mængde for hver prøve), 1,5 μL 10x T4 RNA-ligasereaktions buffer, ATP-fri, 1 μL poly-ethylenglykol (PEG) og 0,5 μL 3 '-linker (100 μM Universal miRNA kloning Lin ker).
Bemærk: fraværet af ATP hjælper med at berige miRNAs og minimerer kloning af mRNA-nedbrydningsprodukter. Peg fungerer som et Molekylær fortrængning-middel, der øger succesfuld ligering. Universal Mirna kloning linker har en 3 ' blokerende gruppe (Amin) for at forhindre selv-ligering, cirkularisering, og ligering til RNA ved 5 ' ende. - Prøverne opvarmes ved 95 °C på en termo cycler for 30-40 s. afkøles på is i 1 min. Tilsæt 1 μL T4 RNA-ubiquitinligase 2 og Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer. Forbered gelen (trin 2,3), mens prøverne inkuberes.
Bemærk: inkubation ved stuetemperatur hjælper med at forhindre sammenkædning-linker-ligation. Vi har også med succes brugt T4 RNA ubiquitinligase 1. - Der forberedes 30 mL af en 15% polyacrylamid gel med 8 M urinstof (til en 20x20 cm gel): 14,4 g urinstof, 3 mL 10x Tris-Buffered ethylenediaminetetraeddikesyre (TBE), 11,2 mL 40% 19:1 acrylamid og H2O til 30 ml. Opløsningen opløses bedst ved 42 °C. Umiddelbart før støbning tilsættes 150 μL 10% ammonium persulfat (APS) og 30 μL tetramethylethylenediamin (TEMED) til polymerisering.
- Hæld mellem 0,8 mm adskilte glasplader i en plastik støbt og Indsæt kam. Når gelen er størnet (ca. 20 min), tilsættes 0,5 x TBE til tanken og vaskes brønde af rest urinstof ved pipettering kraftigt.
- Pre-Run gel på en konstant 375 V i 25 min uden prøver, så urinstof kan komme ind i gel, derefter vaske brøndene igen.
Bemærk: det kan være nødvendigt at reducere spændings mængden afhængigt af den type strømforsyning og elektroforese system, der anvendes. - Når prøverne er udført ligating, tilsættes 15 μL acrylamid-belastnings farve til prøverne (for et 1:1-forhold), hvorefter der i 5 min ved 95 °C på en termo cycler.
- Forbered 25 ng/μL af 37 og 44 BP størrelse markører, fortyndet med en del acrylamid lastning farvestof. Sekvenser er angivet i tabel 1.
- Prøverne på polyacrylamid gel, hvorefter mindst én vognbane er mellem hver prøve. Læg 20 μL af mindst to sæt markører i et asymmetrisk mønster for at holde styr på gel-retningen.
- Kør gelen ved en konstant 375 V i de første 15 minutter, og øg derefter til en konstant 425 V for den resterende løbetur. Kør indtil bromphenolblåt blå er omkring 1-4 cm fra bunden, som tager ca. 2 h.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan gelen køres ved en lavere konstant spænding i en længere periode, indtil bromphenolblåt Blue er ca. 1-4 cm fra bunden. - Fjern gelen fra glaspladerne ved hjælp af en plade separator, og Placer gelen på en plastik side beskytter. 5 μL ethidium-bromid fortyndes i 500 μL destilleret vand og pipetter på markerings baner lige over den øverste lyseblå markør (Se figur 1a).
Forsigtig: brug handsker til ethidium bromid og bortskaf affald i overensstemmelse med lokale regler. Lad sidde i 5 min. - Under ultraviolet (UV) lys, skær geler fra øvre til nedre markør i hver bane ved hjælp af ren barberkniv (Se figur 1a). Overfør til et 4 x 4 cm kvadrat af laboratorie tætnings folie, og skær derefter gelen med ca. 4 snit vandret og 3 lodret for at producere 12 små firkanter (Se figur 1b).
- Pipette 400 μl af 0,3 M NaCl på tætnings film pladsen, og tragt gel stykker i 1,5 ml Silikoniseret rør (Se figur 1c). Prøverne omrøver på en nutator ved 4 °C natten over.
Bemærk: andre 1,5 mL-rør med lav retention kan udskiftes med siliconiserede rør. - Efter mindst 12 h agitation ved 4 °C, Hent prøverne og læg dem på is sammen med et konisk rør på 100% ethanol.
- Overfør 400 μL supernatanten til et nyt rør, og tilsæt derefter 1 mL 100% ethanol og 1 μL af 15 mg/mL glykogen coprecipitant. Sørg for at samle så meget supernatanten som muligt ved at dreje ned ved 4 °C og pipettering mere om nødvendigt. Sted ved-80 °C i 1 time eller-20 °C i 2 timer eller længere. Glycogen coprecipitant forbedrer pellet synlighed og nyttiggørelse.
- Spin ved 4 °C ved 17.000 x g for 20-30 min. Fjern alle spor af ethanol og lad pellet lufttørre i 5 min.
3.5 ' linker ligering
- Igen suspendere pellet ved pipettering i 6,5 μL nuklease frit vand. At lade pellet sidde i vand i et par minutter først vil hjælpe med re-suspension.
- Efter spinding ned af pellet og resuspension i vand tilsættes 0,5 μL 100 μM 5 '-linker (med stregkoder; Se tabel 1), 1 ΜL T4 RNA-ligasebuffer, 1 μl 10 mm ATP og 1 μl pind. Opvarm ved 90 °C i 30 s, og Placer derefter på is. Tilsæt 1 μL T4 RNA ubiquitinligase 1 og lad inkubere ved stuetemperatur i 2 timer.
- Tilsæt 400 μL 0,3 M NaCl, efterfulgt af 400 μL syre phenol/chloroform. Vortex 30 s-1 min (opløsningen vil se uklar), og derefter spinne ved 4 °C i 10-15 min ved max hastighed i en mikrocentrifuge (~ 17.000 x g). Trække det øverste lag og sted i nye 1,5 mL rør.
Bemærk: undgå Pipettering af det nederste lag. - Tilsæt 350 μL chloroform, vortex kortvarigt, og drej derefter ved 4 °C i 10 minutter ved maks hastighed (~ 17.000 x g). Træk toppen senere, og Placer den i et nyt 1,5 mL rør. Tilsæt 1,5 μL glykogen coprecipitant og 1 mL 100% ethanol.
Bemærk: undgå at pipettere noget af det nederste lag igen. - Vortex kortvarigt, derefter sted ved-80 °C i mindst 1 time, eller-20 °C natten over.
4. omvendt transskription (RT)
- Tænd for 42 °C-varme blokken. Spin prøverne ved 4 °C og ~ 17.000 x g for 20-30 min. Fjern alle supernatanten og lad pellet lufttørre i 5 min.
- Resuspension af pelleteret prøve i 8,25 μL nuklease frit vand, og tilsæt derefter: 0,5 μL af 100 μM RT primer (tabel 1) og 5 ΜL 2x rt-reaktionsblanding fra et cDNA-syntese sæt. Inkuber ved 42 °C i 3 min.
- Der tilsættes 1,5 μL 10x RT-enzym til hver prøve, og der inkubates ved 42 °C i 30 minutter i en termo cycler. Sted ved-20 °C eller fortsættes med hydrolyse og neutralisering.
Bemærk: flere RT-kits kan anvendes til trin 4,2 og 4,3. - Udfør alkalisk hydrolyse og neutralisering: lav 1 mL 150 mM kaliumhydroxid (KOH) opløsning (150 μL af 1 M KOH, 20 μL af 1 M Tris base pH 7,5 og 830 μL af H2O) og 1 ml 150 mm saltsyre (HCL) (150 μl af 1 m hcl og 850 μl af H2O).
- Før du tilføjer til prøverne, bestemme mængden af HCl nødvendig for at neutralisere KOH opløsning. Generelt vil omkring 20-24 μL HCl neutralisere de 25 μL af KOH. Kontroller kombinationen på en pH-strimmel for at sikre, at den er i det rigtige område (pH 7,0 til 9,5).
- Hydrolyserer prøverne ved at tilsætte 25 μL 150 mM KOH opløsning og inkubere i 10 minutter ved 95 °C.
- Prøverne neutraliseres ved at tilsætte den mængde på 150 mM HCl, der bestemmes i trin 4,4, for at opnå en endelig pH-prøve mellem 7,0 og 9,5.
5. PCR-forstærkning
- Efter neutralisering forberedes en PCR-reaktion med: 29,5 μL vand, 5 μL 10x Taq-buffer, 1 μL dNTP, 2 μL 25 μM fremad primer (tabel 1), 2 μl 25 μm omvendt primer (tabel 1), 0,5 μl Taq og 10 μl af det omvendte transskriberede cdna fra trin 4,6 .
- Kør følgende PCR-reaktion: 94 °C i 2 min, derefter 20 cyklusser af 94 °C for 45 s, 50 °C for 75 s og 72 °C for 60 s.
- Kør en anden PCR-reaktion på ca. 2-4 flere cyklusser med 5 μL af produktet fra trin 5,2. Bland: 34,8 μL vand, 5 μL 10x Taq-buffer, 1 μL dNTP, 1 μL 25 μM fremad primer (tabel 1), 1 μl 25 μm omvendt primer (tabel 1) og 0,2 μl Taq-polymerase. Følg de samme termocycler parametre, som er beskrevet i trin 5,2.
Bemærk: Formålet med at gøre to PCR-reaktioner – med den første i 20 cyklusser og den anden for bare 2-4 mere – er at sikre, at mængden af cDNA forstærket er i et dynamisk område (dvs. ikke et mættet beløb).
6. agrose gel rensning
- Forbered en 4% agopstået gel med lavsmeltende agopstået. Indlæs 40 μL eller mere af PCR-produktet på gelen sammen med belastnings farve. Indlæs 100 BP og 25 BP størrelses markører.
Bemærk: 25 BP stigen hjælper med at skelne amplificeret produkt fra linker-linker ligering produkter. Lavsmeltende agrose gels skal være støbt med større omhu end traditionelle agrose gels, så nøje følge instruktionerne fra producenten. - Ved gel ekstraktion vælges det cyklus nummer, der er synligt på gelen, men som ikke er mættet (sædvanligvis 22 – 24 cyklusser). Vælg lignende intensitets bånd, når du kører flere prøver.
- Skær båndet, der ligger over 125 BP-båndet (det mørkere bånd på 25 BP-stigen; Se figur 1d). Brug en gel ekstraktions kit, Følg producentens anvisninger for at tilføje buffer baseret på en 4% gel, derefter ryste at opløse agopstået i buffer ved stuetemperatur.
Bemærk: opløsning ved 55 °C øger potentialet for sammenkædning-linker-ligation. - Følg producentens anvisninger for gel ekstraktion, og elueres i 30 μl elelueringsbuffer eller vand. Hvis produktet så svagt ud på gelen, skal opløsningen reduceres til 20 μL.
- Mål cDNA-koncentration ved hjælp af en følsom teknik, og Forbered prøve bibliotek til sekvensering. Præparatet vil afhænge af den type sekvens, der anvendes.
Bemærk: minimumskrav til et sekvensering bibliotek er typisk en 10 μL volumen på 10 μM produkt. Hvis koncentrationerne er for lave, vil pool og ethanol udfælde prøver for at bringe biblioteket til den ønskede koncentration. - Sekvens prøverne ved hjælp af tilgængeligt udstyr. Et almindeligt eksempel ville være at køreprøver ved hjælp af en kit til 50 BP enkelt læser, at opnå ca 15-25 million læser i en FASTQ output format.
Lille RNA-sekvens justering og bioinformatik
7. upload af data
- Hent FASTQ-filer genereret fra hver sekvens kørsel. Download en liste over MicroRNA hårnål-sekvenser fra miRbase.org8,9,10.
- Generer en Galaxy konto på www.usegalaxy.org og uploade en FASTQ fil af sekvens læser til denne konto.
- Upload en tekstfil med stregkode sekvenser til Galaxy-kontoen, såsom barcodes. txt, som er tilgængelig som en tekstfil (supplerende tabel 1).
- Upload en FASTA-fil med microRNA-Hårnåle til Galaxy-kontoen fra en database som miRBase.org. Eksempler på mus (mousehairpins. FA) eller humane (humanhairpins. FA) der findes microRNA-prækursorer i supplerende tabel 2 og supplerende tabel 3.
8. fjernelse af adapter, stregkode sortering og trim
- I venstre fane skal du gå til genomisk filmanipulation > FASTA/FASTQ ≫ Clip adapter-sekvenser.
- I input filen i FASTA-eller fastq-formatskal du indtaste fastq-filen på rullelisten. Skift minimum sekvenslængde til 18. Skift kilde for at indtaste brugerdefineret sekvens. Indtast Ctgtaggc. Behold alle andre standardparametre. Klik på Udfør.
Bemærk: sekvens læsninger, der er kortere end 18 nukleotider, er svære at kort gøre entydigt til microRNAs og indeholder mange nedbrydningsprodukter. - I venstre fanebladet, Naviger til genomisk filmanipulation > FASTA/FASTQ ≫ Barcode splitter.
Bemærk: Galaxy-funktioner og-headere opdateres periodisk, så søgefunktionen kan være nødvendig for at finde et tilsvarende værktøj eller dets placering. Kommercielle kits ved hjælp af indekserede primere er ofte allerede sorteret efter stregkode. Derfor er dette trin og stregkode trimtrinnet ikke nødvendige, hvis du starter fra et kommercielt sæt. - Hvis stregkoder skal bruges, skal du pege på stregkoder. txt. Hvis biblioteket skal opdeles, skal du bruge Clip on data File, der blev produceret i det forrige trin. Indtast 1i antal tilladte mismatch. Klik på Udfør.
- Trim de første 4 nukleotider: Naviger til tekst manipulationer ≫ trim foranstillede eller efterfølgende tegn. For input datasæt, klik på mappeikonet, som er en datasætsamling. Vælg batchfilen af eksempler, som indeholder etiket stregkode splitter på data. I trim fra begyndelsen op til denne position, skal du indtaste 5. In er input DataSet i FASTQ format? Indtast Ja. Klik på Udfør. Udførelsen kan tage flere minutter.
9. justering af læsninger til microRNAs
- I galaksen, Naviger til Genomics analyse > RNA-Seq ≫ Sejlfisk transkriptionen kvantificering11.
- For spørgsmålet skal du vælge en henvisning transkriptome fra din historie eller bruge et indbygget indeks? Vælg Brug en fra historikken. Indtast den uploadede fil mousehairpins. FA på rullelisten. I FASTA/Q-filen skal du klikke på mappeikonet for at bruge en datasætsamling og vælge den fil, der indeholder trim on Collection. Klik på Udfør. Udførelsen kan tage flere minutter.
- I den historie tab til højre, klik på Sailfish on Collection... som er en liste med 19 elementer. Klik på hver enkelt fil, og klik på diskikonet for at gemme på den lokale computer. Individuelt downloadede filer skal først ukomprimeret. De skal muligvis også gemmes igen med filtypenavnet. txt med det formål at importere til et regneark.
- Åbn hver regnearksfil i og gennavngiv kolonnen Numreads til behandlings betingelsen. Flet kolonnerne sammen for at generere en matrix af microRNAs i den første kolonne og læse optællinger pr. betingelse i efterfølgende kolonner.
- Hvis du vil beregne differentielt udtrykte microRNAs for hver behandlingstilstand, skal du bruge filen med RAW microRNA Read tæller som input til programmer som DESeq212. DESeq2 er til stede i galaksen i Genomics analyse > RNA-seq ≫ DESeq2 fanen.
- Konverter RAW-læsninger til normaliseret Miorna-læse tæller. Optællinger normaliseres til bibliotekets sekvens dybde i biblioteket gennem følgende beregning: [(RAW-læsninger/total microRNA-læsninger) * (1.000.000 – antallet af optalte microRNAs) + 1].
Bemærk: denne beregning giver en normaliseret læser pr. million (RPM) kortlagte microRNAs, der kan sammenlignes på tværs af datasæt og biologiske forhold. Outputtet er en tabulatorsepareret fil. Sailfish indeholder en TPM -outputkolonne, selvom denne værdi er normaliseret af MicroRNA hårnål længde, hvilket ikke er nødvendigt i denne sammenhæng. - Hvis det er relevant, skal du gentage justeringen med brugerdefinerede input sekvenser (f. eks. en vektor) for at identificere læsninger, der knyttes til leverede konstruktioner, som shRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skematisk af trin involveret i Biblioteks forberedelse
En overordnet skematisk lille RNA-ekstraktion, sekvensering og justering er skitseret i figur 2.
Leverprøver fra en mandlig og en kvindelig mus blev indsamlet og snap frosset i flydende nitrogen. Total RNA blev ekstraheret og evalueret for kvalitet og koncentration.
Lille RNA-sekvensering giver tilstrækkelig RNA til sekvensering
3 μg RNA fra to uafhængige RNA-ekstraktioner blev brugt som udgangsmateriale til små RNA-sekvensering. Prøverne blev kørt på en acrylamid-gel og skåret ud mellem størrelses markører svarende til 17-28 NT RNA (figur 1a). Prøverne blev hakket i fragmenter for RNA-isolation (figur 1b) og overført til et 1,5 ml centrifugeglas med lav retention (figur 1c). Stregkoder bc7 og bc17 (tabel 1) blev ligeret til 5 ' enden af det lille RNA. Små RNA-biblioteker blev PCR forstærket med 22 serier af PCR til henholdsvis 8,0 og 11,2 ng/μL produkt. Prøverne blev samlet, og der blev indsendt en samlet prøve på 10 nM til sekvensering med høj gennemløb ved hjælp af en 50 BP-læse længde.
MiR-122 er den mest rigelige microRNA i mus leveren
Efter stregkode sortering, 851.931 læser indeholdt stregkoder fra leveren prøve 1 og 650.154 fra leveren prøve 2. Af de læsninger, 83,5% og 90,0% knyttet til microRNAs henholdsvis, med de resterende læsninger tilknytning til rRNAs (1,8% og 0,6% henholdsvis), tRNAs og mRNA nedbrydning fragmenter. Efter justering til humane microRNA Hårnåle observerede vi stærk overensstemmelse mellem microRNA læse tællinger i hver replikat (R2 = 0,998; Figur 3). I alt 306 microRNA arter blev detekteret, med det største antal læsninger kortlægning til miR-122 (supplerende tabel 4). MicroRNA overflod var ens mellemmand lige og kvindelig leverprøver.
Figur 1. Ekstraktion af små RNAs fra en acrylamid-gel. (A) acrylamid gel og region, der er skåret svarende til størrelsen af microRNAs. B) gel stykker før og efter opskæring i mindre fragmenter. C) proces til overførsel af gel-fragmenter til siliconiserede rør. (D) PCR-reaktion på lavsmeltede agrose gel, som viser korrekt klonet produkt sammenlignet med linker-linker-produktet og umættede (22 cyklusser) versus mættede (24 cyklusser) prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk af protokol. En tidslinje, der viser de vigtigste trin, der er involveret i proceduren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Reproducerbarhed af resultater fra to uafhængige RNA-ekstraktioner. Scatterplot af microRNA læse tæller fra en mandlig mus lever (x-akse) sammenlignet med en kvindelig mus leveren (y-aksen) ved hjælp af en log10-baseret skala. Hvert punkt repræsenterer det antal læsninger pr. million (RPM), som er tilknyttet microRNA, for hver enkelt microRNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer | Sekvens | |
| 3 ' linker 1 | rAppCTGTAGGCACCATCAAT – NH2 | |
| markør med lavere størrelse | Har du en af de mest grund til at gøre det på en af de mest... | |
| øverste størrelse markør | har du en af de mest bemærkelsesværdige, men de har ikke været med til at gøre det, som de har været. | |
| barcode1 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArGrCrG | |
| barcode2 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrGrUrC | |
| barcode3 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrUrGrG | |
| barcode4 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArCrUrU | |
| barcode5 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrGrGrU | |
| barcode6 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrUrA | |
| barcode7 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrArUrG | |
| barcode8 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrGrC | |
| barcode9 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrCrArG | |
| barcode10 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrArC | |
| barcode11 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrUrCrU | |
| barcode12 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrArArU | |
| barcode13 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArArGrA | |
| barcode14 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrArA | |
| barcode15 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrGrG | |
| barcode16 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrUrG | |
| barcode17 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrArU | |
| barcode18 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrArU | |
| RT primer | ATTGATGGTGCCTACAG | |
| PCR primer F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |
| PCR primer R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG | |
Tabel 1. Liste over Primers.
Supplerende tabel 1. Liste over stregkode sekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2. Kureret liste over mus microRNA forløber sekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 3. Kureret liste over humane microRNA forløber sekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 4. RAW-og normaliserede microRNA-læse tæller. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trods identifikationen af microRNAs over 20 år siden13, processen med MicroRNA sekvensering forbliver omstændelig og kræver specialiseret udstyr, hindrer laboratorier fra rutinemæssigt at vedtage in-House protokoller14. Andre teknikker kan samtidig evaluere microRNAs, ligesom microRNA mikroarrays og multiplexed udtryks paneler; Men, disse tilgange er begrænset i, at de kun kvantificere microRNAs til stede i deres sonde sæt. På grund af dette, de savner vigtige funktioner i små RNA sekvensering, ligesom identifikationen af nye micrornas, og af MicroRNA isoformer-nukleosid ændringer, der kan have en vigtig biologisk funktion6,7,15 .
Når du starter et nyt eksperiment, er det ofte lettest at bruge en kommerciel leverandør, fordi de tilbyder teknisk support og brugervenlighed. Flere kommercielle muligheder er tilgængelige for microRNA Sequencing, som kan multiplexed at reducere arbejdsbyrden ved behandling af store tal (> 100) af prøver. Disse kommercielle kits bliver løbende forbedret, hvilket både er en fordel og en ulempe. På den ene side, de virksomheder, der gør disse kits har udviklet roman MicroRNA Capture metoder, for eksempel gennem cirkularisering af deres 5 og 3 ender før sekvensering eller ved hjælp af degenererede linkers med tilfældige sekvenser i hver ende at reducere ligering bias. De har også udviklet metoder til at fjerne adapter-dimere, for eksempel gennem ligering af dobbeltstrenget adaptorer eller hybridisering af komplementære oligonukleotider. På den anden side, kommercielle kits anbefale mod ændring eller ændring af ethvert trin. Derfor, hvis der foretages opdateringer til en pakke, er det vanskeligt eller umuligt at sammenligne data, der stammer fra gamle og nye versioner af kits, samt data afledt af kits fra forskellige kommercielle leverandører. Her har vi beskrevet en protokol, der har overtaget magten i lyset af kommercielle alternativer. Vores fokus på gel rensningstrin-mens de tilføjer tid til protokollen-muliggør konsekvent microRNA Capture og reproducerbarhed i de mange år, vi har brugt det. Der er foretaget flere evalueringer af reproducerbarhed mellem kommercielle kits og in-House protokoller, og vi henviser læseren til et par af disse undersøgelser16,17,18,19. Vigtigere, de skridt, vi skitsere for Bioinformatik analyse af microRNAs kan anvendes uanset valg af Kit eller in-House protokol.
MicroRNA sekvensering er ofte plaget af valget af stregkoder: i nogle tilfælde kan ligations effektiviteten af de forskellige stregkoder ikke være tilsvarende, hvilket fører til partiske fordelinger af sekvenser i prøverne20. Det anbefales nu at bruge degenererede baser ved 5 og 3 ende for at minimere ligations biaser af specifikke micrornas21,22. I denne protokol har vi ikke observeret disse ligations problemer og har observeret konsekvente udlæsninger for tekniske og biologiske replikater evalueret med forskellige stregkoder5,6,7,23, men det er vigtigt at være opmærksom på dem. Metoder til at undgå ligationsbias omfatter inkorporering af indeks primere i PCR-primere eller tilføjelse af en eller flere tilfældige RNA-Nukleosider ved den 3 ende af 5-adapter sekvensen (tabel 1). Indførelse af et eller flere syntetiske Spike-in RNA, såsom C. elegans miR-39 MicroRNA24, er også en mulighed for normalisering formål, som er afgørende for lav-afkast situationer, ligesom kvantificere micrornas fra exosomer. Ligeledes, for RNA-ligering, har vi med succes brugt T4 RNA ubiquitinligase 1, men ligering med mindre bias er blevet demonstreret for en trunkeret form af T4 RNA ubiquitinligase 225. Endelig er Supercripts III og IV alternative omvendte transkriptionsenzymer, som vi har brugt uden problem.
Valget af microRNA database kan også påvirke de endelige normaliserede resultater. En udfordring med at kurere microRNA databaser er, at flere nye små RNAs opført som microRNAs er faktisk fragmenter af gentagne elementer og ikke bona fide micrornas2. Der er gjort en indsats for at gå på Pension microRNAs, som ikke er i overensstemmelse med standardkriterierne, så den næste version af en microRNA database er mere raffineret; men den næste iteration indeholder også nye kandidater, der har brug for bekræftelse. Når de gentagne afledte microRNAs medtages i alignments, kan de skævvride resultaterne og overvælde data fra eksisterende microRNAs. Derfor er brugen af velkurerede datasæt af micrornas fra forskellige arter afgørende26,27. Vi har oplevet størst reproducerbarhed ved justering af små RNA-sekvensering læser til kurerede lister over bevaret microRNAs og har inkluderet disse Hårnåle i supplerende tabel 2 og supplerende tabel 3. Disse lister matche estimater af omkring 500 høj tillid micrornas i det menneskelige genom2,26.
Som med enhver teknik, resultaterne skal bekræftes med en ortogononal tilgang. Vi har med succes gengivet små RNA sekventering resultater med små RNA Northern blots, der inkorporerer radioaktivt mærkede sonder for at bekræfte størrelsen og relativ overflod af kandidat micrornas6,7,23. Kvantitativ PCR af microRNAs ved hjælp af Split-Read sekvensering, og bekræftelse af mål mRNA ændringer ved hjælp af qPCR og Western blotting er andre muligheder for validering.
Kort sagt, vi har tilvejebragt en metode til at isolere og sekvens microRNAs og udføre justeringer mod eksisterende microRNA databaser. Den overkommelige karakter af reagenser og udstyr og brugen af open source-værktøjer til analyse bør gøre denne protokol tilgængelig for alle. Endelig kan denne protokol bruges i enhver væv eller cellelinje til at give meget reproducerbare, høj kvalitet læser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af laboratorierne i Andrew fire og Mark Kay for vejledning og forslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
