Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/59980
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2,3,4
1Department of Pathology, University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine, University of Iowa

Summary

وصف هنا هو اجراء التشغيل القياسية مبسطه لتشكيل الميكروبيوم باستخدام 16s rrna metagenomic التسلسل والتحليل باستخدام الاداات المتاحة بحريه. هذا البروتوكول سوف تساعد الباحثين الذين هم جديده في مجال الميكروبيوم وكذلك تلك التي تتطلب تحديثات علي أساليب لتحقيق التنميط البكتيرية في دقه اعلي.

Abstract

يتم استعمار الأمعاء البشرية من قبل تريليونات من البكتيريا التي تدعم الوظائف الفسيولوجية مثل الأيض الغذائي ، وحصاد الطاقة ، وتنظيم الجهاز المناعي. وقد اقترح اضطراب من الميكروبيوم الأمعاء صحية للعب دور في تطوير الامراض التهابيه ، بما في ذلك التصلب المتعدد (MS). العوامل البيئية والوراثية يمكن ان تؤثر علي تكوين microbiome; ولذلك ، أصبح تحديد المجتمعات الميكروبية المرتبطة بالنمط الظاهري للمرض الخطوة الاولي نحو تحديد دور الميكروبيوم في الصحة والمرض. وقد ساعد استخدام التسلسل metagenomic 16s rrna لتنميط المجتمع البكتيرية في النهوض بالبحوث الميكروبيوم. وعلي الرغم من استخدامها علي نطاق واسع ، لا يوجد بروتوكول موحد لتحليل التنميط القائم علي التصنيف المستند إلى rRNA في 16 ثانيه. وهناك قيد آخر هو الدقة المنخفضة للتعيين التصنيفي بسبب الصعوبات التقنية مثل قراءه التسلسل الأصغر ، بالاضافه إلى استخدام المستقبل فقط (R1) يقرا في التحليل النهائي نظرا لتدني جوده القراءة (R2). هناك حاجه لطريقه مبسطه مع دقه عاليه لتوصيف التنوع البكتيري في معين الحيوية. وقد ساعدت التطورات في تسلسل التكنولوجيا مع القدرة علي تسلسل أطول يقرا بدقه عاليه للتغلب علي بعض هذه التحديات. وقد ساعدت تكنولوجيا التسلسل الحالية مع خط أنابيب التحليل metagenomic المتاحة للجمهور مثل R-القائم علي الانقسام خوارزميه دينوسينغ المسببة للانقسام-2 (DADA2) التنميط الميكروبية بدقه عاليه ، كما DADA2 يمكن تعيين تسلسل في جنس ومستويات الأنواع. وصف هنا هو دليل لأداء التنميط البكتيرية باستخدام التضخيم خطوتين من المنطقة V3-V4 من الجينات rRNA 16S ، تليها تحليل باستخدام أدوات التحليل المتاحة بحريه (اي ، DADA2 ، Phyloseq ، و METAGENassist). ويعتقد ان هذا سير العمل بسيطه وكامله سيكون بمثابه أداه ممتازة للباحثين المهتمين في أداء الدراسات التنميط الميكروبيوم.

Introduction

الميكروبات يشير إلى مجموعه من الكائنات الحية الدقيقة (البكتيريا والفيروسات ، الارشييه ، البكتيريا ، والفطريات) الذين يعيشون في بيئة معينه ، ويشير ميكروبيوم إلى الجينوم الجماعي للكائنات المجهرية المقيمة. كما البكتيريا هي واحده من الميكروبات الأكثر وفره في البشر والفئران ، وتركز هذه الدراسة فقط علي التنميط البكتيرية. واستعمرت الأمعاء البشرية من قبل تريليونات من البكتيريا ومئات من سلالات البكتيريا1. الميكروبات المعوية الطبيعية تلعب دورا حيويا في الحفاظ علي حاله صحية في المضيف عن طريق تنظيم وظائف (اي الحفاظ علي حاجز الأمعاء سليمه ، والأيض الغذائي ، والتوازن الطاقة ، وتثبيط الاستعمار من قبل الكائنات المسببة للامراض ، و تنظيم الاستجابات المناعية)2،3،4،5. تم ربط الاضطرابات التركيبية لميكروبات الأمعاء (ديسبيوسيس الأمعاء) بعدد من الامراض البشرية ، بما في ذلك اضطرابات المعدة المعوية6، السمنة7،8، السكتة الدماغية9، السرطان10، مرض السكري8,11, التهاب المفاصل الروماتويدي12, الحساسية13, والامراض المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي مثل التصلب المتعدد (MS)14,15 ومرض الزهايمر المرض (AD)8,16. لذلك ، في السنوات الاخيره ، كان هناك اهتمام متزايد في أدوات لتحديد تكوين البكتيريا في مواقع الجسم المختلفة. وينبغي ان يكون أسلوب موثوق بها خصائص مثل كونها عاليه الانتاجيه وسهله الاستخدام ، وجود القدرة علي تصنيف الجراثيم الجرثومية مع ارتفاع القرار ، ويجري منخفضه التكلفة.

التقنيات الميكروبيولوجية القائمة علي الثقافة ليست حساسة بما فيه الكفاية لتحديد وتوصيف الميكروبيوم الأمعاء المعقدة بسبب فشل العديد من بكتيريا الأمعاء تنمو في الثقافة. وقد تغلب ظهور التكنولوجيا القائمة علي التسلسل ، وخاصه التسلسل metagenomic المستندة إلى rrna 16s ، علي بعض من هذه التحديات وتحويل البحوث الميكروبيوم17. وقد ساعد المتقدمة 16S rRNA القائم علي التكنولوجيا التسلسل في إنشاء دور حاسم لميكروبيوم الأمعاء في صحة الإنسان. وقد ساعد مشروع الميكروبات البشرية ، وهو مبادرة المعاهد الوطنية للصحة18، ومشروع MetaHIT (المبادرة الاوروبيه)19 في وضع اطار أساسي للتحليل الميكروبيوم. ساعدت هذه المبادرات علي بدء دراسات متعددة لتحديد دور ميكروبيوم الأمعاء في صحة الإنسان والمرض.

وقد أظهرت عدد من المجموعات ديسبيوسيس الأمعاء في المرضي الذين يعانون من الامراض التهابيه12,14,15,20,21,22. علي الرغم من ان تستخدم علي نطاق واسع لتحديد التصنيف التصنيفي بسبب القدرة علي تعدد الإرسال والتكاليف المنخفضة ، لا توجد بروتوكولات موحده لتنميط التصنيف المستندة إلى rRNA 16S. وهناك قيد آخر هو الدقة المنخفضة للتعيين التصنيفي نظرا لصغر التسلسل يقرا (150 bp أو 250 bp) واستخدام التسلسل الامامي فقط قراءه (R1) بسبب انخفاض جوده التسلسل العكسي يقرا (R2). ومع ذلك ، ساعدت التطورات في تسلسل التكنولوجيا للتغلب علي بعض من هذه التحديات ، مثل القدرة علي تسلسل أطول يقرا باستخدام الاقتران-نهاية القراءة (علي سبيل المثال ، ايلومينا MiSeq 2x300bp).

يمكن للتكنولوجيا التسلسل الحالي تسلسل 600 bp نوعيه جيده يقرا ، والذي يسمح دمج R1 و R2 يقرا. هذه المدمجة أطول R1 و R2 يقرا السماح للتعيينات التصنيفية أفضل ، وخاصه مع الوصول المفتوحة المستندة إلى R المسببة للانقسام الانقسام خوارزميه-2 (DADA2) منصة. يستخدم DADA2 التعيينات المستندة إلى متغير تسلسل الاتساع (ASV) بدلا من التعيينات وحده التصنيف التشغيلية (OTU) استنادا إلى التشابه 97% المستخدمة من قبل QIIME23. وتؤدي مباريات ASV إلى تطابق متسلسل بالبالضبط في قاعده البيانات داخل النواة 1 – 2 ، مما يؤدي إلى التعيين في مستويات الجنس والأنواع. التالي ، فان الجمع بين القراءات الطويلة وذات النوعية الجيدة وأداات التعيين التصنيفية الأفضل (مثل DADA2) قد حول الدراسات الميكروبيوم.

المقدمة هنا هو دليل خطوه بخطوه لأداء التنميط البكتيرية باستخدام التضخيم خطوتين من المنطقة V3-V4 من rRNA 16S وتحليل البيانات باستخدام DADA2 ، Phyloseq ، وأنابيب METAGENassist. لهذه الدراسة ، يتم استخدام مستضد الكريات البيضاء البشرية (هلا) الفئة الثانية الفئران المحورة وراثيا ، وبعض هلا الفئة الثانية الاليل ترتبط مع الاستعداد لامراض المناعة الذاتية مثل MS20،24،25. ومع ذلك ، فان اهميه الجينات من الدرجة الثانية في تنظيم تكوين الجراثيم المعوية غير معروفه. هو افترضت ان ال [هلا] صنف [ايي] جزيء سياثر مجتمعه جراثيم جرثوميه ب ينتقي لجراثيم خاصه. مركب التوافق الرئيسية المدرج (mhc) الفئة الثانية الفئران الضربة القاضية (اي كو) أو الفئران التعبير عن جزيئات DQ8 الإنسان (DQ8)24,25,26 واستخدمت من أجل فهم اهميه الجزيئات هلا من الدرجة الثانية في تشكيل المجتمع الميكروبية الأمعاء. ويعتقد ان هذا العمل الكامل والمبسط مع تحليل البيانات المستندة إلى R سيكون بمثابه أداه ممتازة للباحثين المهتمين في أداء الدراسات التنميط الميكروبيوم.

جيل الفئران التي تفتقر الداخلية murine MHC فئة الجينات الثانية (AE. كو) و AE-/-. DQA1 * 0103 ، DQB1 * 0302 (هلا-DQ8) تم وصف الفئران المحورة وراثيا مع خلفيه C57BL/6J سابقا26. يتم جمع عينات من البراز من الفئران من كلا الجنسين (8 – 12 أسبوعا من العمر). وقد ولدت الفئران في السابق والحفاظ عليها في منشاه الحيوانية جامعه أيوا وفقا للصحة القومية والمبادئ التوجيهية المؤسسية. استراتيجيات التحكم في التلوث مثل الفطام من الفئران داخل مجلس الوزراء تدفق الرقائقي ، وتغيير القفازات بين سلالات مختلفه من الفئران ، والصيانة السليمة للفئران خطوات حاسمه لتحديد الملامح من ميكروبيوم الأمعاء.

ينصح بشده باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة خلال الاجراء بأكمله. يجب تضمين عناصر التحكم السلبية المناسبة عند تنفيذ عزل الحمض النووي ، PCR1 و PCR2 التضخيم ، وخطوات التسلسل. ينصح باستخدام المعقمة ، خاليه من DNase ، RNase خاليه ، واللوازم الخالية من مولد حر. وينبغي استخدام pipettor المعين للعمل الميكروبيوم ونصائح ماصه المصفاة في جميع انحاء البروتوكول. يتكون تحليل الجراثيم المجهرية من سبع خطوات: 1) جمع العينات ومعالجتها بالبراز ؛ 2) استخراج الحمض النووي ؛ 3) التضخيم الجينات rRNA 16S ؛ 4) بناء مكتبه الحمض النووي باستخدام PCR المفهرسة ؛ 5) تنظيف والتقدير الكمي لل PCR المفهرسة (مكتبه) ؛ 6) التسلسل MiSeq ؛ و 7) معالجه البيانات وتحليل التسلسل. ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي لجميع خطوات البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة علي البروتوكول من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه أيوا.

1. البراز عينه جمع والمناولة

  1. تعقيم صناديق المفرق (انظر جدول المواد، الشكل التكميلي 1) مع 70 ٪ الايثانول.
  2. أنابيب الطرد المركزي الصغيرة قبل التسمية (واحد لكل ماوس) مع عينه الهوية ومجموعه العلاج (ان وجد).
  3. وضع الفئران في صناديق المفرق معقمه والسماح لهم التبرز عاده لمده تصل إلى 1 ساعة.
  4. جمع الكريات البراز في فارغه ، قبل المسمي 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير باستخدام ملقط معقمه وإغلاق الأنبوب بشكل أمن. تعقيم الملقط بعد جمع من كل الماوس.
  5. وضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي علي كريات البراز في 80 درجه مئوية الفريزر حتى مزيد من المعالجة.
    ملاحظه: صناديق المفرق مفيده لأنها تسمح بالجمع المتزامن لعينات البراز من فئران متعددة (تصل إلى 12) في وقت واحد.

2. استخراج الحمض النووي

  1. أزاله عينات البراز (الماوس أو الإنسان) من الفريزر وذوبان الجليد في درجه حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظه: فانه من المستحسن لأذابه عينات البراز الإنسان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية حسب الحاجة لجمع 200 ملغ أو المبلغ المطلوب من عينات الأوراق المالية.
  2. استخدام 200 ملغ من مواد البداية والحمض النووي الوت إلى حجم النهائي من 50 μl.
  3. وتشمل مجموعه عزل الحمض النووي الفارغة التي يتم أضافه اي عينه البراز ولكن تتم معالجتها من خلال جميع خطوات استخراج الحمض النووي.
    ملاحظه: وقد استخدمت مجموعه محدده لعزل الحمض النووي (انظر جدول المواد) ، حيث انها تحتوي علي الكواشف محدده لأزاله المواد المثبطة مثل الخلايا الحيوية ، والمواد النباتية غير المهضومة ، ومركبات الهيمي من كريات الدم الحمراء الموجودة في البراز البشري والفار عينات.
  4. وضع أنبوب حبه في الخالط (انظر جدول المواد) وتجانس العينات ل 45 s في RT وسرعه 4.5 م/ث.
    ملاحظه: ويمكن استخدام الخالط حبه الضرب من اي شركه مصنعه. ومع ذلك ، فمن المستحسن لتوحيد الطريقة ، وتحديدا سرعه ومده التجانس ، عند استخدام الخالط الخرزة الضرب من بائع آخر.
  5. عزل الحمض النووي من عينات البراز الماوس الفردية باستخدام مجموعه العزل الحمض النووي البكتيرية بعد بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) مع تعديلاتطفيفه. قياس الحمض النووي المعزول عن طريق تحميل 1 μL من الحمض النووي علي مقياس الفلور أو علي رقاقه الكهربائي حساسية عاليه (انظر جدول المواد).
    ملاحظه: الغلة المتوقعة من الحمض النووي يمكن ان تتراوح بين 500-2500 نانوغرام عند البدء مع 200 ملغ من عينه البراز.
  6. ضبط تركيز الحمض النووي إلى 4-20 نانوغرام/μL باستخدام المخزن المؤقت الشطف. Requantify الحمض النووي (كما فعلت في الخطوة 2.5) قبل الانتقال إلى التضخيم الجينات rRNA 16S (PCR1) ، إذا لم يتم تنفيذ PCR1 في نفس اليوم.

3. التضخيم الجيني rRNA 16S (PCR1)

  1. اعداد التضخيم الجيني rRNA 16S (PCR1) في لوحه PCR بشكل جيد 96 باستخدام حجم رد فعل 25 μL.
  2. باستخدام ماصه متعددة القناات ، أضافه 12.5 μL من 2x عاليه الدقة الانزيم البلمره بما في ذلك العازلة ، بالاضافه إلى dNTPs (انظر جدول المواد): 40 ng من الحمض النووي في ما يصل إلى 10.5 μl الحجم الإجمالي (ضبط حجم الكلي مع المياه الصف PCR): 1 μl والإشعال العكسي عند تركيز 1 μM.
    ملاحظه: وفيما يلي تسلسل الإشعال:
    التمهيدي إلى الامام = 5 '-TCGTCGGCAGCGTGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGNGGCWGCAG-3 ' التمهيدي العكسي = 5 '-GTCTCGTGGCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3 '. وتشمل مجموعه فارغه من الخطوة 2.3 (التحكم في عده كاشف) في لوحه PCR.
  3. ختم لوحه PCR وأجهزه الطرد المركزي في 1,000 x ز في 20 درجه مئوية لمده 1 دقيقه في لوحه الطرد المركزي لوحات الطاولة (انظر جدول المواد) وأداء pcr في الدورية الحرارية المبرمجة ل: 95 درجه مئوية لمده 3 دقائق ؛ 25 دورات من 1) 95 درجه مئوية ل 30 s ، 2) 55 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، 3) 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه ؛ التمديد النهائي عند 72 درجه مئوية لمده 5 دقائق ؛ وعقد في 4 درجه مئوية.
    ملاحظه: علي الرغم من ان هذه الطريقة التضخيم الجينات rRNA 16S يجب ان تعمل مع أنواع مختلفه من biospecimens ، فانه ينصح لتوحيد عدد دورات التضخيم عند بدء مشروع جديد.
  4. تاكيد حجم المنتج PCR1 عن طريق تحميل 1 μL من الحمض النووي علي رقاقه الكهربائي حساسية عاليه. بدلا من ذلك ، تشغيل 5 μl من 16s rrna-تضخيم المنتج علي 1.5 ٪ هلام الاغاروز لتاكيد 550 bp من المنتج PCR1.
    ملاحظه: تنظيف من 16S rRNA تضخيم المنتج هو اختياري ويعتمد علي مجموعه العزل الحمض النووي/الطريقة المستخدمة. في حاله استخدام طريقه عزل الحمض النووي في المنزل ، يمكن تنظيف منتج PCR1 باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي الميكروبيوم وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). ان طقم عزل الحمض النووي المستخدم هنا ينتج حمضا نوويا فائق النقاء ولا يتطلب تنظيف المنتج PCR1.

4. الحمض النووي مكتبه البناء باستخدام PCR المفهرسة (PCR2)

  1. ضع الفهرس 1 والفهرس 2 التمهيدي المرمز في رف خاص (انظر جدول المواد) لمكتبات 96.
    1. ترتيب الفهرس 1 التمهيدي في الاعمده 1 – 12 والدليل 2 التمهيدي في الصفوف A – H من رف خاص.
    2. أضافه 2.5 μL من الفهرس 1 في الاعمده 1 – 12 والفهرس 2 التمهيدي في الصفوف A – H باستخدام الأنابيب متعددة القناات. ضع الغطاء الجديد (انظر جدول المواد) علي الفهرس 1 والمؤشر 2 التمهيدي المتبني واحفظه في الفريزر بدرجه حرارة 20 مئوية.
  2. باستخدام ماصه متعددة القناات ، أضافه 12.5 μL من 2x عاليه الدقة البلمره مزيج الانزيم الذي يحتوي علي العازلة ، بالاضافه إلى dNTPs (انظر جدول المواد) ؛ 5 μL من المياه الصف PCR و 2.5 μL من 16S rRNA تضخيم المنتج.
    ملاحظه: أضافه مؤشرات فريدة لكل عينه لتعدد الإرسال أكثر من 96 المكتبات في تشغيل واحد ، كما هو موضح في كيرنان وآخرون27. يستخدم هذا البروتوكول محولات من مجموعه تجاريه (علي سبيل المثال ، nextera XT مؤشر كيت) وفقا للتعليمات الشركة المصنعة المقدمة في 16 ثانيه تندرج طريقه التسلسل (علي سبيل المثال ، ايلومينا).
  3. ختم والطرد المركزي لوحه PCR المفهرسة في 1,000 x ز في 20 درجه مئوية لمده 1 دقيقه وأداء PCR في الدورية الحرارية المبرمجة ل: 95 درجه مئوية لمده 3 دقائق ؛ 8 دورات من 1) 95 درجه مئوية ل 30 s ، 2) 55 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، 3) 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه ؛ والتمديد النهائي عند 72 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  4. تاكيد حجم قاعده 630 من المنتج PCR المفهرسة عن طريق تحميل 1 μL من الحمض النووي علي رقاقه الكهربائي حساسية عاليه. بدلا من ذلك ، تشغيل 5 μl من المنتج PCR المفهرسة علي هلام 1.5 ٪ الاغاروزه لتاكيد حجم وكثافة المنتج.

5. تنظيف المفهرسة PCR (PCR2) والقياس الكمي

  1. تجمع 5 μL من PCR2 باستخدام الماصات متعددة القناات من كل بئر في صينية خزان متعدد القناات خاليه من DNase قابله للكشف ، RNase ، الحمض النووي البشري ، والبكتيريا المولدة للحرارة (انظر جدول المواد).
  2. انقل المنتج المجمع من صينية الخزان متعدد القناات إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير الفارغ والمسمي مسبقا 1.5 mL والدوامة للمزج.
  3. تنقيه المنتج PCR2 باستخدام مجموعه الخرز المغناطيسي القياسية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ختم وتخزين المتبقية 20 μL من PCR2 في نفس اللوحة في-80 درجه مئوية لمزيد من الاستخدام ، إذا لزم الأمر.
  4. اعداد الطازجة 80 ٪ الايثانول عن طريق أضافه 4 مل من الايثانول 100 ٪ إلى 1 مل من المياه الصف PCR.
  5. تتوازن الخرزة المغناطيسية إلى RT والدوامة لمده 30 ثانيه لتفريق الخرز بالتساوي.
  6. دوامه لفتره وجيزة وتدور أسفل المجمعة PCR2 العينات.
  7. أضافه 80 μL من الخرز المغناطيسي إلى ما قبل المسمي ، معقمه 1.5 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي مع 80 μL من المنتجات PCR المجمعة ، ثم دوامه وتدور لفتره وجيزة لأعاده تعليق بالتساوي الخرز المغناطيسي.
  8. احتضان محتويات RT دون إزعاج الأنابيب لمده 15 دقيقه.
  9. وضع أنبوب مع الحمض النووي والخرز المغناطيسي علي موقف المغناطيسي (انظر جدول المواد) لمده 5 دقائق.
  10. أزاله بعناية وتجاهل 150 μL من supernatant.
  11. أضافه 200 μL من طازجه أعدت 80 ٪ الايثانول دون إزعاج الخرز واحتضان لمده 30 ثانيه.
  12. أزاله بعناية ، وتجاهل كل supernatant.
  13. كرر الخطوات 5-11 – 5.12. قم بازاله وحده التخزين المتبقية بماصه P10. السماح لحبات الهواء لتجف لمده 15 دقيقه ، مع مؤشر PCR أنبوب المتبقية علي موقف المغناطيسي.
  14. أزاله من الموقف المغناطيسي. أضافه 33 μL من المخزن المؤقت التملص (المخزن المؤقت الامتصاص من مجموعه الحمض النووي غير مقبول). دوامه جيدا ، وأداء تدور سريعة لأزاله اي السائل المتبقية علي الجانب. احتضان لمده 2 دقيقه ومكان علي موقف المغناطيسي لمده 5 دقائق.
  15. نقل 30 μl من ماده طافي (منتجات PCR نظيفه) إلى ما قبل المسمي 1.5 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي.
  16. قياس التجمع المنقي عن طريق تحميل 1 μL من تجمع تنقيه علي مقياس الفلور أو رقاقه الكهربائي حساسية عاليه ، وهذا سيكون مطلوبا اثناء التسلسل. أداء MiSeq كما هو مفصل أدناه.

6. التسلسل MiSeq

  1. إنشاء ورقه عينه تحتوي علي معلومات الباركود عينه محدده لسير العمل تندرج و demultiplexing علي أداه miseq (انظر جدول المواد). تحميل هذه الورقة عينه إلى البرنامج (علي سبيل المثال ، مدير التجربة ايلومينا).
  2. تمييع المكتبات المجمعة من الخطوة 5.15 إلى 4 نانومتر.
  3. المكتبات المجمعة من خلال الجمع بين 5 μL من تجمع مكتبه 4 نانومتر مع 5 μL من الطازجة 0.2 M NaOH في 1.5 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي. دوامه لفتره وجيزة لخلط والطرد المركزي لفتره وجيزة واحتضان لمده 5 دقائق في RT المحيطة.
  4. أضافه 990 μL من الجليد الباردة التهجين العازلة (HB العازلة) وماصه بلطف لخلط. هذا سينتج مكتبه 20 م.
  5. الجمع بين 2 μL من 10 نانومتر مكتبه التحكم مع 3 μL من العازلة EBT (10 ملم تريس-HCl ، pH = 8.5 ، مع 0.1 ٪ توين 20) لتسفر عن 4 نانومتر مكتبه التحكم. أضافه 5 μL من الطازجة 0.2 N NaOH ودوامه لفتره وجيزة لخلط. احتضان لمده 5 دقائق في RT.
  6. أضافه 990 μL الجليد الباردة التهجين العازلة (HB العازلة) وماصه بلطف لخلط. سينتج عن هذا 20 م مكتبات التحكم.
    ملاحظه: يمكن تخزين مكتبات التحكم 20 pM التشويه في-20 درجه مئوية لمده 4 أسابيع. بعد 4 أسابيع ، تميل أرقام الكتلة إلى الانخفاض.
    1. الجمع بين 210 μL من مكتبه 20 م مع 40 μL من مكتبه التحكم 20 pM (التركيز النهائي = ~ 18 ٪) ، وأضافه 350 μL من HB العازلة. تحميل المكتبة في التركيز النهائي من 7 مساءا.
      ملاحظه: يجب تعديل تفاصيل الإدخال وفقا لأداء التشغيل.
  7. احتضان عينات لمده 2 دقيقه في 96 درجه مئوية. وضعت علي الجليد لمده 5 دقائق. تحميل 600 μL من تجمع النهائي في بئر المناسبة من خراطيش MiSeq.
    ملاحظه: ويمكن القيام بالقسم 6 أعلاه في منشاه نواه الجينوم/الحمض النووي.

7. معالجه البيانات وتحليل التسلسل

  1. استخدام برنامج R (الإصدار 3.5) لمعالجه البيانات DADA2 والتحليلات. بالنسبة للخطوات 7.1 – 7.4 ، استخدم برنامج الوصول المفتوح كما هو موضح في البرامج التعليمية الDADA2ه التي تم تطويرها مسبقا والموجودة في < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >.
    ملاحظه: تم إرفاق برنامج نصي R قابل للاستخدام بسهوله كملف إضافي 2، ويجب علي المستخدمين تغيير اسم ومصدر ملفات التسلسل (علي سبيل المثال ، SAMPLENAME_R1_001 و SAMPLENAME_R2_001).
  2. تصور ملفات تعريف الجودة للامام والقراءة العكسية باستخدام الأمر بلوتقواليتيبروفيلي .
  3. تقليم النوكليوديس من الامام والعكس يقرا استنادا إلى مؤامرة الجودة. يتم تحديد هذه المعلمات بواسطة المعلمة تروكلين في DADA2.
    ملاحظه: هنا ، يتم استخدام 280 كحد الطول الذي سيتم تجاهل القراءة إلى الامام ، ويتم استخدام 260 كعتبه الطول الذي سيتم تجاهل القراءة العكسية.
  4. معالجه البيانات 16S الخام كما الملفات fastq عن طريق خط أنابيب DADA2 كما هو موضح في البرنامج التعليمي علي الإنترنت (وجدت في < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >) لدمج R1 و R2 يقرا ونموذج المتغيرات تسلسل ميبليرمز (ASVs) ، والتي تستخدم بعد ذلك لتعيين تاكا مع قاعده البيانات المرجعية سيلفا23.
    ملاحظه: يتم تضمين جدول متغير تسلسل النموذج الذي تم إنشاؤه من خط أنابيب DADA2 كملف إضافي 3. ويمكن استخدام قاعده بيانات مرجعيه من Greengene أو سيلفا ، حيث لم يتم العثور علي اي اختلافات في تصنيف البكتيريا باستخدام اي من قواعد البيانات هذه.
  5. إنشاء ملف تعيين المعرفة من قبل المستخدم الذي يحتوي علي بيانات التعريف (علي سبيل المثال ، النمط الجيني ، والجنس ، والعلاج ، وما إلى ذلك) لكل عينه. تم تضمين ملف بيانات تعريف نموذج كملف إضافي 4.
  6. حساب التنوع الفا (مؤشر شانون) والتنوع بيتا باستخدام تحليل الإحداثيات الرئيسية (PCA) استنادا إلى التهم otu مخلخل باستخدام phyloseq28 كما هو موضح في البرنامج التعليمي علي الإنترنت ، وجدت في < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >.
  7. قم باجراء التحليل التالي في METAGENassist29.
    ملاحظه:     قم باجراء تحليل الوفرة التفاضلية باستخدام الاختبار الإجمالي لرتبه ويلكوكسون علي مستوي الجنس. ويتم تسليط الضوء علي خرائط الحرارة والأصناف الوفيرة بشكل مختلف باستخدام METAGENassist29، وهو خط أنابيب التحليل المتاحة للجمهور وعلي شبكه الإنترنت.
    1. قم بتحميل جدول وفره التصنيف (تنسيق CSV) وحدد العينات في العمود.
    2. قم بتحميل ملف التعيين (تنسيق CSV) وحدد العينات في صف.
    3. حدد خيارات لأزاله المتغيرات باستخدام أكثر من 50% أصفار ، واستبعاد القراءات غير المعينة وغير المحددة.
    4. حدد خيارات لتطبيع الصفوف حسب المجموع وسجل تطبيع الاعمده.
    5. جعل بركان ، PCA ، أو مؤامرة plsda بالنقر علي نفسه في العمود الأيمن وانقر فوق أزاله اسم عينات لجعل الرسم البياني.
    6. قم باجراء اختبار t(إذا كانت مجموعتان فقط) أو ANOVA (إذا كان أكبر من مجموعتين) لتصور الميزات (البكتيريا) التي تختلف بين المجموعات. انقر فوق الميزات المحددة لتصور بكتيريا معينه تختلف بين المجموعات.
    7. انقر علي الخريطة الحرارية لإنشاء المؤامرات الخاصة. يمكن اجراء تحليل إضافي ، مثل المرئيات العينة بواسطة المجموعات أو الميزات المستندة إلى اختبار/ANOVA الأعلى 25.
    8. انقر فوق عشوائية لإنشاء رسومات بيانيه تظهر الميزات التي يمكن استخدامها للتصنيف. انقر فوق علامة التبويب التباين في الأعلى لإنشاء رسومات بيانيه لأفضل الميزات التي تختلف بين المجموعات/بينها. انقر فوق تفاصيل الميزة لمشاهده قائمه بالبكتيريا التي تختلف بين المجموعات وانقر فوق كل بكتيريا لإنشاء ملخص رسومي لنفس الشيء.
    9. انقر فوق علامة التبويب Outlier في الأعلى لتصور العينات التي هي قيم متطرفة.
    10. وأخيرا ، انقر فوق تحميل وحدد اما 1) ملف مضغوط يحتوي علي جميع التحليلات التي أجريت أو 2) الميزات المطلوبة للتحميل. يجب حفظ هذا الملف كاسم فريد ستحتاج إلى إلغاء الضغط قبل الاستخدام.

ملاحظه: للاختبارات الاحصائيه التفصيلية التي أجريت خلال تحليل ميكروبيوم ، راجع اعمال تشن وآخرون و hugerth et al.14,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما mhc الطبقة الثانية جزيئات (هلا في البشر) هي اللاعبين المركزيين في الاستجابة المناعية التكيفيه وإظهار الجمعيات قويه مع الاستعداد لMS24,25,26, وكان الافتراض بان الجزيء هلا الدرجة الثانية سيؤثر علي تكوين الأمعاء الميكروبية. ولذلك ، استخدمت الفئران التي تفتقر إلى الفئة MHC الجينات (AE. KO) أو التعبير عن الإنسان DQ8 الجينات (DQ8) لفهم اهميه الجزيئات هلا من الدرجة الثانية في تشكيل المجتمع الميكروبية الأمعاء.

تم جمع عينات من البراز من AE. KO (ن = 16) و DQ8 (ن = 12) الفئران المحورة وراثيا ، تم استخراج الحمض النووي البكتيري ، وتم تضخيم المنطقة V3-V4 من الجينات rRNA 16S. وقد تم تاكيد حجم الاتساع (550 bp) من خلال تشغيل العينات علي هلام 1.5 ٪ (الشكل 2A، الممرات 1–6). تم اجراء تاكيد إضافي من 16S rRNA حجم الاتساع (550 bp) عن طريق تحميل 1 μL من المنتج PCR1 علي رقاقه الكهربائي حساسية عاليه (الشكل 2B، الممرات 1–7).

تم توليد كهربية من 16S rRNA PCR المنتج ، والتي أظهرت مناطق الذروة مع شظايا الحجم ~ 550 bp (الشكل 2C). تم إرفاق المؤشرات المزدوجة ومحولات التسلسل باستخدام PCR المفهرس (PCR2) الذي عين هويه فريدة لكل عينه وسمح بتعدد الإرسال للعديد من العينات في تشغيل تسلسل MiSeq واحد. تم اجراء تاكيد لل PCR المفهرسة من قبل الكهربائي هلام الاغاروز (الشكل 2a، الممرات 7-12) ورقاقه الكهربائي حساسية عاليه (الشكل 2a، الحارات 8–12) ، الشكل 2a]. تم تجميع جميع العينات من PCR2 ، وتنقيتها ، وتحميلها علي التسلسل الجيل القادم الذي أسفر عن الامام R1 وعكس R2 يقرا من نوعيه جيده (الشكل 3). المتوسطة ينال يقرا بعد نوعيه تصفيه وتقليم كان 88,125 (مدي من [9597-111848]).

واجري تحليل الإيكولوجيا المجتمعية باستخدام خط أنابيب التحليل DADA2 وتصور مع Phyloseq و METAGENassist لإظهار الاختلافات في تنوع الفا (الشكل 4) والتنوع بيتا (الشكل 5) ، فضلا عن الاختلافات في جنس ومستويات الأنواع بين المجموعات. DADA2 تحليل توليد جدول وفره مع فاصله مفصوله القيم في شكل csv ، والتي استخدمت لمزيد من التحليل المصب باستخدام منصة علي شبكه الإنترنت (اي ، Phyloseq و/أو METAGENassist). تم اجراء تحليلات التنوع الفا وبتا استنادا إلى الفئات المعرفة من قبل المستخدم المسرودة في ملف التعيين.

كشف تحليل التنوع شانون انخفاض إجمالي التنوع الفا لفئران الامارات المتوسطة مقارنه مع الفئران DQ8 المعدلة وراثيا (الشكل 3). وأظهرت الرسامة مع تحليل الإحداثيات الرئيسية تجمعا مكانيا متميزا بين فئران الDQ8 الوراثية والفئران المحورة جينيا (الشكل 5). واستخدم أيضا جدول وفره من DADA2 لاجراء تحليل metagenomic شامل باستخدام برنامج الوصول المفتوح Metagassist29. تم إنشاء تجميع القائمة علي خريطة الحرارة من وفره البكتيريا (مستوي جنس) (الشكل 6A) ومؤامرة مربع لبكتيريا محدده تبين الاختلافات بين مجموعتين (الشكل 6a) باستخدام خط أنابيب metagenassist.

وأظهرت تحليلات الخرائط الحرارية ان بعض البكتيريا مثل Allobacullum, Desufovibrio, وريكينيلا كانت أكثر وفره في DQ8 الفئران المحورة وراثيا. وعلي النقيض من ذلك ، كانت بيكوفييلا أكثر وفره في الفئران التابعة للرابطة (الشكل 6 ب). وترد الوفرة النسبية للبكتيريا الفردية (bilophila و rikenella) في مؤامرة مربع تمثيلي (الشكل 6b). إجمالا ، تظهر البيانات ان الفئران AE. KO تمتلك مجتمع الميكروبية متميزة مقارنه مع الفئران DQ8 المعدلة وراثيا ، مع عدم وجود بكتيريا محدده في الفئران AE. كما تشير البيانات إلى ان جزيئات MHC من الفئة الثانية تلعب دورا هاما في وفره بعض البكتيريا. وباختصار ، فان هذا البروتوكول البسيط والمفصل سيساعد الباحثين الجدد في مجال الميكروبيوم ، فضلا عن أولئك الذين يحتاجون إلى تحديثات علي طرق تحقيق الدقة التصنيفية الأعلى.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تدفق الأمعاء ميكروبيومي التسلسل. يتم عرض جميع خطوات التسلسل الميكروبيوم (جمع العينات لتحليل البيانات الميكروبيوم). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التضخيم الجيني rRNA 16S وتحليل مراقبه الجودة للمنطقة V3-V4. (ا) شكلتالصورة الكهربية للهلام التمثيلي لرمز الاتساع 16S (PCR1 ، حجم 550 bp) والمفهرسة PCR (PCR2 ، الحجم = 630 bp) من الفئران AE (الممرات 1 – 3 و 7 – 9) والفئران DQ8 المحورة وراثيا (الممرات 4 – 6 و 10 – 12). (ب) صوره الهلام التمثيلي لرمز الاتساع 16S (PCR1, size = 550 bp) والمفهرسة PCR (PCR2, حجم = 630 bp) من الفئران AE (الممرات 1 – 3 و 8 – 10) والفئران DQ8 المحورة وراثيا (الممرات 4 – 7 و 11 – 12) حلها الكهربائي. (ج) وأظهرت الكهربائية التمثيلية للاتساع 16S (PCR1) منطقه الذروة التي تحتوي علي شظايا التي كانت الحجم ~ 550 bp. (د) وأظهرت الكهربائية التمثيلية من PCR المفهرسة (PCR2) منطقه الذروة تتالف من شظايا الحجم ~ 630 bp. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ملف تعريف الجودة للقراءة إلى الامام (R1 ، اعلي) لعينين التمثيلية والمقابلة القراءة العكسية (R2 ، أسفل) لنفس العينات. تم اجراء التحليل باستخدام خط أنابيب DADA2 ، حيث يظهر المحور س طول القراءة (0-300 القواعد) والمحور ص يظهر جوده القراءة. يمثل الخط الأخضر متوسط نقاط الجودة ، في حين يمثل الخط البرتقالي الربع السنوي لتوزيع نقاط الجودة في كل موضع أساسي. القراءة الاماميه (R1) أظهرت دائما جوده أفضل من القراءة العكسية (R2). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تدابير التنوع الفا (التنوع شانون) من الفئران AE. KO و DQ8 الفئران المحورة وراثيا. تمثل كل نقطه التنوع α (التنوع شانون) في عينه من ماوس واحد. وكان التنوع شانون عموما اقل بالنسبة لفئران AE. KO مقارنه مع الفئران DQ8 المعدلة وراثيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التنسيق مع مخطط جزئي لتحليل البعد القائم علي المربعات الصغرى. يظهر المؤامرة فصل واضحة بين [ا. كو] فيران و [هلا-DQ8] فيران [ا]. كل نقطه تمثل تكوين البكتيرية داخل عينه ، والكسوف المنقط تشير إلى 80 ٪ فواصل الثقة. تم إنشاء المؤامرات الثابتة والمتنقلة-DA باستخدام مياجينينمساعده. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الفئران ae التي تظهر مجتمع الميكروبية متميزة مقارنه مع الفئران DQ8 المعدلة وراثيا ، مع عدم وجود بكتيريا محدده في الفئران AE . (ا) الخريطة الحرارية المقترنة بالتكتلات الهرمية الأجلوميراتيفيه التي تبين الوفرة النسبية للبكتيريا (مستوي الجنس). (ب) مؤامرة مربعه تبين وجود وفره نسبيه طبيعيه من اثنين من البكتيريا التمثيلية (Bilophila و rikenella) في الفئران المحورة وراثيا و DQ8. تم إنشاء كلا المؤامرتين باستخدام METAGENassist. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 1
الشكل التكميلي 1: صوره تمثيليه لمربع التقسيم لجمع عينات البراز من فئران متعددة في كل مره. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary File 2
الملف التكميلي 2: DADA2 R-السيناريو لتوليد وفره الجدول من تسلسل الخام. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Supplementary Figure 3
الملف التكميلي 3: ممثل الجدول وفره جنس (تنسيق CSV). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Supplementary Figure 4
الملف التكميلي 4: ملف التعيين التمثيلي (تنسيق CSV). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الموصوف بسيط ، مع خطوات سهله لتنفيذ التنميط الميكروبيوم باستخدام 16s rrna metagenomic التسلسل من عدد كبير من الحيوية التي تهم. الجيل التالي من التسلسل قد حولت دراسات الإيكولوجيا الميكروبية ، وخاصه في نماذج الامراض البشرية وما قبل السريرية31،32. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قدرتها علي تحليل التراكيب الميكروبية المعقدة بنجاح (الميكروبات القابلة للثقافات وغير القابلة للثقافات) في القدرة البيولوجية المعطية علي مستوي إنتاجيه عاليه وبتكلفه منخفضه32. ومع ذلك ، فان العديد من العوامل (اي الآثار الدفعي ، واختيار الإشعال لجين rRNA 16S ، وتحليل البيانات تسلسل) لا تزال عقبه كبيره في استخدام هذه التكنولوجيا علي نطاق واسع.

المتقدمة 16S rRNA القائم علي تكنولوجيا التسلسل MiSeq (2x300bp)33 السماح التسلسل من ~ 600 النيوتيوديس من 1,500 النيوكليوتيد-لونغ الجينات Rrna 16s من البكتيريا ، التي تغلبت علي اختناق في وقت سابق من التسلسل القصير يقرا. الإشعال محدده لمنطقه مختلفه من rrna مثل V1-V2 ، V3-V5 ، أو V6-V9 يمكن استخدامها مع كل الإشعال الخاصة بالمنطقة التي تظهر بعض التحيز لأكثر من أو تحت الكشف عن تاكلا معينه34،35. بعض المجموعات تفضل المنطقة V1-V221، والذي يظهر زيادة التحيز ل كلوستريديوم ولكن الكشف عن الأنواع البكتيرية معينه. في المقابل ، المجموعات الأخرى تفضل المناطق v4 ، v3-v4 ، و v3-V5 ، والتي تبرهن علي التصنيف الأقل تحيزا من تاكا البكتيريا15،20،36،37.

يستخدم هذا البروتوكول الإشعال الخاصة للمناطق V3-V4 من الجينات rRNA 16S ، كما انه يغطي المنطقة أطول من rRNA 16S مع منطقتين فرط المتغير (V3 و V4) مقارنه مع V4 وحدها. بالاضافه إلى ذلك ، يسمح V3-V4 السعه المحددة بدمج كل من الامام (R1) والعكس (R2) يقرا ، مما يؤدي إلى دقه أفضل لتصنيف البكتيريا. علي الرغم من ان المنطقة V3-V5 توفر قراءه أطول ويغطي المزيد من المناطق المتغيرة (V3 ، V4 ، و V5) ، فانه من الصعب دمج R1 و R2 يقرا بسبب لا/القليل تداخل المناطق بين R1 و R2 يقرا. لذلك ، وقد استخدمت عددا من الدراسات البيانات فقط من القراءة R1 لتصنيف البكتيريا عند أداء 16S rRNA metagenomic التسلسل باستخدام V3-V5 المنطقة14.

وتعد التخزين والمناولة السليمة للحيوية الحيوية أمرا حاسما لتحليل الميكروبيوم لمنع تحلل الحمض النووي البكتيري أو التلوث البيئي38. يمكن ان يؤدي التخزين طويل الأمد لأيمن الحيوي في RT أو 4 درجات مئوية إلى فرط نمو بعض البكتيريا أو الفطريات. يمكن تجميد العينات علي الفور أو نقلها عند درجه حرارة 4 مئوية (لمده 1 – 3 أيام) ، ثم تجميدها. ويمكن أيضا تخزين الحمض الحيوي في المواد الحافظة مثل محلول تثبيت الأحماض النووية (علي سبيل المثال ، في وقت لاحق) ، 95 ٪ الايثانول ، أو مجموعه تخزين تجاريه. وتوافق الآراء العام هو ان أيا من أساليب التخزين هذه لا يسبب اختلافات كبيره في الملامح المجتمعية البكتيرية39،40. علي الرغم من ان الحل مع المواد الحافظة يسمح للتخزين والنقل في RT ، وهذه العينات لا يمكن استخدامها لاختبارات المستندة إلى RNA ، تحليلات المستقلب ، أو تجارب زرع البراز. وقد نوقشت هذه المسائل بالتفصيل في مكان آخر39،40.

واحده من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هو استخدام طريقه الضرب القائم علي النبض للاضطراب الميكانيكي للبكتيريا ايجابيه الجرام والارشييه. أظهرت دراسة سابقه ان التنوع البكتيري الأعلى باستخدام طريقه الضرب القائم علي الخرزة مقارنه بالطرق الأخرى للخلية تحلل41. ويمكن لتحلل البكتيرية غير مكتملة أو التلوث خلال استخراج الحمض النووي إدخال التحيز في البيانات الميكروبيوم الأمعاء42. نقطه هامه أخرى للنظر هو التلوث بسبب الكواشف المختبرية المدرجة في مجموعات تسمي kitome43،44،45. العينات مع الكتلة الحيوية الكبيرة وتنوع البكتيريا الغنية مثل التربة أو البراز تظهر اقل من هذه المشاكل مقارنه مع العينات مع انخفاض الكتلة الحيوية مثل الجلد. ولذلك ، ينبغي ادراج السيطرة علي استخراج المياه مع كل استخراج ومعالجتها مع عينات أخرى لتحديد إدخال التلوث المحتملة بسبب استخراج الحمض النووي43،44،45.

في تحليل الميكروبيوم ، يمكن قياس التنوع داخل عينه من قبل التنوع الفا ، وهو مقياس لثراء الأنواع ، أو التنوع بيتا ، الذي يقدر الاختلافات بين العينات/المجموعات. وتشمل الأساليب الشائعة لقياس α-التنوع UniFrac (المرجحة وغير المرجحة) إلى جانب التقنيات الاحصائيه متعددة المتغيرات مثل تحليل الإحداثيات الرئيسي (PCoA) أو Brey-كورتيس التشابه. في حين ان UniFrac يستند إلى المسافات الوراثية, Brey-كورتيس تحليل التشابه يستخدم وفره البكتيرية لتوليد المؤامرات. في عمق أوصاف حول α-و [بتا-] تنوع تناقشت [اي] في مكان آخر30,46,47. ويمكن استخدام عدد من الطرق الاحصائيه لمقارنه الاختلافات في المجتمعات الميكروبية بين المجموعات14،48. وينصح باستخدام قيم p المعدلة بدلا من قيم p الخام لتصحيح الاختبارات المتعددة14.

هناك مجموعه متنوعة من برامج المعلوماتية الحيوية لتحليل بيانات التسلسل المستهدفة بشكل مستقل49. يستخدم البروتوكول المقترح حزم البرمجيات المفتوحة المصدر التي تستند إلى R ، والتي تتيح التنميط السهل والسريع للتصنيفات البكتيرية من خلال خطوط الأنابيب DADA2 القائمة علي R. ويمكن استخدام جدول وفره المتولدة من DADA2 للتحليل المصب باستخدام phyloseq و METAGENassist. DADA2 خط الأنابيب هو مفيد علي QIIME لأنه لا يتطلب ميزات خاصه (اي تركيب آلات الظاهرية أو حاويات Docker) ، والتي تحتاج إلى موارد حسابيه كبيره نسبيا والخبرة التقنية الخاصة. خاصه بالنسبة للمبتدئين إلى تحليل 16S ، R جذابة ، كما انها حره ويسمح للمستخدمين للاستفادة من الدروس المتاحة علي الإنترنت وتحليل البرامج النصية التي هي سهله التنفيذ. الأهم من ذلك ، تتطلب أدوات التحليل هذه موارد حسابيه صغيره نسبيا ويمكن تشغيلها علي كمبيوتر شخصي أو ماكنتوش أو نظام أساسي يستند إلى Linux. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن لشركه METAGENassist استخدام جداول الوفرة التي تم إنشاؤها من أنابيب DADA2 وكذلك مصفوفة المراقبة البيولوجية (BIOM) التي تم إنشاؤها من QIIME/MG-RAST لاجراء تحليل مثل الانيسول الخماسي الكلور ، جزئيا الأقل المربعات تحليل التمايز (PLS-DA) ، المؤامرات بركان ، t-الاختبارات (مقارنه مجموعتين) ، ANOVA (مقارنه بين ثلاث مجموعات أو أكثر) ، والمؤامرات خريطة الحرارة ، وتحليل الغابات عشوائية ، الخ. تم العثور علي METAGENassist تكون سهله الاستخدام جدا.

وباختصار ، يصف هذا البروتوكول بسيطه 16S rRNA metagenomic التنميط خط أنابيب ، مع دليل مفصل علي جمع العينات ، استخراج الحمض النووي ، واعداد مكتبه metagenomic ، والتسلسل علي المسك ، وتحليل البيانات سهله الاستعمال باستخدام بحريه منصات المتاحة (اي ، DADA2 ، phyloseq ، ومياجينينمساعده). علي الرغم من ان التنميط التصنيفي القائم علي التصنيف الحيوي 16S rRNA هو موثوق لتوصيف البكتيريا الموجودة في biospecimens خاصه ، قد يكون التسلسل metagenomic بندقية نهج أفضل لتحليل المسار الأيضي مفصله وسلاله محدده تحديد البكتيريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تلقي ا. م. إتاوات من Mayo Clinic (المدفوعة من قبل Evelo العلوم الاحيائيه) باعتبارها واحده من المخترعين للتكنولوجيا التي تطالب باستخدام التكنولوجيا اللوجستية لعلاج امراض المناعة الذاتية.

Acknowledgments

ويعترف المؤلفون بالتمويل من المعاهد القومية للصحة (1R01AI137075-01) ، ومنحه مبادرة كارفر ترست للبحوث الطبية ، ومركز بحوث علوم الصحة البيئية في جامعه أيوا ، نيهس/المعاهد القومية للصحة (P30 ES005605).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Natural Microcentriguge Tube USA, Scientific 1615-5500 Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G 3M, MN, US 7100038651 Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter, IN, USA A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENT Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chip Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement Caps Illumina, Inc., CA, USA 15026762 New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA 12855-100 DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) Kapa Biosystem, MA, USA KK2602 PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes Lewis Bins, WI, US ND03080 Fecal collection
Magnetic stand New England BioLabs, MA, USA S1509S For PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4346906 PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4311971 PCR Plate Sealer
Microfuge 20 Centrifuge Beckman Coulter, IN, USA B30154 Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 Illumina, Inc., CA, USA MS-102-3003 For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina, Inc., CA, USA FC-131-1001 16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays ASI, FL,USA RS71-1 For Pooling of PCR2 Product
Plate Cetrifuge Thermo Fisher Scientific, CA, USA 75004393 For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX Control Illumina, Inc., CA, USA FC-110-3001 For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification Kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA A29789 For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 Homogenizer Omni International, GA, USA 19-001 Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA Q32854 DNA quantification
TruSeq Index Plate Fixture Illumina, Inc., CA, USA FC-130-1005 For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large) Lewis Bins, WI, US DV-2280 Fecal collection
Vertical Dividers (small) Lewis Bins, WI, US DV-1780 Fecal collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).

Tags

علم الاحياء الإصدار 152 استخراج الحمض النووي البراز اعداد المكتبة المنطقة المتغيرة 16S 16S rRNA التسلسل الجيل القادم الجراثيم الأمعاء
تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N.… More

Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing. J. Vis. Exp. (152), e59980, doi:10.3791/59980 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter