Här presenterar vi ett protokoll för att detektera 5-hydroximetylcytosin i celler och hjärnvävnader, utnyttjar immunofluorescensfärgning och DNA-punktblot-metoder.
Flera DNA-modifieringar har identifierats i däggdjurs arvsmassan. Av detta har 5-metylcytosin och 5-hydroximetylcytosinmedierade epigenetiska mekanismer studerats intensivt. 5-hydroximetylcytosin visar dynamiska egenskaper under embryonal och postnatal utveckling av hjärnan, spelar en reglerande funktion i genuttryck, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar. Här beskriver vi de detaljerade metoder inklusive immunofluorescensteknik färgning och DNA dot-blot att upptäcka 5-hydroxymetylcytosin i odlade celler och hjärnan vävnader av mus.
Epigenetiska modifikationer, inklusive DNA-modifiering, histonmodifiering och RNA-modifiering, har visat sig spela viktiga funktioner i olika biologiska processer och sjukdomar1,2,3, 4 , ,5 , 6 , 7. under lång tid har DNA-metylering (dvs. 5-metylcytosin (5-MC)) visats som en mycket stabil epigenetisk markör och kan inte modifieras ytterligare i genomet. Nyligen, det har visat sig att 5-MC kan oxideras till 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) av tet (tio-eleven translokationer) familj proteiner inklusive TET1, TET2, och TET38,9. Ytterligare studier visar att 5-HMC kan fungera som en stabil markör och spela biologiska roller genom att reglera genuttryck4,10,11,12.
De nuvarande bevisen tyder på att 5-HMC är mycket berikat i neuronala vävnader/celler i förhållande till andra typer av vävnader hos däggdjur, och uppvisar dynamiska egenskaper under neuronala utveckling13,14. I neuronala systemet, 5-hmC medierade epigenetiska modifieringar spelar en viktig roll i regleringen av neurala stamceller, neuronala aktivitet, inlärning och minne, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar inklusive Rett syndrom, autism, Alzheimers sjukdom, Huntingtons sjukdom, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Det finns flera metoder för att upptäcka 5-HMC i celler och vävnader14,21,22,23,24. Här beskriver vi två metoder för att upptäcka förekomsten av 5-hmC och kvantifiera den globala nivån av 5-hmC: färgning av immunofluorescensteknik och DNA dot-blot. Dessa två metoder är bekväma och känsliga, och har framgångsrikt använts i tidigare studier25,26,27,28,29,30. De viktigaste stegen i dessa två metoder är DNA-denaturering. För immunofluorescenfärgning av 5-hmC krävs förbehandling av prover med 1 M HCl. För 5-hmC dot-blot utförs DNA-denaturering med NaOH-lösning. Dessa två metoder tillsammans med nästa generations sekvensering är mycket användbara verktyg för att undersöka funktionen av 5-hmC.
Epigenetiska modifikationer spelar viktiga roller under hjärnans utveckling, mognad och funktion. Som en stabil markör för DNA-modifiering, dynamisk 5-hmC svarar på beteendemässig anpassning, neuronala aktivitet, och är positivt korrelerad med genuttryck; Sålunda, det är involverat i hjärnans normala funktion och neurologiska störning4. För att utforska dess funktion i celler och vävnader, är det nödvändigt att upptäcka förekomsten av 5-hmC och jämföra nivån före och efter beh…
The authors have nothing to disclose.
XL stöddes delvis av den nationella nyckeln R & D program i Kina (2017YFE0196600), och National Natural Science Foundation i Kina (Grant nos. 31771395, 31571518). Q.S. stöddes av Kinas nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogram (2017YFC1001703) och det centrala forsknings-och utvecklingsprogrammet i Zhejiang-provinsen (2017C03009). W.X. stöddes av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (LY18H020002) och Science Technology-avdelningen i Zhejiang-provinsen (2017C37057).
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
GlutaMax | Thermo | 35050061 |
L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
OCT | Leica | 14020108926 |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
Triton X-100 | Solarbio | T8210 |