Summary
Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.
Abstract
El intestino humano es colonizado por billones de bacterias que apoyan funciones fisiológicas como el metabolismo de los alimentos, la recolección de energía, y la regulación del sistema inmunológico. Se ha sugerido que la perturbación del microbioma intestinal sano desempeña un papel en el desarrollo de enfermedades inflamatorias, incluida la esclerosis múltiple (EP). Los factores ambientales y genéticos pueden influir en la composición del microbioma; por lo tanto, la identificación de comunidades microbianas vinculadas con un fenotipo de la enfermedad se ha convertido en el primer paso hacia la definición del papel del microbioma en la salud y la enfermedad. El uso de la secuenciación metagenómica de 16S rRNA para la generación de perfiles de la comunidad bacteriana ha ayudado a avanzar en la investigación del microbioma. A pesar de su amplio uso, no existe un protocolo uniforme para el análisis de perfiles taxonómicos basado según rRNA 16S. Otra limitación es la baja resolución de la asignación taxonómica debido a dificultades técnicas tales como lecturas de secuenciación más pequeñas, así como el uso de sólo lecturas hacia adelante (R1) en el análisis final debido a la baja calidad de lecturas inversas (R2). Es necesario un método simplificado con alta resolución para caracterizar la diversidad bacteriana en un bioespécme dado. Los avances en la tecnología de secuenciación con la capacidad de secuenciar lecturas más largas a alta resolución han ayudado a superar algunos de estos desafíos. La tecnología de secuenciación actual combinada con una canalización de análisis metagenómico disponible al público, como Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basado en R, ha ayudado a avanzar en el perfilmicrobiano a alta resolución, ya que DADA2 puede asignar secuencia en el género y los niveles de especies. Aquí se describe una guía para realizar perfiles bacterianos utilizando amplificación en dos pasos de la región V3-V4 del gen rRNA 16S, seguido de un análisis utilizando herramientas de análisis disponibles libremente (es decir, DADA2, Phyloseq y METAGENassist). Se cree que este flujo de trabajo simple y completo servirá como una excelente herramienta para los investigadores interesados en realizar estudios de perfildeo de microbioma.
Introduction
Microbiota se refiere a una colección de microorganismos (bacterias, virus, arqueas, bacteriófagos y hongos) que viven en un entorno particular, y el microbioma se refiere al genoma colectivo de los microorganismos residentes. Como las bacterias son uno de los microbios más abundantes en humanos y ratones, este estudio se centra sólo en el perfil aseguir bacterias. El intestino humano es colonizado por billones de bacterias y cientos de cepas bacterianas1. La microbiota intestinal normal desempeña un papel vital en el mantenimiento de un estado saludable en el huésped mediante la regulación de las funciones (es decir, el mantenimiento de una barrera intestinal intacta, metabolismo alimentario, homeostasis energética, inhibición de la colonización por organismos patógenos, y regulación de las respuestas inmunitarias)2,3,4,5. Las perturbaciones compositivas de la microbiota intestinal (disbiosis intestinal) se han relacionado con una serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos gastrointestinales6, obesidad7,8, accidente cerebrovascular9, cáncer10, diabetes8,11, artritis reumatoide12, alergias13,y enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central como la esclerosis múltiple (Mipymes)14,15 y Alzheimer enfermedad (AD)8,16. Por lo tanto, en los últimos años, ha habido un creciente interés en las herramientas para identificar la composición bacteriana en diferentes sitios del cuerpo. Un método confiable debe tener características tales como ser de alto rendimiento y fácil de usar, tener la capacidad de clasificar la microbiota bacteriana con alta resolución y ser de bajo costo.
Las técnicas microbiológicas basadas en el cultivo no son lo suficientemente sensibles como para identificar y caracterizar el microbioma intestinal complejo debido a la falta de varias bacterias intestinales para crecer en el cultivo. El advenimiento de la tecnología basada en la secuenciación, especialmente la secuenciación metagenómica basada en rRNA 16S, ha superado algunos de estos desafíos y transformado la investigación del microbioma17. La avanzada tecnología de secuenciación basada en rRNA 16S ha ayudado a establecer un papel crítico para el microbioma intestinal en la salud humana. El Proyecto Microbioma Humano, una iniciativa18de los Institutos Nacionales de Salud y el proyecto MetaHIT (una iniciativa europea)19 han ayudado a establecer un marco básico para el análisis de microbiomas. Estas iniciativas ayudaron a poner en marcha múltiples estudios para determinar el papel del microbioma intestinal en la salud humana y la enfermedad.
Varios grupos han mostrado disbiosis intestinal en pacientes con enfermedades inflamatorias12,14,15,20,21,22. A pesar de ser ampliamente utilizado para la generación de perfiles taxonómicos debido a la capacidad de multiplex y bajos costos, no hay protocolos uniformes para la generación de perfiles taxonómicos basados en rRNA 16S. Otra limitación es la baja resolución de la asignación taxonómica debido a lecturas de secuenciación más pequeñas (150 bp o 250 bp) y el uso de sólo lectura de secuenciación directa (R1) debido a lecturas de secuenciación inversa de baja calidad (R2). Sin embargo, los avances en la tecnología de secuenciación han ayudado a superar algunos de estos desafíos, como la capacidad de secuenciar lecturas más largas utilizando lecturas de extremo emparejado (por ejemplo, Illumina MiSeq 2x300bp).
La tecnología de secuenciación actual puede secuenciar lecturas de buena calidad de 600 bp, lo que permite la fusión de lecturas R1 y R2. Estas lecturas más largas R1 y R2 combinadas permiten mejores asignaciones taxonómicas, especialmente con la plataforma Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basada en R de acceso abierto. DADA2 utiliza asignaciones basadas en variantes de secuencia de amplificación (ASV) en lugar de asignaciones de unidadtaxística operativa (OTU) basadas en una similitud del 97% utilizada por QIIME23. Las coincidencias ASV dan como resultado una coincidencia de secuencia exacta en la base de datos dentro de 1-2 nucleótidos, lo que conduce a la asignación a nivel de género y especie. Por lo tanto, la combinación de lecturas pares más largas y de buena calidad y mejores herramientas de asignación taxonómica (como DADA2) han transformado los estudios de microbioma.
Aquí se proporciona una guía paso a paso para realizar perfiles bacterianos mediante la amplificación en dos pasos de la región V3-V4 de rRNA 16S y análisis de datos mediante tuberías DADA2, Phyloseq y METAGENassist. Para este estudio, se utilizan ratones transgénicos de antígeno leucocito humano (HLA) clase II, ya que algunos alelos de clase II de HLA están vinculados con una predisposición a enfermedades autoinmunes como la MS20,24,25. Sin embargo, se desconoce la importancia de los genes HLA clase II para regular la composición de la microbiota intestinal. Se presume que la molécula HLA clase II influirá en la comunidad microbiana intestinal seleccionando para bacterias específicas. Principales ratones noqueantes de clase II del complejo de histocompatibilidad (MHC) (AE.KO) o ratones que expresan moléculas HLA-DQ8 humanas (HLA-DQ8)24,25,26 fueron utilizados para entender la importancia de las moléculas HLA clase II en moléculas HLA clase II en dar forma a la comunidad microbiana intestinal. Se cree que este flujo de trabajo completo y simplificado con análisis de datos basados en R servirá como una excelente herramienta para los investigadores interesados en realizar estudios de generación de perfiles de microbioma.
La generación de ratones que carecen de genes endógenos mandinos MHC clase II (AE.KO) y AE-/-. Los ratones transgénicos HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) con un fondo C57BL/6J se han descrito anteriormente26. Las muestras fecales se recogen de ratones de ambos sexos (8-12 semanas de edad). Los ratones fueron criados y mantenidos previamente en las instalaciones de animales de la Universidad de Iowa de acuerdo con los NIH y las directrices institucionales. Las estrategias de control de la contaminación, como el destete de los ratones dentro de un gabinete de flujo laminar, el cambio de guantes entre diferentes cepas de ratones y el mantenimiento adecuado de los ratones, son pasos críticos para el perfilado del microbioma intestinal.
El equipo de protección personal (EPP) adecuado es muy recomendable durante todo el procedimiento. Se deben incluir controles negativos adecuados al realizar el aislamiento del ADN, la amplificación de PCR1 y PCR2 y los pasos de secuenciación. Se recomienda el uso de suministros estériles, libres de DNase, libres de RNase y libres de pirógenos. El pipeteador designado para el trabajo de microbioma y las puntas de pipeta filtradas se debe utilizar en todo el protocolo. El análisis de la microbiota consta de siete pasos: 1) recolección y procesamiento de muestras fecales; 2) extracción de ADN; 3) Amplificación del gen 16S rRNA; 4) Construcción de la biblioteca de ADN utilizando PCR indexado; 5) limpieza y cuantificación de LA PCR indexada (biblioteca); 6) Secuenciación MiSeq; y 7) procesamiento de datos y análisis de secuencias. En la Figura 1se muestra un diagrama esquemático de todos los pasos del protocolo.
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Protocol
El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa.
1. Recolección y Manipulación de Muestras Fecales
- Esterilice las cajas divisoras (ver Tabla de Materiales, Figura Suplementaria 1)con 70% de etanol.
- Pre-etiquetar tubos de microcentrífuga (uno por ratón) con el ID de muestra y el grupo de tratamiento (si corresponde).
- Coloque los ratones en cajas divisoras esterilizadas y permítales defecar normalmente hasta 1 h.
- Recoja los gránulos fecales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preetiquetado y preetiquetado con fórceps estériles y cierre el tubo de forma segura. Esterilice los fórceps después de recogerlos de cada ratón.
- Coloque el tubo de microcentrífuga que contenga pellets fecales en un congelador de -80 oC hasta su posterior procesamiento.
NOTA: Las cajas divisoras son ventajosas porque permiten la recolección simultánea de muestras fecales de varios ratones (hasta 12) a la vez.
2. Extracción de ADN
- Retire las muestras fecales (ratón o humano) del congelador y descongele a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Es aconsejable descongelar las muestras de heces humanas durante la noche a 4 oC según sea necesario para recoger 200 mg o la cantidad requerida de muestras de stock. - Utilizar 200 mg de materiales de partida y eluir el ADN a un volumen final de 50 ml.
- Incluya un kit de aislamiento de ADN en blanco en el que no se agregue ninguna muestra fecal, pero se procesa a través de todos los pasos de extracción de ADN.
NOTA: Se utilizó un kit específico de aislamiento de ADN (ver Tabla de Materiales),ya que contiene reactivos específicos para eliminar materiales inhibidores como biosólidos, material vegetal no digerido y compuestos de hema de glóbulos rojos lysed presentes en las heces humanas y de ratón Muestras. - Coloque el tubo de perla en un homogeneizador (ver Tabla de Materiales)y homogeneice las muestras durante 45 s a RT y una velocidad de 4,5 m/s.
NOTA: Se puede utilizar el homogeneizador de perlas de cualquier fabricante. Sin embargo, se recomienda estandarizar el método, específicamente la velocidad y la duración de la homogeneización, cuando se utiliza el homogeneizador de golpe de perlas de otro proveedor. - Aísle el ADN de muestras fecales individuales del ratón utilizando un kit de aislamiento de ADN bacteriano siguiendo el protocolo del fabricante (ver Tabla de Materiales)con modificaciones menores. Cuantifique el ADN aislado cargando 1 l del ADN en un fluorímetro o en el chip de electroforesis de alta sensibilidad (ver Tabla de materiales).
NOTA: El rendimiento esperado del ADN puede variar de 500 a 2.500 ng cuando se inician con 200 mg de la muestra fecal. - Ajuste la concentración de ADN a 4-20 ng /-L usando tampón de elución. Vuelva a cuantificar el ADN (como se hace en el paso 2.5) antes de proceder a la amplificación del gen rRNA 16S (PCR1), si el PCR1 no se realiza el mismo día.
3. Amplificación del gen del ARNR 16S (PCR1)
- Configure la amplificación del gen rRNA 16S (PCR1) en una placa pcR de 96 pocillos utilizando un volumen de reacción de 25 ml.
- Usando una pipeta multicanal, añadir 12,5 l de mezcla enzimática de polimerasa de alta fidelidad 2x incluyendo tampón, además de dNTPs (ver Tabla de Materiales):40 ng de ADN en un volumen total de hasta 10,5 l (ajuste el volumen total con agua de grado PCR): 1 l (cada uno) de adn hacia delante en volumen total de hasta 10,5 l (ajuste el volumen total con agua de grado PCR): 1 l (cada uno) de avance e imprimaciones inversas a una concentración de 1 M.
NOTA: Las secuencias de los cebantes son las siguientes:
imprimación delantera de 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGNGGCWGCAG-3' de imprimación inversa á 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3'. Incluya un kit en blanco del paso 2.3 (control del reactivo del kit) en la placa PCR. - Sellar la placa de PCR y la centrífuga a 1.000 x g a 20 oC durante 1 min en una centrífuga de placa de mesa (ver Tabla de Materiales)y realizar la PCR en un ciclor térmico programado para: 95 oC durante 3 min; 25 ciclos de 1) 95oC para 30 s, 2) 55oC para 30 s, 3) 72oC para 30 s; extensión final a 72 oC durante 5 min; y mantener a 4 oC.
NOTA: Aunque este método de amplificación del gen 16S rRNA debe funcionar con diferentes tipos de biorespecímenes, se recomienda estandarizar el número de ciclos de amplificación al iniciar un nuevo proyecto. - Confirme el tamaño del producto PCR1 cargando 1 l del ADN en un chip de electroforesis de alta sensibilidad. Alternativamente, ejecute 5 sL del producto amplificado con rRNA 16S en un gel de agarosa del 1,5% para confirmar 550 bp del producto PCR1.
NOTA: La limpieza del producto amplificado 16S rRNA es opcional y depende del kit/método de aislamiento de ADN que se esté utilizando. Si se utiliza un método interno de aislamiento de ADN, el producto PCR1 se puede limpiar utilizando un kit de purificación de ADN de microbioma según el protocolo del fabricante (ver Tabla de materiales). El kit de aislamiento de ADN utilizado aquí produce un ADN ultrapuro y no requiere la limpieza del producto PCR1.
4. Construcción de la biblioteca de ADN mediante PCR indexado (PCR2)
-
Coloque las imprimaciones con código sellos index 1 e Index 2 en un bastidor especial (consulte Tabla de materiales) para 96 bibliotecas.
- Organice la imprimación del índice 1 en las columnas 1–12 y la imprimación del índice 2 en las filas A–H del bastidor especial.
- Agregue 2,5 s de la imprimación del índice 1 en las columnas 1–12 y del índice 2 en las filas A–H utilizando pipetas multicanal. Coloque la nueva tapa (ver Tabla de Materiales)en las imprimaciones adoptantes del índice 1 y del índice 2 y guárdela en un congelador de -20 oC.
- Usando una pipeta multicanal, añadir 12,5 l de mezcla enzimática de polimerasa de alta fidelidad 2x que contenga un tampón, además de dNtPs(ver Tabla de materiales); 5 l de agua de grado PCR y 2,5 ml de producto amplificado con rRNA 16S.
NOTA: Agregue índices únicos a cada ejemplo para la multiplexación de más de 96 bibliotecas en una sola ejecución, como se describe en Kiernan et al.27. El protocolo actual utiliza adaptadores de un kit comercial (por ejemplo, Nextera XT Index Kit) según las instrucciones del fabricante proporcionadas en el método de secuenciación de metagenómica 16S (por ejemplo, Illumina). - Sellar y centrifugar la placa PCR indexada a 1.000 x g a 20 oC durante 1 min y realizar la PCR en un ciclor térmico programado para: 95 oC durante 3 min; 8 ciclos de 1) 95oC para 30 s, 2) 55oC para 30 s, 3) 72oC para 30 s; y la extensión final a 72 oC durante 5 min.
- Confirme el tamaño base 630 del producto PCR indexado cargando 1 l de ADN en un chip de electroforesis de alta sensibilidad. Alternativamente, ejecute 5 ml de producto PCR indexado en un gel de agarosa del 1,5% para confirmar el tamaño y la intensidad del producto.
5. Limpieza de PCR indexado (PCR2) y cuantificación
- Piscina de 5 l de PCR2 amplificar utilizando pipetas multicanal de cada poca en una bandeja de depósito multicanal libre de DNase detectable, RNase, ADN humano y bacterias pirogénicas (ver Tabla de Materiales).
- Transfiera el producto agrupado desde la bandeja de depósito multicanal a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice vacío y preetiquetado para mezclar.
- Purificar el producto PCR2 utilizando el kit de perlas magnéticas estándar(ver Tabla de Materiales)según las instrucciones del fabricante. Sellar y almacenar los 20 ml restantes de PCR2 en la misma placa a -80 oC para su uso posterior, si es necesario.
- Preparar etanol fresco 80% añadiendo 4 ml de etanol 100% a 1 ml de agua de grado PCR.
- Equilibrar el cordón magnético a RT y vórtice durante 30 s para dispersar las cuentas uniformemente.
- Brevemente vórtice y girar hacia abajo las muestras de amplificación PCR2 agrupados.
- Añadir 80 l de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga estéril y preetiquetado de 1,5 ml con 80 ml de productos de PCR agrupados, luego vórtice y girar brevemente para resuspender uniformemente las perlas magnéticas.
- Incubar el contenido en RT sin perturbar los tubos durante 15 min.
- Coloque el tubo con el ADN y las perlas magnéticas en un soporte magnético(ver Tabla de Materiales)durante 5 min.
- Retirar y desechar con cuidado 150 s del sobrenadante.
- Añadir 200 ml de etanol al 80% recién preparado sin alterar las perlas e incubar durante 30 s.
- Retire con cuidado y deseche todo el sobrenadante.
- Repita los pasos 5.11–5.12. Retire el volumen restante con una pipeta P10. Deje que las perlas se sequen al aire durante 15 minutos, con el tubo PCR de índice restante en el soporte magnético.
- Retirar del soporte magnético. Añadir 33 l de tampón de elución (el tampón de elución del kit de ADN es aceptable). Vórtice bien, y realizar un giro rápido para eliminar cualquier líquido restante en el lado. Incubar durante 2 min y colocar en el soporte magnético durante 5 min.
- Transfiera 30 l del sobrenadante (productos de PCR limpios) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preetiquetado.
- Cuantifique la piscina purificada cargando 1 l de la piscina purificada en un fluorímetro o chip de electroforesis de alta sensibilidad, ya que esto será necesario durante la secuenciación. Realice MiSeq como se detalla a continuación.
6. Secuenciación MiSeq
- Cree una hoja de muestra que contenga información de código de barras específica de la muestra para el flujo de trabajo de metagenómica y la desmultiplexación en el instrumento MiSeq(consulte Tabla de materiales). Cargue esta hoja de muestra en el software (por ejemplo, Illumina Experiment Manager).
- Diluir las bibliotecas agrupadas del paso 5.15 a 4 nM.
- Bibliotecas agrupadas de desnaturalidad mediante la combinación de 5 l de la piscina de bibliotecas de 4 nM con 5 l de NaOH de 0,2 M recién preparada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex para mezclar brevemente, centrifugar brevemente e incubar durante 5 min en ambient RT.
- Agregue 990 ml de tampón de hibridación en frío (buffer HB) y pipetea suavemente para mezclar. Esto producirá una biblioteca de 20 pM.
- Combine 2 l de la biblioteca de control de 10 nM con 3 l de búfer EBT (10 mM Tris-HCl, pH a 8,5, con un 0,1% de Tween 20) para producir una biblioteca de control de 4 nM. Añadir 5 s l de NaOH recién preparado y vórtice brevemente para mezclar. Incubar durante 5 min a RT.
-
Agregue el tampón de hibridación en frío con hielo de 990 l (buffer HB) y pipetee suavemente para mezclar. Esto producirá 20 bibliotecas de control de pM.
NOTA: Las bibliotecas de control de 20 pM desnaturalizadas se pueden almacenar a -20 oC hasta 4 semanas. Después de 4 semanas, el número de racimos tiende a disminuir.- Combine 210 l de la biblioteca de 20 pM con 40 l de la biblioteca de control de 20 pM (concentración final de 18 %) y añada 350 ml de búfer HB. Cargue la biblioteca a una concentración final de 7 pM.
NOTA: Los detalles de entrada deben ajustarse según el rendimiento de la ejecución.
- Combine 210 l de la biblioteca de 20 pM con 40 l de la biblioteca de control de 20 pM (concentración final de 18 %) y añada 350 ml de búfer HB. Cargue la biblioteca a una concentración final de 7 pM.
- Incubar muestras durante 2 min a 96oC. Poner hielo durante 5 minutos Cargar 600 s de la piscina final en el pozo apropiado de los cartuchos MiSeq.
NOTA: La sección 6 anterior se puede realizar en una instalación del núcleo genómico/ADN.
7. Procesamiento de datos y análisis de secuencias
- Utilice el software R (versión 3.5) para el procesamiento y análisis de datos DADA2. Para los pasos 7.1–7.4, utilice el software de acceso abierto como se describió en el tutorial en línea de DADA2 desarrollado anteriormente que se encuentra en
NOTA: Se ha adjuntado un script de R fácilmente utilizable como un archivo suplementario 2y los usuarios deben cambiar el nombre y la fuente de los archivos de secuenciación (por ejemplo, SAMPLENAME_R1_001.fastq y SAMPLENAME_R2_001.fastq). - Visualice los perfiles de calidad de las lecturas hacia delante y hacia atrás mediante el comando plotQualityProfile.
- Recortar nucleótidos de lecturas hacia adelante y hacia atrás basados en la gráfica de calidad. Estos parámetros se especifican mediante el parámetro truncLen en DADA2.
NOTA: Aquí, 280 se utiliza como el umbral de longitud para el cual se descartarían las lecturas directas, y 260 se utiliza como el umbral de longitud para el cual se descartarían las lecturas inversas. - Procesar los datos 16S sin procesar como archivos fastq por la canalización DADA2 como se describe en el tutorial en línea (que se encuentra en
NOTA: Una tabla de variantes de secuencia de amplificación de ejemplo generada a partir de la canalización DADA2 se incluye como archivo suplementario 3. Se puede utilizar una base de datos de referencia de Greengene o Silva, ya que no se encontraron diferencias en la clasificación bacteriana utilizando cualquiera de estas bases de datos. - Genere un archivo de asignación definido por el usuario que contenga los metadatos (es decir, genotipo, género, tratamiento, etc.) para cada muestra. Se ha incluido un archivo de metadatos de ejemplo como archivo suplementario 4.
- Calcule la diversidad alfa (índice Shannon) y la diversidad beta utilizando el análisis de coordenadas principales (PCA) basado en los recuentos de OTU enrarecidos utilizando Phyloseq28 como se describe en el tutorial en línea, que se encuentra en
- Realice el siguiente análisis en METAGENassist29.
NOTA: Realice el análisis de abundancia diferencial utilizando la prueba de suma de rango Wilcoxon a nivel de género. Los mapas de calor y los taxones diferencialmente abundantes se resaltan utilizando METAGENassist29,una canalización de análisis disponible públicamente y basada en la web.- Cargue la tabla de abundancia taxonómica (formato CSV) y seleccione Muestras en la columna.
- Cargue el archivo de asignación (formato CSV) y seleccione Ejemplos en una fila.
- Seleccione Opciones para eliminar variables con ceros superiores al 50% y excluir lecturas sin asignar y sin asignar.
- Seleccione Opciones para normalizar filas por suma y registrar columnas de normalización.
- Haga un trazado de Volcano, PCA o PLSDA haciendo clic en el mismo en la columna de la izquierda y haga clic en Eliminar nombre de muestras para crear el gráfico.
- Realice una prueba t(si solo dos grupos) o ANOVA (si es mayor que dos grupos) para visualizar las entidades (bacterias) que difieren entre los grupos. Haga clic en Características seleccionadas para visualizar bacterias específicas que difieren entre grupos.
- Haga clic en Dendrogram o Heat map para crear los trazados respectivos. Se pueden realizar análisis adicionales, como la visualización de muestras por grupos o las 25 características principales basadas en t-test/ANOVA.
- Haga clic en RandomForest para crear gráficos que muestren entidades que se pueden usar para la clasificación. Haga clic en la pestaña Variancia en la parte superior para crear gráficos para las entidades superiores que difieren entre/entre grupos. Haga clic en Detalles de la característica para ver una lista de bacterias que difieren entre grupos y haga clic en cada bacteria para crear un resumen gráfico de la misma.
- Haga clic en la pestaña Valores atípicos en la parte superior para visualizar los ejemplos que son valores atípicos.
- Por último, haga clic en Descargar y seleccione 1) un archivo zip que contenga todos los análisis realizados o 2) las características deseadas para descargar. Este archivo debe guardarse como un nombre único y tendrá que descomprimirse antes de su uso.
NOTA: Para las pruebas estadísticas detalladas realizadas durante el análisis del microbioma, consulte las obras de Chen et al. y Hugerth et al.14,30.
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Representative Results
Como las moléculas MHC clase II (HLA en humanos) son actores centrales en la respuesta inmune adaptativa y muestran fuertes asociaciones con una predisposición a MS24,25,26, se hipotetizó que la molécula HLA clase II influiría en la composición microbiana intestinal. Por lo tanto, los ratones que carecían del gen MHC clase II (AE.KO) o expresaban el gen HLA-DQ8 humano (HLA-DQ8) se utilizaron para comprender la importancia de las moléculas de clase II de HLA en la configuración de la comunidad microbiana intestinal.
Se recogieron muestras fecales de ratones transgénicos AE.KO (n.o 16) y HLA-DQ8 (n.o 12), se extrajo ADN bacteriano y se amplió la región V3-V4 del gen rRNA 16S. El tamaño del amplificador (550 bp) se confirmó ejecutando las muestras en un gel de agarosa del 1,5%(Figura 2A, carriles 1–6). Se realizó una confirmación adicional del tamaño del amplificador de 16S rRNA (550 bp) cargando 1 l del producto PCR1 en un chip de electroforesis de alta sensibilidad(Figura 2B, carriles 1–7).
Se generó un electroferograma a partir del producto 16S rRNA PCR, que mostraba regiones pico con fragmentos de 550 bp(Figura 2C). Los índices dobles y los adaptadores de secuenciación se conectaron mediante PCR indexado (PCR2) que asignaba una identidad única a cada muestra y permitía la multiplexación de muchas muestras en una sola ejecución de secuenciación de MiSeq. La confirmación de la PCR indexada se realizó mediante electroforesis de gel de agarosa(Figura 2A, carriles 7–12) y un chip de electroforesis de alta sensibilidad(Figura 2B, carriles 8–12), Figura 2D]. Todas las muestras de PCR2 fueron agrupadas, purificadas y cargadas en un secuenciador de próxima generación que produjo lecturas R1 hacia delante y R2 inverso de buena calidad(Figura 3). La mediana obtenida de lecturas después de filtrar y recortar la calidad fue de 88.125 (rango de 9.597-111.848).
El análisis de la ecología comunitaria se realizó utilizando la canalización de análisis DADA2 y se visualizó con Phyloseq y METAGENassist para demostrar las diferencias en la diversidad alfa(Figura 4)y la diversidad beta(Figura 5),así como las diferencias en el géneros y especies entre grupos. El análisis DADA2 generó una tabla de abundancia con valores separados por comas en formato csv, que se utilizó para el análisis posterior utilizando una plataforma basada en web (es decir, Phyloseq y/o METAGENassist). Los análisis de diversidad alfa y beta se realizaron en función de las categorías definidas por el usuario enumeradas en un archivo de asignación.
El análisis de la diversidad de Shannon reveló una menor diversidad alfa general para ratones AE.KO en comparación con los ratones transgénicos HLA-DQ8(Figura 3). La ordenación con el análisis de coordenadas principales mostró un clustering espacial distinto entre los ratones AE.KO y los ratones transgénicos HLA-DQ8(Figura 5). También se utilizó una tabla de abundancia de DADA2 para realizar un análisis metagenómico completo utilizando el software de acceso abierto METAGENassist29. Se generaron agrupaciones basadas en mapas térmicos de abundancia bacteriana (nivel de género)(Figura 6A)y una gráfica de caja para bacterias específicas que muestra las diferencias entre dos grupos(Figura 6B)utilizando una tubería DE METAGENassist.
El análisis del mapa térmico mostró que ciertas bacterias como Allobacullum, Desufovibrio y Rikenella eran más abundantes en ratones transgénicos HLA-DQ8. Por el contrario, Biolophila fue más abundante en ratones AE.KO(Figura 6B). Las abundancias relativas de bacterias individuales (Bilophila y Rikenella) se muestran en una gráfica de caja representativa(Figura 6B). En conjunto, los datos demuestran que los ratones AE.KO poseen una comunidad microbiana distinta en comparación con la de los ratones transgénicos HLA-DQ8, con ausencia de bacterias específicas en ratones AE.KO. Los datos también sugieren que las moléculas de clase II de MHC desempeñan un papel importante en la abundancia de ciertas bacterias. En resumen, este protocolo simple y detallado ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como a aquellos que necesitan actualizaciones sobre los métodos para lograr una mayor resolución taxonómica.
Figura 1: Diagrama de flujo de secuenciación de microbioma intestinal. Se muestran todos los pasos de la secuenciación del microbioma (recopilación de muestras para el análisis de datos del microbioma). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Amplificación del gen 16S rRNA y análisis de control de calidad de la región V3-V4. (A) Imagen representativa de la electroforesis representativa del gel de agarosa del amplicon 16S (PCR1, tamaño 550 bp) y PCR indexado (PCR2, tamaño 630 bp) de ratones AE.KO (carriles 1–3 y 7–9) y ratones transgénicos HLA-DQ8 (carriles 4–6 y 10–12). (B) Imagen representativa del gel del amplicon 16S (PCR1, tamaño 550 bp) y PCR indexado (PCR2, tamaño 630 bp) de ratones AE.KO (carriles 1–3 y 8–10) y ratones transgénicos HLA-DQ8 (carriles 4–7 y 11–12) resueltos por electroforesis. (C) El electroferograma representativo del amplicon 16S (PCR1) mostró una región pico que contenía fragmentos de tamaño de 550 bp. (D) El electroferograma representativo de PCR indexado (PCR2) mostró una región pico compuesta por fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de los fragmentos de tamaño de 630 bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfil de calidad de las lecturas directas (R1, superior) para dos muestras representativas y las lecturas inversas correspondientes (R2, inferior) para las mismas muestras. El análisis se realizó utilizando una canalización DADA2, en la que el eje X muestra la longitud de lectura (0–300 bases) y el eje Y muestra la calidad de las lecturas. La línea verde representa la puntuación de calidad media, mientras que la línea naranja representa los cuartiles de la distribución de la puntuación de calidad en cada posición base. Las lecturas directas (R1) siempre mostraron mejor calidad que las lecturas inversas (R2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medidas de diversidad alfa (diversidad Shannon) de ratones AE.KO y ratones transgénicos HLA-DQ8. Cada punto representa la diversidad (diversidad Shannon) en una muestra de un solo ratón. La diversidad de Shannon fue generalmente menor para los ratones AE.KO en comparación con los ratones transgénicos HLA-DQ8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ordenación con gráfica de análisis de cota basada en mínimos cuadrados parciales. La gráfica muestra una clara separación entre los ratones AE.KO y los ratones transgénicos HLA-DQ8. Cada punto representa la composición bacteriana dentro de una muestra, y los eclipses punteados indican intervalos de confianza del 80%. Las gráficas PLS-DA se generaron utilizando METAGENassist. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ratones AE.KO que muestran una comunidad microbiana distinta en comparación con ratones transgénicos HLA-DQ8, con ausencia de bacterias específicas en ratones AE.KO. (A) Mapa de calor combinado con agrupamiento jerárquico aglomerativo aglomerado aglomerativo aglomerativo aglomerativo que muestra la abundancia relativa de bacterias (nivel de género). (B) Caja que muestra una abundancia relativa normalizada de dos bacterias representativas (Bilophila y Rikenella) en ratones transgénicos AE.KO y HLA-DQ8. Ambas parcelas se generaron utilizando METAGENassist. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Imagen representativa de la caja divisora para la recolección de muestras fecales de varios ratones a la vez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario 2: DADA2 R-script para generar tabla de abundancia a partir de secuencias sin procesar. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo Suplementario 3: Tabla representativa de abundancia de género (formato CSV). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo Suplementario 4: Archivo de asignación representativo (formato CSV). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo descrito es simple, con pasos fáciles de seguir para realizar perfiles de microbioma utilizando la secuenciación metagenómica de rRNA 16S de un gran número de biorespecímenes de interés. La secuenciación de próxima generación ha transformado los estudios de ecología microbiana, especialmente en los modelos de enfermedades humanas y preclínicas31,32. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para analizar con éxito composiciones microbianas complejas (microbios culturables y no culturables) en un bioespécmeno determinado a un alto nivel de rendimiento y a un bajo coste32. Sin embargo, varios factores (es decir, efectos por lotes, selección de imprimaciones para el gen rRNA 16S y análisis de datos de secuencia) siguen siendo un obstáculo importante en el uso generalizado de esta tecnología.
Las tecnologías avanzadas de secuenciación MiSeq basadas en rRNA 16S (2x300bp)33 permiten la secuenciación de 600 nucleótidos de la bacteria 1.500 nucleótidos de 16S de rRNA, que superó el cuello de botella más temprano de lecturas de secuenciación cortas. Los imprimadores específicos para una región diferente de arnm, como V1–V2, V3–V5 o V6–V9, se pueden utilizar con imprimaciones específicas de cada región que muestren algún sesgo para la detección excesiva o inferior de taxonesparticulares 34,35. Algunos grupos prefieren la región V1-V221,que muestra un mayor sesgo para Clostridium pero la detección inferior para ciertas especies de Bacteroidetes. Por el contrario, otros grupos prefieren las regiones V4, V3–V4 y V3–V5, que demuestran la clasificación menos sesgada de taxones bacterianos15,20,36,37.
El protocolo actual utiliza imprimaciones específicas para las regiones V3-V4 del gen rRNA 16S, ya que cubre la región más larga de rRNA 16S con dos regiones hipervariables (V3 y V4) en comparación con V4 solo. Además, el amplicon específico V3-V4 permite la fusión de lecturas hacia adelante (R1) y inversa (R2), lo que conduce a una mejor resolución de la clasificación bacteriana. Aunque la región V3-V5 proporciona lecturas más largas y cubre más regiones hipervariables (V3, V4 y V5), es difícil combinar lecturas R1 y R2 debido a que no hay regiones superpuestas entre lecturas R1 y R2. Por lo tanto, varios estudios han utilizado sólo datos de lecturas R1 para la clasificación bacteriana al realizar la secuenciación metagenómica de rRNA 16S utilizando V3–V5 región14.
El almacenamiento y manejo adecuado de bioespecímenes son fundamentales para el análisis de microbiomas para evitar la degradación del ADN bacteriano o la contaminación ambiental38. El almacenamiento prolongado de bispecimenre a RT o 4 oC puede conducir al crecimiento excesivo de ciertas bacterias u hongos. Las muestras pueden ser congeladas inmediatamente o transportadas a 4 oC (durante 1-3 días), luego congeladas. Biospecimen también se puede almacenar directamente en conservantes como la solución de estabilización de ácido nucleico (por ejemplo, ARN-más tarde), 95% etanol, o un kit de almacenamiento comercial. El consenso general es que cualquiera de estos métodos de almacenamiento no causa diferencias significativas en los perfiles de comunidad bacteriana39,40. Aunque una solución con conservantes permite el almacenamiento y el transporte en RT, estas muestras no se pueden utilizar para ensayos basados en ARN, análisis de metabolitos o experimentos de trasplante fecal. Estas cuestiones se han debatido en detalle en otros lugares39,40.
Uno de los pasos críticos de este protocolo es el uso de un método basado en la batida de cuentas para la interrupción mecánica de las bacterias gram-positivas y Archaea. Un estudio anterior mostró la mayor diversidad bacteriana utilizando el método basado en la batida de perlas en comparación con otros métodos de lisis celular41. Una lisis bacteriana incompleta o contaminación durante la extracción de ADN puede introducir sesgo en los datos del microbioma intestinal42. Otro punto importante a tener en cuenta es la contaminación debida a los reactivos de laboratorio incluidos en los kits llamados kitome43,44,45. Las muestras con gran biomasa y rica diversidad bacteriana como el suelo o las heces muestran menos de estos problemas en comparación con las muestras con menor biomasa como la piel. Por lo tanto, se debe incluir un control de extracción de agua con cada extracción y procesar con otras muestras para identificar la introducción de la contaminación potencial debido a la extracción de ADN43,44,45.
En el análisis de microbiomas, la diversidad dentro de una muestra se puede medir por la diversidad alfa, una medida de la riqueza de las especies, o la diversidad beta, que estima las diferencias entre muestras/grupos. Los métodos populares para medir la diversidad incluyen UniFrac (ponderado y no ponderado) junto con técnicas estadísticas multivariadas como el análisis de coordenadas principales (PCoA) o la diferencia Brey-Curtis. Mientras que UniFrac se basa en distancias filogenéticas, brey-Curtis análisis de la diferencia utiliza la abundancia bacteriana para generar parcelas. Descripciones en profundidad sobre la diversidad de la diversidad de los lugares30,46,47. Se pueden utilizar varios métodos estadísticos para comparar las diferencias entre las comunidades microbianas entre los grupos14,48. Se recomienda utilizar valores p ajustados en lugar de valores p sin procesar para corregir para múltiples pruebas14.
Existe una variedad de software bioinformático para analizar datos de secuenciación específicos de forma independiente49. El protocolo propuesto utiliza paquetes de software de código abierto basados en R, lo que permite la elaboración de perfiles rápidos y fáciles de usar de taxones bacterianos a través de canalizaciones DADA2 basadas en R. La tabla de abundancia generada a partir de DADA2 se puede utilizar para el análisis posterior utilizando phyloseq y METAGENassist. La canalización DADA2 es ventajosa sobre QIIME porque no requiere características especiales (es decir, la instalación de máquinas virtuales o contenedores Docker), que necesitan recursos computacionales relativamente grandes y experiencia técnica especial. Especialmente para principiantes al análisis 16S, R es atractivo, ya que es gratuito y permite a los usuarios aprovechar tutoriales en línea accesibles y scripts de análisis que son fáciles de ejecutar. Es importante destacar que estas herramientas de análisis requieren recursos computacionales relativamente pequeños y se pueden ejecutar en una plataforma basada en PC, Macintosh o Linux. Además, METAGENassist puede utilizar tablas de abundancia generadas a partir de tuberías DADA2, así como archivos de matriz de observación biológica (BIOM) generados a partir de QIIME/MG-RAST para realizar análisis como PCA, análisis discriminante de menos cuadrados parciales (PLS-DA), parcelas volcánicas, t-pruebas(comparando dos grupos), ANOVA (comparando tres o más grupos), gráficas de mapas de calor, análisis forestalaleatorios aleatorios, etc. METAGENassist fue encontrado muy fácil de usar.
En resumen, este protocolo describe una simple canalización de perfiles metagenómicos de 16S rRNA, con una guía detallada sobre la recolección de muestras, la extracción de ADN, la preparación de la biblioteca metagenómica, la secuenciación en Illumina MiSeq y el análisis de datos fácil de usar utilizando libremente (es decir, DADA2, phyloseq y METAGENassist). Aunque el perfil taxonómico basado en metagenómica 16S rRNA es fiable para la caracterización de bacterias presentes en determinados bioespecímenes, la secuenciación metagenómica de escopeta puede ser un mejor enfoque para el análisis detallado de la vía metabólica y la cepa específica identificación bacteriana.
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Disclosures
A. M. recibió regalías de Mayo Clinic (pagada por Evelo Biosciences) como uno de los inventores de una tecnología que reclama el uso de Prevotella histicola para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
Acknowledgments
Los autores reconocen la financiación del NIAID/NIH (1R01AI137075-01), la Beca Carver Trust Medical Research Initiative y el Centro de Investigación en Ciencias de la Salud Ambiental de la Universidad de Iowa, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
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