Summary
Her beskriver vi en trinnvis strategi for å isolere små RNAs, berikende for microRNAs og klargjøre prøver for sekvenser med høy gjennomstrømming. Vi beskriver hvordan du behandler sekvensen leser og justere dem til microRNAs, ved hjelp av åpen kildekode-verktøy.
Abstract
Halvparten av alle menneskelige transkripsjoner antas å være regulert av microRNAs. Kvantifisere microRNA-uttrykk kan derfor avdekke underliggende mekanismer i sykdomstilstander og gi terapeutiske mål og biomarkører. Her detalj vi hvordan du nøyaktig kvantifisere microRNAs. Kort, denne metoden beskriver isolere microRNAs, ligating seg å adapter egnet til høy-produksjon sekvensering, forsterke det final produktene, og forbereder en eksemplar bibliotek. Deretter forklarer vi hvordan du kan justere den oppnådde sekvensering leser til microRNA pinner, og kvantifisere, normalisere, og beregne deres differensial uttrykk. Allsidig og robust, denne kombinert eksperimentell arbeidsflyt og Bioinformatic analyse gjør det mulig for brukere å begynne med vev utvinning og finish med microRNA kvantifisering.
Introduction
Først oppdaget i 19931, er det nå anslått at nesten 2000 microRNAs er til stede i den menneskelige Genova2. MicroRNAs er små ikke-koding RNAs som vanligvis er 21-24 nukleotider lang. De er post-transcriptional regulatorer av genuttrykk, ofte bindende for komplementære steder i 3-uoversatt regionen (3-UTR) av mål gener å undertrykke protein uttrykk og forringe mRNA. Kvantifisere microRNAs kan gi verdifull innsikt i genuttrykk og flere protokoller er utviklet for dette formålet3.
Vi har utviklet en definert, reproduserbar og langvarig protokoll for små RNA-sekvenser, og for å analysere normalisert leser ved hjelp av åpen kildekode-Bioinformatikk verktøy. Viktigere, vår protokoll muliggjør samtidig identifisering av både endogene microRNAs og exogenously levert konstruksjoner som produserer microRNA-lignende arter, mens minimere leser som kart til andre små RNA arter, inkludert ribosomal RNAs ( rRNAs), overføre RNA-avledet små RNAs (tsRNAs), REPEAT-avledet liten RNAs, og mRNA nedbrytningsprodukter. Heldigvis, microRNAs er 5-fosforylert og 2-3 hydroksylerte4, en funksjon som kan utnyttes til å skille dem fra disse andre små RNAs og mRNA fornedrelse produkter. Flere kommersielle alternativer finnes for microRNA kloning og sekvensering som ofte er raskere og enklere å multiplex; den proprietære typen av Kit-reagenser og de hyppige endringene gjør imidlertid det utfordrende å sammenligne prøvekjøringer. Strategien vår optimaliserer innsamling av kun riktig størrelse på microRNAs gjennom akrylamid og agarose. I denne protokollen beskriver vi også en prosedyre for å samkjøre sekvens leser til microRNAs ved hjelp av åpen kildekode-verktøy. Dette settet med instruksjoner vil være spesielt nyttig for uerfarne informatikk brukere, uavhengig av om vårt bibliotek forberedelse metode eller en kommersiell metode brukes.
Denne protokollen har blitt brukt i flere publiserte studier. For eksempel ble det brukt til å identifisere mekanismen som Dicer enzymet kløyver små hæler RNAs i en avstand på to nukleotider fra den interne sløyfen av stammen-loop struktur-den såkalte "loop-telling regelen"5. Vi har også fulgt disse metodene for å identifisere den relative overflod av leverte små hæler RNAs (shRNA) uttrykt fra rekombinant adeno-assosiert viral vektorer (rAAVs), for å identifisere terskelen til shRNA uttrykk som kan tolereres før leveren toksisitet forbundet med overflødig shRNA-uttrykk6. Ved hjelp av denne protokollen, vi også identifisert microRNAs i leveren som reagerer på fraværet av microRNA-122-en svært uttrykt hepatic microRNA-samtidig også karakteriserer nedbrytning mønster av denne microRNA7. Fordi vi har brukt vår protokoll konsekvent i mange eksperimenter, har vi vært i stand til å observere prøve preparater lengderetningen, og se at det ikke er noen merkbar batch effekter.
I deler denne protokollen, er vårt mål å gjøre det mulig for brukere å generere høy kvalitet, reproduserbar kvantifisering av microRNAs i praktisk talt alle vev eller cellelinje, ved hjelp av rimelig utstyr og reagenser, og gratis Bioinformatikk verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal eksperimenter ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Washington.
Liten RNA-bibliotek forberedelse
1. RNA-isolasjon
- Isoler RNA fra en biologisk kilde ved hjelp av en standard RNA isolasjons reagens, eller et sett som beriker for microRNAs. For vev, er det best å starte med prøver snap-frosset i flytende nitrogen og bakken til et pulver ved hjelp av en pre-kjølt mørtel og morter.
- Mål hver sampling RNA-integritet på et instrument som kan kvantifisere RNA og gi et RNA-nummer ( RINs bør være > 7.
2.3 ' adapter ligation
- Forbered en ligation reaksjon i PCR-rør ved å kombinere: 11 μL av RNA (1-3 μg, med samme mengde for hver prøve), 1,5 μL av 10x T4 RNA ligase reaksjonsbuffer, ATP-fri, 1 μL av Poly-etylen glykol (PEG) og 0,5 μL av 3 '-linker (100 μM Universal miRNA kloning Lin) ker).
Merk: fraværet av ATP hjelper berike for miRNAs og minimerer kloning av mRNA nedbrytningsprodukter. PEG fungerer som en molekylær trengsel agent, forbedre vellykket ligation. Universal miRNA kloning linker har en 3 ' blokkering gruppe (Amin) for å hindre selv-ligation, circularization, og ligation til RNA på 5 ' end. - Varm opp prøvene ved 95 ° c på en thermocycler for 30-40 s. Avkjøl på isen i 1 min. Tilsett 1 μL av T4 RNA ligase 2 og ruge ved romtemperatur i 2 timer. klargjør gelen (trinn 2,3) mens prøvene er incubating.
Merk: Inkubasjons ved romtemperatur bidrar til å hindre linker-linker Ligation. Vi har også med hell brukt T4 RNA ligase 1. - Forbered 30 mL av en 15% polyakrylamid gel med 8 M urea (for en 20x20 cm gel): 14,4 g urea, 3 mL 10x Tris-bufret ethylenediaminetetraacetic syre (TBE), 11,2 mL 40% 19:1 akrylamid, og H2O til 30 ml. Løsningen er best oppløst ved 42 ° c. Umiddelbart før støping legger du til 150 μL av 10% ammonium persulfate (APS) og 30 μL av tetrametyletylendiamin (TEMED) for polymerisering.
- Hell mellom 0,8 mm separerte glassplater i en plast støpt og sett kam. Når gelen er befestet (ca 20 min), tilsett 0,5 x TBE til tank og vask brønner av gjenværende urea ved pipettering kraftig.
- Pre-Run gelen på en konstant 375 V for 25 min uten prøver så urea kan gå inn i gel, deretter vaske brønnene igjen.
Merk: det kan hende at mengden spenning må reduseres, avhengig av hvilken type strømforsyning og elektroforese system som brukes. - Når prøvene er ferdig ligating, tilsett 15 μL av akrylamid i prøvene (for en 1:1 ratio), deretter denaturere i 5 min ved 95 ° c på en thermocycler.
- Forbered 25 ng/μL av 37 og 44 BP størrelses markører, fortynnet med en del akrylamid lasting fargestoff. Sekvenser er oppført i tabell 1.
- Legg prøvene på polyakrylamid gel, og la det være minst ett kjørefelt mellom hver prøve. Legg 20 μL av minst to sett med markører, i et asymmetrisk mønster for å holde styr på gel-orientering.
- Kjør gel på en konstant 375 V for de første 15 min og deretter øke til en konstant 425 V for de resterende løp. Kjør til bromophenol blå er ca 1-4 cm fra bunnen, som tar ca 2 t.
Merk: Hvis det er nødvendig, kan gelen kjøres på en lavere konstant spenning for en lengre periode før bromophenol blå er ca 1-4 cm fra bunnen. - Fjern gelen fra glass platene ved hjelp av en plate separator, og plassere gel på en plast side Protector. Fortynne 5 μL av etidiumbromid bromide i 500 μL av destillert vann, og pipette på markør baner like over den øverste lyseblå markøren (se figur 1a).
FORSIKTIG: Bruk hansker for etidiumbromid bromide og kast avfall i henhold til lokale bestemmelser. La sitte i 5 min. - Under ultrafiolett (UV) lys, skjær gels fra øvre til nedre markør i hvert felt ved hjelp av rent barberblad (se figur 1a). Overfør til en 4 x 4 cm kvadrat av laboratoriet tetting film, deretter kutte gel med ca 4 kutt horisontalt og 3 vertikalt for å produsere 12 små firkanter (se figur 1B).
- Pipetter 400 μL av 0,3 M NaCl på tetnings film firkanten og trakt gelé brikker i 1,5 mL silikonbehandlet rør (se figur 1C). Agitere prøvene på en nutator ved 4 ° c over natten.
Merk: andre lav-oppbevaring 1,5 mL rør kan byttes ut for silikonbehandlet rør. - Etter minst 12 timer med omrøring ved 4 ° c, Hent prøvene og legg dem på is, sammen med en konisk slange på 100% etanol.
- Overfør 400 til et nytt rør, og tilsett deretter 1 mL 100% etanol og 1 μL av 15 mg/mL glykogen coprecipitant supernatanten. Sørg for å samle så mye supernatanten som mulig, spinne ned ved 4 ° c og pipettering mer etter behov. Plasser ved-80 ° c for 1 t, eller-20 ° c for 2 timer eller mer. Glykogen coprecipitant forbedrer pellet synlighet og utvinning.
- Spin ved 4 ° c ved 17 000 x g for 20-30 min. Fjern alle spor av etanol og la pellet lufttørke i 5 min.
3.5 ' linker Ligation
- Re-suspendere pellet ved pipettering i 6,5 μL av nuklease-fritt vann. La pellet sitte i vann i noen minutter først vil hjelpe til med re-suspensjon.
- Etter å ha spinner ned pellet og blanding i vann, tilsett 0,5 μL av 100 μM 5 '-linker (med strekkoder; se tabell 1), 1 μL av T4 RNA ligase buffer, 1 μL av 10 mm ATP, og 1 ΜL av Peg. Heat ved 90 ° c for 30 s, og plasser på isen. Tilsett 1 μL av T4 RNA ligase 1 og la ruge i romtemperatur i 2 timer.
- Tilsett 400 μL av 0,3 M NaCl, etterfulgt av 400 μL av syre fenol/kloroform. Vortex 30 s-1 min (oppløsning vil se uklar), og deretter spinne ved 4 ° c for 10-15 min ved maks hastighet i en mikrosentrifugen (~ 17 000 x g). Tegn av det øverste laget og plasser i nye 1,5 mL tube.
Merk: unngå å pipettering noe av det nederste laget. - Tilsett 350 μL av kloroform, Vortex kort, og deretter spinne ved 4 ° c i 10 minutter ved maks hastighet (~ 17 000 x g). Tegn av toppen senere og plasser i nye 1,5 mL tube. Tilsett 1,5 μL av glykogen coprecipitant og 1 mL 100% etanol.
Merk: igjen, unngå pipettering noen av de nederste laget. - Vortex en kort stund, og plasser ved-80 ° c i minst 1 time, eller-20 ° c over natten.
4. omvendt transkripsjon (RT)
- Slå på 42 ° c varme blokk. Spinn prøvene ved 4 ° c og ~ 17 000 x g for 20-30 min. Fjern alle supernatanten og la pellet luften tørke i 5 min.
- Re-suspendere pelleted prøven i 8,25 μL av nuklease vann, legg deretter til: 0,5 μL av 100 μM RT primer (tabell 1), og 5 μL av 2X RT reaksjon Mix fra en cDNA syntese Kit. Ruge ved 42 ° c i 3 min.
- Tilsett 1,5 μL av 10x RT-enzym i hver prøve og ruge ved 42 ° c i 30 minutter i en thermocycler. Plasser ved-20 ° c eller Fortsett med hydrolyse og nøytralisering.
Merk: flere RT-sett kan benyttes til trinn 4,2 og 4,3. - Utfør alkaliske hydrolyse og nøytralisering: lag 1 mL 150 mM kalium (KOH) oppløsning (150 μL av 1 M KOH, 20 μL av 1 M Tris base pH 7,5, og 830 μL av H2O) og 1 ml av 150 mm saltsyre (HCL) (150 μL av 1 m HCl og 850 μL av H2O).
- Før du legger til prøvene, bestemme mengden av HCl nødvendig å nøytralisere KOH løsningen. Vanligvis vil rundt 20-24 μL av HCl nøytralisere de 25 μL av KOH. Kontroller kombinasjonen på en pH-stripe for å sikre at den er i riktig område (pH 7,0 til 9,5).
- Hydrolyserer prøvene ved å tilsette 25 μL av 150 mM KOH-oppløsning og ruge i 10 min ved 95 ° c.
- Nøytralisere prøvene ved å legge mengden av 150 mM HCl bestemmes i trinn 4,4, for å få en endelig prøve pH mellom 7,0 og 9,5.
5. PCR forsterkning
- Etter nøytralisering forbereder du en PCR-reaksjon med: 29,5 μL av vann, 5 μL av 10x Taq buffer, 1 μL av dNTP, 2 μL av 25 μM fremover primer (tabell 1), 2 μL av 25 μm omvendt primer (tabell 1), 0,5 μL av Taq, og 10 ΜL av omvendt transkribere cDNA fra trinn 4,6 .
- Kjør følgende PCR-reaksjon: 94 ° c i 2 min, deretter 20 sykluser på 94 ° c for 45 s, 50 ° c for 75 s og 72 ° c for 60 s.
- Kjør en ny PCR-reaksjon på omtrent 2-4 flere sykluser ved hjelp av 5 μL av produktet fra trinn 5,2. Sammensetning: 34,8 μL av vann, 5 μL av 10x Taq buffer, 1 μL av dNTP, 1 μL av 25 μM fremover primer (tabell 1), 1 μL av 25 μm omvendt primer (tabell 1), og 0,2 μL av Taq polymerase. Følg de samme thermocycler parametrene som er skissert i trinn 5,2.
Merk: formålet med å gjøre to PCR-reaksjoner-med den første for 20 sykluser og den andre for bare 2-4 mer-er å sikre at mengden cDNA forsterkes er i et dynamisk område (dvs. ikke en mettet beløp).
6. Agarose gel rensing
- Forbered en 4% agarose gel med lavt smelte agarose. Last 40 μL eller mer av PCR-produktet på gelen, sammen med lasting fargestoff. Last 100 BP og 25 BP størrelse markører.
Merk: de 25 BP stigen bidrar til å skille forsterket produkt fra linker-linker Ligation produkter. Lav-smeltende agarose gels må være støpt med større forsiktighet enn tradisjonelle agarose gels, så nøye følge instruksjonene fra produsenten. - For gel utvinning, Velg syklus nummer som er synlig på gel, men er ikke mettet (vanligvis 22-24 sykluser). Velg lignende intensitet band når du kjører flere prøver.
- Skjær bandet som er over 125 BP band (mørkere band på 25 BP stigen; se figur 1d). Bruk en gel Extraction Kit, følg produsentens instruksjoner for å legge buffer basert på en 4% gel, deretter riste å oppløse agarose i buffer ved romtemperatur.
Merk: oppløsning på 55 ° c øker potensialet for linker-linker Ligation. - Følg produsentens instruksjoner og eluere for gel i 30 μL av eluering buffer eller vann. Hvis produktet så svakt på gelen, Reduser eluering til 20 μL.
- Mål cDNA konsentrasjon ved hjelp av en følsom teknikk, og forberede sample biblioteket for sekvensering. Forberedelse vil avhenge av hvilken type sekvensering brukes.
Merk: Minimumskrav for et sekvensering bibliotek er vanligvis et 10 μL volum på 10 μM produkt. Hvis konsentrasjonen er for lav, basseng og etanol utløse prøver å bringe biblioteket til ønsket konsentrasjon. - Sekvens prøvene ved hjelp av tilgjengelig utstyr. Et vanlig eksempel vil være å kjøre prøver ved hjelp av et kit for 50 BP singel leser, for å få ca 15-25 millioner leser i en FASTQ output format.
Liten RNA sekvens justering og bioinformatikk
7. opplasting av data
- Last ned FASTQ filer generert fra hver sekvensering kjøre. Last ned en liste over microRNA-og-hår-sekvenser fra miRbase.org8,9,10.
- Generer en Galaxy-konto på www.usegalaxy.org og Last opp en FASTQ-fil med sekvens leser til denne kontoen.
- Last opp en tekstfil med strekkode sekvenser til Galaxy-kontoen, for eksempel strekkoder. txt, som er tilgjengelig som en tekstfil (tilleggs tabell 1).
- Last opp en FASTA-fil med microRNA-pinner til Galaxy-kontoen fra en database som miRBase.org. Eksempler på mus (mousehairpins. FA) eller humant (humanhairpins. FA) microRNA forløpere er gitt i supplerende tabell 2 og tilleggs tabell 3.
8. fjerning av adapter, strekkode sortering og trim
- I den venstre kategorien, Naviger til genomisk fil manipulasjon > FASTA/FASTQ ≫ Clip adapter sekvenser.
- I inndatafil i FASTA eller FASTQ format, Skriv inn FASTQ fil fra rullegardinlisten. Endre minimum sekvens lengde til 18. Endre kilde for å Angi egendefinert sekvens. Angi CTGTAGGC. Behold alle andre standard parametere. Klikk Kjør.
Merk: sekvens leser som er kortere enn 18 nukleotider er vanskelig å kartlegge unikt til microRNAs og inneholder mange fornedrelse produkter. - I den venstre kategorien, Naviger til genomisk fil manipulasjon > FASTA/FASTQ ≫ Barcode splitter.
Merk: Galaxy funksjoner og overskrifter oppdateres med jevne mellomrom, slik at søkefunksjonen kan være nødvendig å finne et tilsvarende verktøy eller dets plassering. Kommersielle kits ved hjelp av indekserte primere er ofte allerede sortert etter strekkode. Derfor er dette trinnet og strekkode trim trinnet ikke nødvendig hvis du starter fra et kommersielt sett. - Hvis du vil bruke strekkoder, peker du på strekkoder. txt. For at biblioteket skal deles, bruker du Clip on data File produsert i forrige trinn. I antall tillatte uoverensstemmelserskriver du inn 1. Klikk Kjør.
- Trim de første 4 nukleotider: Naviger til tekst manipulasjoner ≫ trim ledende eller etterfølgende tegn. For inn data datasettklikker du mappeikonet, som er en datasett samling. Velg den satsvise filen med eksempler, som inkluderer etiketten Strekkode splitter på data. I trim fra begynnelsen opp til denne posisjonen, skriver du inn 5. In er input datasett i FASTQ format? angi Ja. Klikk Kjør. Kjøringen kan ta flere minutter.
9. justering av leser til microRNAs
- I Galaxy, Naviger til Genomics analyse > RNA-Seq ≫ Sailfish transkripsjon kvantifisering11.
- For spørsmålet velge en referanse transcriptome fra historikken eller bruke en innebygd indeks? Velg Bruk en fra historikken. Skriv inn den opplastede filen mousehairpins. FA fra rullegardinlisten. I FASTA/Q-filen klikker du på mappeikonet for å bruke et datasett samling og velger filen som inneholder trim på samlingen. Klikk Kjør. Kjøringen kan ta flere minutter.
- I historien fanen til høyre, klikk på Sailfish på samlingen... som er en liste med 19 elementer. Klikk på hver enkelt fil og klikk på diskikonet for å lagre til lokal datamaskin. Enkeltvis nedlastede filer må først dekomprimeres. Det kan også hende at de må lagres på nytt med filtypen TXT for å kunne importere til et regneark.
- Åpne hver regnearkfil i, og gi nytt navn til NumReads -kolonnen til behandlings betingelsen. Flett kolonnene sammen for å generere en matrise av microRNAs i den første kolonnen og lese teller per betingelse i etterfølgende kolonner.
- Hvis du vil beregne differensielt uttrykt microRNAs for hver behandlings betingelse, kan du bruke filen med rå microRNA-lesing teller som inn data for programmer som DESeq212. DESeq2 er til stede i Galaxy i Genomics Analysis > RNA-seq ≫ DESeq2 -fanen.
- Konverter rå leser til normalisert microRNA lese teller. Antall er normalisert til biblioteket sekvensen dybden av biblioteket gjennom følgende beregning: [(RAW leser/totalt microRNA leser) * (1 000 000-antall microRNAs telles) + 1].
Merk: denne beregningen gir en normalisert leser per million (RPM) kartlagt microRNAs som kan sammenlignes på tvers av datasett og biologiske forhold. Utdataene er en tabulatordelt fil. Sailfish gir en TPM utgang kolonne, selv om denne verdien er normalisert av microRNA hår lengde, noe som ikke er nødvendig i denne sammenhengen. - Hvis det er relevant, gjentar du justeringen med tilpassede inn data sekvenser (f.eks. en vektor) for å identifisere leser som tilordnes til leverte konstruksjoner, for eksempel shRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk av trinnene involvert i biblioteket forberedelse
En generell skjematisk fremstilling av små RNA-ekstraksjon, sekvenser og innretting er skissert i figur 2.
Leverprøver fra en mannlig og en kvinnelig mus ble samlet inn og snapper frosset i flytende nitrogen. Total RNA ble ekstrahert og evaluert for kvalitet og konsentrasjon.
Liten RNA-sekvensering gir tilstrekkelig RNA for sekvenser
3 μg av RNA fra to uavhengige RNA-utdrag ble brukt som start materiale for små RNA-sekvenser. Prøvene ble kjørt på en akrylamid og skåret ut mellom størrelses markører tilsvarende 17-28 NT av RNA (figur 1a). Prøvene ble hugget inn i fragmenter for RNA-isolasjon (figur 1B) og overført til en lav-oppbevaring 1,5 ml sentrifuge slange (figur 1C). Strekkoder bc7 og bc17 (tabell 1) ble ligaturer til 5 ' enden av den lille RNA. Små RNA-biblioteker ble PCR-forsterket ved hjelp av 22 sykluser med PCR for å gi henholdsvis 8,0 og 11,2 ng/μL-produkt. Prøvene ble gruppert og en 10 nM samlet prøven ble sendt for høy gjennomstrømming sekvensering ved hjelp av en 50 BP lese lengde.
MiR-122 er den mest tallrike microRNA i musen leveren
Etter strekkode sortering leser 851 931 inneholdt strekkoder fra lever prøve 1 og 650 154 fra lever prøve 2. Av de leser, 83,5% og 90,0% kartlagt til microRNAs henholdsvis, med de resterende leser kartlegging til rRNAs (1,8% og 0,6% henholdsvis), tRNAs og mRNA fornedrelse fragmenter. Etter justering til menneskelige microRNA-pinner observerte vi sterk overensstemmelse mellom microRNA lese tellinger i hver replikere (R2 = 0,998; Figur 3). Totalt ble det påvist 306 microRNA-arter, med størst antall leser kartlegging til miR-122 (tilleggs tabell 4). MicroRNA overflod var lik mellom mannlige og kvinnelige leverprøver.
Figur 1. Ekstraksjon av små RNAs fra en akrylamid. (A) akrylamid gel og regionen som er kuttet tilsvarer størrelsen på microRNAs. (B) gel brikker før og etter kutte i mindre fragmenter. (C) prosess for overføring av gel-fragmenter til silikonbehandlet rør. (D) PCR reaksjon på lav-smelte agarose gel demonstrere korrekt klonet produkt sammenlignet med linker-linker produkt og umettede (22 sykluser) versus mettet (24 sykluser) prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk av protokollen. En tidslinje som viser de viktigste trinnene som er involvert i prosedyren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Reproduserbarhet av resultater fra to uavhengige RNA-utdrag. Scatterplot av microRNA lese teller fra en mannlig mus leveren (x-aksen) sammenlignet med en kvinnelig mus leveren (y-akse) ved hjelp av en log10-basert skala. Hvert punkt representerer leser per million (RPM) kartlagt microRNA teller for hver enkelt microRNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primer | Sekvens | |
| 3 ' linker 1 | rAppCTGTAGGCACCATCAAT-NH2 | |
| lavere størrelse markør | rArUrCrGrCrArUrGrCrUrGrArCrGrUrArCrUrArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| øvre størrelse markør | rArArUrCrArGrCrGrGrArUrUrGrCrArUrGrArArCrGrUrArCrArUrArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| barcode1 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArGrCrG | |
| barcode2 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrGrUrC | |
| barcode3 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrUrGrG | |
| barcode4 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArCrUrU | |
| barcode5 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrGrGrU | |
| barcode6 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrUrA | |
| barcode7 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrArUrG | |
| barcode8 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrGrC | |
| barcode9 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrCrArG | |
| barcode10 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrArC | |
| barcode11 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrUrCrU | |
| barcode12 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrArArU | |
| barcode13 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArArGrA | |
| barcode14 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrArA | |
| barcode15 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrGrG | |
| barcode16 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrUrG | |
| barcode17 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrArU | |
| barcode18 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrArU | |
| RT primer | ATTGATGGTGCCTACAG | |
| PCR primer F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |
| PCR primer R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG | |
Tabell 1. Liste over primere.
Tilleggs tabell 1. Liste over strekkode sekvenser. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggs tabell 2. Utvalgte liste over mus microRNA forløper sekvenser. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggs tabell 3. Utvalgte liste over menneskelige microRNA forløper sekvenser. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggs tabell 4. Rå og normalisert microRNA lese teller. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for identifisering av microRNAs over 20 år siden13, prosessen med microRNA sekvensering fortsatt arbeidskrevende og krever spesialisert utstyr, hindrer laboratorier fra rutinemessig vedta interne protokoller14. Andre teknikker kan samtidig evaluere microRNAs, som microRNA Microarrays og multiplekset uttrykks paneler; Imidlertid er disse tilnærmingene begrenset i at de bare kvantifisere microRNAs stede i sin sonde satt. På grunn av dette, savner de viktige funksjoner i små RNA sekvensering, som identifisering av romanen microRNAs, og av microRNA isoformene-nukleosid endringer som kan ha viktige biologiske funksjon6,7,15 .
Når du starter et nytt eksperiment, bruker en kommersiell leverandør er ofte enklest fordi de tilbyr teknisk støtte og brukervennlighet. Flere kommersielle alternativer er tilgjengelige for microRNA sekvensering, som kan være multiplekset for å redusere arbeidsbelastningen ved behandling av store tall (> 100) av prøvene. Disse kommersielle kits blir stadig bedre, noe som er både en fordel og ulempe. På den ene siden, selskapene som gjør disse kits har utviklet romanen microRNA fangstmetoder, for eksempel gjennom circularization av deres 5 og 3 ender før sekvensering eller bruke Linkers med tilfeldige sekvenser i hver ende for å redusere ligation bias. De har også utviklet metoder for å fjerne adapter-dimers, for eksempel gjennom ligation av dobbel-strandet adaptere eller hybridisering av komplementære oligonukleotider. På den annen side, kommersielle kits anbefaler mot modifisering eller endring av noen trinn. Derfor, hvis noen oppdateringer er gjort til et kit, er det vanskelig eller umulig å sammenligne data avledet fra gamle og nye versjoner av kits, samt data avledet fra kits fra ulike kommersielle leverandører. Her har vi beskrevet en protokoll som har utholdenhet i møte med kommersielle alternativer. Vårt fokus på gel rensing trinn-mens de legger tid til protokollen-muliggjør konsistent microRNA fangst og reproduserbarhet over de mange årene vi har brukt det. Flere evalueringer av reproduserbarhet mellom kommersielle kits og interne protokoller er gjort, og vi henviser leseren til noen av disse studiene16,17,18,19. Viktigere, fremgangsmåten vi skissere for bioinformatikk analyse av microRNAs kan benyttes uavhengig av valg av Kit eller in-House-protokollen.
MicroRNA sekvensering er ofte plaget av valg av strekkoder: i noen tilfeller kan ligation effektiviteten av de ulike strekkodene ikke være tilsvarende, noe som fører til partisk distribusjoner av sekvenser i prøvene20. Det er nå anbefalt å bruke "fordervet"-baser på 5-og 3-enden for å minimere ligation skjevheter i spesifikk microRNAs21,22. I denne protokollen har vi ikke observert disse ligation problemene og har observert konsekvente readouts for tekniske og biologiske replikerer evaluert med forskjellige strekkoder5,6,7,23, men det er viktig å være klar over dem. Metoder for å unngå ligation skjevhet omfatter innlemmelse av indeks primere i PCR-primere, eller for å legge til en eller flere tilfeldige RNA-nucleosides på 3 enden av 5-adapter sekvensen (tabell 1). Vi presenterer en eller flere syntetiske pigg-i RNA, slik som C. elegans miR-39 microRNA24, er også et alternativ for normalisering formål, som er kritisk for lav yield situasjoner, som kvantifisere microRNAs fra exosomes. På samme måte, for RNA-ligation, har vi med hell brukt T4 RNA ligase 1, men ligation med mindre bias har blitt demonstrert for en avkortet form av T4 RNA ligase 225. Til slutt, hevet skrift III og IV er alternativ omvendt transkripsjon enzymer som vi har brukt uten problem.
Valget av microRNA database kan også påvirke de endelige normalisert resultatene. En utfordring med Curating microRNA databaser er at flere romanen små RNAs oppført som microRNAs er faktisk fragmenter av gjenta elementer og ikke bona fide microRNAs2. Det er gjort forsøk på å pensjonere microRNAs som ikke er i overensstemmelse med standardkriterier, slik at neste versjon av en microRNA-database er mer raffinert; den neste gjentakelsen inneholder imidlertid også nye kandidater som trenger bekreftelse. Når gjenta avledede microRNAs er inkludert i justeringer, kan de forskyve resultatene og overvelde data fra eksisterende microRNAs. Derfor er bruken av godt utvalgte datasett av microRNAs fra ulike arter avgjørende26,27. Vi har opplevd størst reproduserbarhet når du justerer små RNA-sekvenser til utvalgte lister over bevarte microRNAs og har tatt med disse hårnålene i supplerende tabell 2 og tilleggs tabell 3. Disse listene samsvarer med anslag på om 500 høy tillit microRNAs i den menneskelige Genova2,26.
Som med alle teknikk, bør resultatene bekreftes med en ortogonale tilnærming. Vi har med hell gjengis små RNA sekvensering resultater med liten RNA nordlige blots som innlemme radiolabeled sonder for å bekrefte størrelsen og relative overflod av kandidaten microRNAs6,7,23. Kvantitativ PCR av microRNAs benytter up-lese sekvensering, og bekreftelse av mål mRNA endre benytter qPCR og Villvestfilm blotting er annet valgmulighetene for godkjenningen.
Oppsummert har vi gitt en metode for å isolere og sekvens microRNAs og utføre justeringer mot eksisterende microRNA databaser. Kostnader av reagenser og utstyr og bruk av åpen kildekode-verktøy for analyse bør gjøre denne protokollen tilgjengelig for alle. Endelig kan denne protokollen brukes i alle vev eller cellelinje for å gi svært reproduserbar, høy kvalitet leser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmer av laboratorier av Andrew fire og Markus Kay for veiledning og forslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P.
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C.
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S.
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
