אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף
Summary
מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.
Abstract
הבטן האנושית היא הקולוניה של טריליוני חיידקים התומכים בפונקציות פיזיולוגיות כגון מטבוליזם המזון, קצירת האנרגיה והוויסות של המערכת החיסונית. הסתעפות של מיקרובידום המעיים הבריא הוצע לשחק תפקיד בפיתוח מחלות דלקתיות, כולל טרשת נפוצה (MS). גורמים סביבתיים וגנטיים יכולים להשפיע על ההרכב של המיקרובידום; לכן, זיהוי של קהילות מיקרוביאלית המקושרים עם פנוטיפ המחלה הפך לצעד הראשון להגדרת התפקיד של microbiome בריאות ומחלות. השימוש ברצפי המידע של הקהילה החיידקית של 16S, עזר בקידום מחקר מיקרובידום. למרות השימוש הנרחב שלה, אין פרוטוקול אחיד עבור ניתוח מבוססי מיסים של 16 s rRNA בפרופיל. מגבלה נוספת היא ברזולוציה נמוכה של הקצאת מיסים עקב קשיים טכניים כגון קריאות ברצף קטן יותר, כמו גם השימוש בלבד (R1) קורא בניתוח הסופי עקב איכות נמוכה של הפוכה (R2) קורא. יש צורך בשיטה פשוטה עם רזולוציה גבוהה לאפיון מגוון חיידקי בביודגימה נתונה. התקדמויות בטכנולוגיית רצף עם היכולת רצף קריאות ארוכות יותר ברזולוציה גבוהה סייעו להתגבר על חלק מהאתגרים אלה. הנוכחי ברצף הטכנולוגיה בשילוב עם צינור ניתוח מטאגנמית זמין לציבור כמו R מבוססי מגדרהמערכות האלגוריתם Denoאיזינג-2 (DADA2) עזר לקדם פרופיל מיקרוביאלית ברזולוציה גבוהה, כמו DADA2 יכול להקצות רצף בסוג ורמות המינים. המתואר כאן הוא מדריך לביצוע פרופילים חיידקיים באמצעות שני הגברה של האזור V3-V4 של הגנים של 16 s rRNA, ואחריו ניתוח באמצעות כלי ניתוח זמין בחופשיות (כלומר, DADA2, Phyloseq, ו-Metאגנאסיל). הוא האמין כי זרימת עבודה פשוטה ומלאה תשמש ככלי מצוין עבור החוקרים המעוניינים בביצוע מחקרים בפרופיל microbiome.
Introduction
Microbiota מתייחס לאוסף של מיקרואורגניזמים (חיידקים, וירוסים, הארכאים, בקטריה, ופטריות) חיים בסביבה מסוימת, ו microbiota מתייחס הגנום הקולקטיבי של מיקרואורגניזמים תושב. כמו חיידקים הם אחד החיידקים הנפוצים ביותר בבני אדם ועכברים, מחקר זה מתמקד רק על פרופיל חיידקי. הבטן האנושית היא הקולוניה של טריליוני חיידקים ומאות זנים חיידקיים1. הבטן הרגילה microbiota משחק תפקיד חיוני בשמירה על מצב בריא במחשב המארח על ידי ויסות פונקציות (כלומר, תחזוקה של מחסום מעיים שלם, מטבוליזם מזון, הומאוסטזיס אנרגיה, עיכוב של הקולוניזציה על ידי אורגניזמים פתוגניים, ו תקנה של תגובות החיסון)2,3,4,5. Compositional של הבטן microbiota (בטן דיסביוזיס) קושרו למספר מחלות אנושיות, כולל הפרעות במערכת העיכול6, השמנת יתר7,8, קו9, סרטן10, סוכרת8,11, דלקת מפרקים שגרונית12, אלרגיות13, מחלות מרכז העצבים הקשורות כגון טרשת נפוצה (MS)14,15 ו אלצהיימר מחלה (AD)8,16. לכן, בשנים האחרונות, יש כבר עניין גדל בכלים לזיהוי הרכב חיידקי באתרי גוף שונים. שיטה אמינה צריכה להיות מאפיינים כגון להיות תפוקה גבוהה וקלה לשימוש, בעל היכולת לסווג microbiota חיידקי ברזולוציה גבוהה, ולהיות בעלות נמוכה.
טכניקות מיקרוביולוגית המבוססות על תרבות אינן רגישות מספיק כדי לזהות ולאפיין את מיקרובידום הבטן המורכבת בשל כישלון של מספר חיידקי הבטן לצמוח בתרבות. הופעתו של הטכנולוגיה המבוססת על רצף, במיוחד rRNA-מבוסס על רצף metagenomic, יש להתגבר על כמה אתגרים אלה והפך מחקר microbiome17. מתקדם 16S rRNA מבוסס רצף הטכנולוגיה סייעה בהקמת תפקיד קריטי עבור המעיים מיקרובידום בבריאות האדם. פרויקט המיקרובידום האנושי, המכון הלאומי ליזמות בריאותית18, ופרויקט המטהיט (יוזמה אירופאית)19 שניהם סייעו בהקמת מסגרת בסיסית לניתוח מיקרובידום. יוזמות אלה סייעו בעיטה-להתחיל מחקרים מרובים כדי לקבוע את התפקיד של מיקרובידום בטן האדם בריאות ומחלות.
מספר קבוצות הראו תחושת בטן בחולים עם מחלות דלקתיות12,14,15,20,21,22. למרות שנעשה שימוש נרחב בפרופיל מסים בשל היכולת ליצור מולטיפלקס ועלויות נמוכות, אין פרוטוקולים אחידים עבור פרופיל מטקמי מבוסס 16S. מגבלה נוספת היא ברזולוציה נמוכה של משימה מטקמיים בשל קריאות ברצף קטן יותר (150 bp או 250 bp) ושימוש ברצף הקדמי רק לקרוא (R1) עקב באיכות נמוכה ברצף הפוכה קריאות (R2). עם זאת, ההתקדמות בטכנולוגיית הרצף סייעה להתגבר על חלק מהאתגרים הללו, כגון היכולת לרצף יותר באמצעות קריאות מזווג-end (למשל, מאייר מיseq 2x300bp).
הטכנולוגיה הנוכחית ברצף יכול לרצף 600 bp באיכות טובה קורא, אשר מאפשר מיזוג של R1 ו R2 קורא. אלה ממוזגים עוד R1 ו-R2 קורא לאפשר משימות מיסוי טוב יותר, במיוחד עם גישה פתוחה R-מבוסס מגדלהעל מתחת מערכת האלגוריתם Denoising הפלטפורמה 2 (DADA2) פלטפורמת. DADA2 מנצל אמפליקון רצף variant (asv) משימות מבוססות במקום יחידת מיסים מבצעית (otu) הקצאות מבוסס על 97% דמיון מנוצל על ידי qiime23. ASV גפרורים התוצאה במשחק רצף מדויק במסד הנתונים בתוך 1-2 נוקלאוטידים, אשר מוביל הקצאה בסוג ורמות מינים. כך, שילוב של זמן רב יותר, באיכות טובה לזווג וכלים הקצאה טובה יותר (כגון DADA2) הפכו לימודי מיקרובידום.
בתנאי זה מדריך צעד אחר צעד לביצוע פרופיל חיידקי באמצעות הגברה של שני השלבים של האזור V3-V4 של 16S rRNA וניתוח נתונים באמצעות DADA2, Phyloseq, ו-Metאגנאסיל לסייע צינורות. עבור מחקר זה, אנטיגן לוקיציט אנושי (hla) בכיתה ii עכברים הטרנסגניים משמשים, כמו hla class ii אללים מקושרים עם נטייה מחלות אוטואימוניות כגון MS20,24,25. עם זאת, החשיבות של הגנים השנייה בכיתה HLA בוויסות הרכב של מיקרוביוטה בטן אינו ידוע. היפותזה היא כי מולקולת HLA class II ישפיע על הקהילה מיקרוביאלית של הבטן על ידי בחירת חיידקים ספציפיים. מורכב היסטוליאני מורכבים (mhc) מחלקה II עכברים (AE. KO) או עכברים המבטא האדם hla-DQ8 מולקולות (hla-DQ8)24,25,26 שימשו כדי להבין את החשיבות של hla class II מולקולות ב עצב את הקהילה הבין-מיקרוביאלית. הוא האמין כי זרימת עבודה זו מלאה ומפושטת עם ניתוח נתונים מבוססי R ישמש ככלי מצוין עבור החוקרים המעוניינים בביצוע מחקרים בפרופיל microbiome.
הדור של עכברים חסר אנדודוגני מורה MHC מחלקה II גנים (AE. KO) ו-AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) העכברים הטרנסגניים עם רקע C57BL/6J כבר תיאר בעבר26. דגימות צואה נאספו מעכברים של שני המינים (8-12 שבועות של גיל). עכברים התרבו בעבר ונשמרו ב אוניברסיטת איווה מתקן בעלי חיים לפי הנחיות NIH ומוסדיים. זיהום אסטרטגיות שליטה כגון הגמילה של עכברים בתוך הקבינט הזרם למינארי, שינוי של כפפות בין זנים שונים של עכברים, ותחזוקה נאותה של עכברים הם צעדים קריטיים עבור פרופיל של מיקרובידום בטן.
ציוד הגנה אישי מתאים (PPE) מומלץ מאוד במהלך ההליך כולו. יש לכלול פקדים שליליים מתאימים בעת ביצוע בידוד DNA, PCR1 ו-PCR2 הגברה ושלבי הרצף. מומלץ להשתמש בציוד סטרילי, ללא תשלום, RNase-free ו-pyrogen-חינם. מומלץ להשתמש בצנרת המיועדת לעבודה במיקרו-מיקרו ובטיפים מסוננים לאורך כל הפרוטוקול. ניתוח microbiota מורכב משבעה שלבים: 1) לדוגמה בצואה איסוף ועיבוד; 2) הוצאת דנ א; 3) 16S rRNA הגברה הגנים; 4) בניית ספריית דנ א באמצעות PCR באינדקס; 5) ניקוי וכימות של ה-PCR הכלול באינדקס (ספריה); 6) רצף מיseq; ו -7) ניתוח נתונים ועיבוד רצף. דיאגרמה סכמטית של כל שלבי הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, עם שלבים קל לבצע כדי לבצע פרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית 16S מספר גדול של ביומינים רבים של עניין. רצף הדור הבא השתנה לימודי אקולוגיה, במיוחד אצל מודלים אנושיים וטרום-קליניים של המחלה31,32. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לנתח …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר מימון מתוך NIAID/NIH (1R01AI137075-01), המבתר אמון ביוזמת המחקר הרפואי מענק, ואת אוניברסיטת איווה הסביבה מרכז לחקר הבריאות המרכז, ארני/NIH (P30 ES005605).
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer’s disease. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn’s & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
