Summary
Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.
Abstract
Der menschliche Darm wird von Billionen von Bakterien besiedelt, die physiologische Funktionen wie Lebensmittelstoffwechsel, Energiegewinnung und Regulierung des Immunsystems unterstützen. Die Störung des gesunden Darmmikrobioms wurde vorgeschlagen, eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose (MS), zu spielen. Umwelt- und genetische Faktoren können die Zusammensetzung des Mikrobioms beeinflussen; Daher ist die Identifizierung mikrobieller Gemeinschaften, die mit einem Perphänotyp der Krankheit verbunden sind, der erste Schritt zur Definition der Rolle des Mikrobioms bei Gesundheit und Krankheit. Die Verwendung von 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung zur Profilierung bakterieller Gemeinschaft hat dazu beigetragen, die Mikrobiomforschung voranzubringen. Trotz seiner breiten Verwendung gibt es kein einheitliches Protokoll für die 16S rRNA-basierte taxonomische Profiling-Analyse. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Auflösung der taxonomischen Zuweisung aufgrund technischer Schwierigkeiten wie kleinere Sequenzierungslesevorgänge sowie die Verwendung von nur Vorwärts-Lesevorgängen (R1) in der Endanalyse aufgrund geringer Qualität von Reverse-Lesevorgängen (R2). Es bedarf einer vereinfachten Methode mit hoher Auflösung, um die bakterielle Vielfalt in einem bestimmten Bioprobe zu charakterisieren. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie mit der Fähigkeit, längere Lesevorgänge mit hoher Auflösung zu sequenzieren, haben dazu beigetragen, einige dieser Herausforderungen zu meistern. Die gegenwärtige Sequenzierungstechnologie in Kombination mit einer öffentlich verfügbaren metagenomischen Analysepipeline wie R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) hat dazu beigetragen, die mikrobielle Profilierung bei hoher Auflösung voranzutreiben, da DADA2 Sequenzen an der Gattung zuweisen kann. und Artenniveaus. Hier wird eine Anleitung zur Durchführung der bakteriellen Profilierung mit zweistufiger Amplifikation der V3-V4-Region des 16S rRNA-Gens beschrieben, gefolgt von einer Analyse mit frei verfügbaren Analysewerkzeugen (d. h. DADA2, Phyloseq und METAGENassist). Es wird angenommen, dass dieser einfache und vollständige Workflow als ausgezeichnetes Werkzeug für Forscher dienen wird, die an der Durchführung von Mikrobiom-Profiling-Studien interessiert sind.
Introduction
Mikrobiota bezieht sich auf eine Sammlung von Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Archaeen, Bakteriophagen und Pilze), die in einer bestimmten Umgebung leben, und das Mikrobiom bezieht sich auf das kollektive Genom von ansässigen Mikroorganismen. Da Bakterien eine der häufigsten Mikroben bei Menschen und Mäusen sind, konzentriert sich diese Studie nur auf bakterielle Profilierung. Der menschliche Darm wird von Billionen von Bakterien und Hunderten von Bakterienstämmen1besiedelt. Die normale Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines gesunden Zustands im Wirt durch die Regulierung von Funktionen (d. h. die Aufrechterhaltung einer intakten Darmbarriere, Nahrungsstoffwechsel, Energiehomöostase, Hemmung der Besiedlung durch pathogene Organismen, und Regulierung der Immunantworten)2,3,4,5. Kompositole Störungen der Darmmikrobiota (Darmdysbiose) wurden mit einer Reihe von menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Magen-Darm-Erkrankungen6, Adipositas7,8, Schlaganfall9, Krebs10, Diabetes8,11, rheumatoide Arthritis12, Allergien13, und Erkrankungen des Zentralnervensystems wie Multiple Sklerose (MS)14,15 und Alzheimer Krankheit (AD)8,16. Daher ist in den letzten Jahren das Interesse an Werkzeugen zur Identifizierung der bakterienzusammensetzung an verschiedenen Körperstandorten gestiegen. Eine zuverlässige Methode sollte Eigenschaften wie hohe Durchsatz und einfach zu bedienen, mit der Fähigkeit, bakterielle Mikrobiota mit hoher Auflösung zu klassifizieren, und kostengünstig haben.
Kulturbasierte mikrobiologische Techniken sind nicht empfindlich genug, um das komplexe Darmmikrobiom zu identifizieren und zu charakterisieren, da mehrere Darmbakterien in der Kultur nicht wachsen. Das Aufkommen der Sequenzierungs-basierten Technologie, insbesondere der 16S rRNA-basierten metagenomischen Sequenzierung, hat einige dieser Herausforderungen überwunden und die Mikrobiomforschung transformiert17. Die fortschrittliche 16S rRNA-basierte Sequenzierungstechnologie hat dazu beigetragen, eine entscheidende Rolle für das Darmmikrobiom in der menschlichen Gesundheit zu etablieren. Das Human Microbiome Project, eine Initiative 18 der Nationalen Institute für Gesundheit18, und das MetaHIT-Projekt (eine europäische Initiative)19 haben beide dazu beigetragen, einen grundlegenden Rahmen für die Mikrobiomanalyse zu schaffen. Diese Initiativen halfen, mehrere Studien in Gang zu leiten, um die Rolle des Darmmikrobioms bei der menschlichen Gesundheit und Krankheit zu bestimmen.
Eine Reihe von Gruppen haben Darmdysbiose bei Patienten mit entzündlichen Erkrankungen gezeigt12,14,15,20,21,22. Obwohl es aufgrund der Fähigkeit zu Multiplex und niedrigen Kosten weit verbreitet für taxonomisches Profiling verwendet wird, gibt es keine einheitlichen Protokolle für 16S rRNA-basierte silyische Profilerstellung. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Auflösung der taxonomischen Zuweisung aufgrund kleinerer Sequenzierungslesevorgänge (150 bp oder 250 bp) und die Verwendung von nur Vorwärtssequenzierungslese (R1) aufgrund von Reverse-Sequenzierungslesevorgängen (R2) geringer Qualität. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie haben jedoch dazu beigetragen, einige dieser Herausforderungen zu überwinden, wie z. B. die Möglichkeit, längere Lesevorgänge mit Paired-End-Lesevorgängen zu sequenzieren (z. B. Illumina MiSeq 2x300bp).
Die derzeitige Sequenzierungstechnologie kann 600 bp gute Lesequalität sequenzieren, was das Zusammenführen von R1- und R2-Lesevorgängen ermöglicht. Diese zusammengeführten längeren R1- und R2-Lesevorgänge ermöglichen bessere taxonomische Zuweisungen, insbesondere mit offener R-basierter Stritten-Amplicon-Denoising-Algorithmus-2-Plattform (DADA2). DADA2 verwendet Amplicon-Sequenzvarianten (ASV)-basierte Zuweisungen anstelle von Operativen taxonomischen Einheiten (OTU)-Zuweisungen basierend auf 97% Ähnlichkeit, die von QIIME23verwendet wird. ASV-Matches ergeben eine exakte Sequenzübereinstimmung in der Datenbank innerhalb von 1:2-Nukleotiden, was zu einer Zuordnung auf Gattungs- und Artenebene führt. Daher haben die Kombination aus längeren, qualitativ hochwertigen Paired-End-Lesevorgängen und besseren taxonomischen Zuweisungswerkzeugen (wie DADA2) Mikrobiomstudien transformiert.
Hier ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Durchführung von bakteriellen Profilierung mit zweistufiger Verstärkung der V3-V4-Region von 16S rRNA und Datenanalyse mit DADA2, Phyloseq und METAGENassist Pipelines. Für diese Studie werden transgene Mäuse des humanen Leukozytenantigens (HLA) der Klasse II verwendet, da bestimmte ÖsA-Klasse-II-Allele mit einer Veranlagung für Autoimmunerkrankungen wie MS20,24,25verbunden sind. Die Bedeutung von HLA-Genen der Klasse II bei der Regulierung der Zusammensetzung von Darmmikrobiota ist jedoch unbekannt. Es wird vermutet, dass das Molekül der HLA-Klasse II die mikrobielle Darmgemeinschaft beeinflussen wird, indem es für bestimmte Bakterien ausgewählt wird. Major Histocompatibility Complex (MHC) Class II Knockout Mäuse (AE.KO) oder Mäuse, die menschliche HLA-DQ8 Moleküle (HLA-DQ8)24,25,26 verwendeten, um die Bedeutung von HLA-Klasse-II-Molekülen in die Mikrobengemeinschaft des Darms zu formen. Es wird angenommen, dass dieser vollständige und vereinfachte Workflow mit R-basierter Datenanalyse als ausgezeichnetes Werkzeug für Forscher dienen wird, die an der Durchführung von Mikrobiom-Profiling-Studien interessiert sind.
Die Generation von Mäusen ohne endogene murine MHC-Genen der Klasse II (AE.KO) und AE-/-. HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) transgene Mäuse mit einem C57BL/6J Hintergrund wurden zuvor26beschrieben. Fäkalproben werden von Mäusen beiderlei Geschlechts (8-12 Wochen alt) entnommen. Mäuse wurden zuvor in der Tieranlage der University of Iowa gemäß den NIH- und institutionellen Richtlinien gezüchtet und gepflegt. Kontaminationskontrollstrategien wie das Entwöhnen der Mäuse in einem laminaren Strömungsschrank, der Wechsel von Handschuhen zwischen verschiedenen Mäusestämmen und die ordnungsgemäße Pflege von Mäusen sind entscheidende Schritte für die Profilierung von Darmmikrobiom.
Die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) wird während des gesamten Eingriffs dringend empfohlen. Bei der Durchführung von DNA-Isolation, PCR1- und PCR2-Verstärkung und Sequenzierungsschritten sollten geeignete negative Kontrollen einbezogen werden. Die Verwendung von sterilen, DNase-freien, RNase-freien und pyrogenfreien Vorräten wird empfohlen. Ausgewiesener Pipettiertor für Mikrobiomarbeit und gefilterte Pipettenspitzen sollten im gesamten Protokoll verwendet werden. Die Mikrobiota-Analyse besteht aus sieben Schritten: 1) Sammlung und Verarbeitung von Fäkalienproben; 2) Extraktion von DNA; 3) 16S rRNA Genverstärkung; 4) DNA-Bibliotheksbau mit indizierter PCR; 5) Bereinigung und Quantifizierung der indizierten PCR (Bibliothek); 6) MiSeq-Sequenzierung; und 7) Datenverarbeitung und Sequenzanalyse. Ein schematisches Diagramm aller Protokollschritte ist in Abbildung 1dargestellt.
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Protocol
Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Iowa genehmigt.
1. Fäkale Probensammlung und -handhabung
- Sterilisieren Sie die Trennkästen (siehe Materialtabelle, Zusatzabbildung 1) mit 70% Ethanol.
- Voretikette Mikrozentrifugenröhrchen (eine pro Maus) mit der Proben-ID und der Behandlungsgruppe (falls zutreffend).
- Legen Sie die Mäuse in sterilisierte Trennkästen und lassen Sie sie normal für bis zu 1 h defecate.
- Sammeln Sie die Fäkalienpellets in einem leeren, vorbeschrifteten 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit sterilen Zangen und schließen Sie das Rohr sicher. Sterilisieren Sie die Zange nach dem Sammeln von jeder Maus.
- Legen Sie das Mikrozentrifugenrohr mit Fäkalienpellets bis zur Weiterverarbeitung in einen -80 °C-Gefrierschrank.
HINWEIS: Die Trennkästen sind von Vorteil, da sie die gleichzeitige Entnahme von Fäkalienproben von mehreren Mäusen (bis zu 12) gleichzeitig ermöglichen.
2. Dna-Extraktion
- Entfernen Sie die Fäkalienproben (Maus oder Mensch) aus dem Gefrierschrank und tauen Sie bei Raumtemperatur (RT).
HINWEIS: Es ist ratsam, menschliche Stuhlproben über Nacht bei 4 °C aufzutauen, wenn dies erforderlich ist, um 200 mg oder die erforderliche Menge aus Lagerproben zu sammeln. - Verwenden Sie 200 mg Ausgangsstoffe und elute DNA zu einem Endvolumen von 50 l.
- Fügen Sie ein DNA-Isolationskit leer ein, in dem keine Fäkalienprobe hinzugefügt wird, sondern durch alle DNA-Extraktionsschritte verarbeitet wird.
HINWEIS: Es wurde ein spezielles DNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle)verwendet, da es spezifische Reagenzien enthält, um hemmende Materialien wie Biofeststoffe, unverdautes Pflanzenmaterial und Hämverbindungen aus lysierten roten Blutkörperchen im menschlichen und Mausstuhl zu entfernen. Proben. - Legen Sie das Perlenrohr in einen Homogenisator (siehe Materialtabelle) und homogenisieren Sie die Proben für 45 s bei RT und einer Geschwindigkeit von 4,5 m/s.
HINWEIS: Es können Perlenschlagenhomogenisator von jedem Hersteller verwendet werden. Es wird jedoch empfohlen, die Methode, insbesondere die Geschwindigkeit und Dauer der Homogenisierung, zu standardisieren, wenn Sie den Adad-beating Homogenisator eines anderen Anbieters verwenden. - Isolieren Sie DNA aus einzelnen Mausfäkalienproben mit einem bakteriellen DNA-Isolationskit nach dem Herstellerprotokoll (siehe Tabelle der Materialien) mit geringfügigen Modifikationen. Quantifizieren Sie die isolierte DNA, indem Sie 1 l der DNA auf ein Fluorimeter oder auf den hochempfindlichen Elektrophoresechip laden (siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Die erwartete Ausbeute an DNA kann zwischen 500 und 2.500 ng liegen, wenn sie mit 200 mg der Fäkalienprobe beginnt. - Stellen Sie die DNA-Konzentration mithilfe des Elutionspuffers auf 4–20 ng/L ein. Requantifizieren Sie die DNA (wie in Schritt 2.5) vor dem Fortfahren zur 16S rRNA Genverstärkung (PCR1), wenn PCR1 nicht am selben Tag durchgeführt wird.
3. 16S rRNA Genverstärkung (PCR1)
- Richten Sie die 16S rRNA Genverstärkung (PCR1) in einer 96-Well-PCR-Platte mit einem Reaktionsvolumen von 25 l ein.
- Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette zusätzlich zu den dNTPs (siehe Tabelle der Materialien) 12,5 l des 2x High-Fidelity-Polymerase-Enzymmixes inklusive Puffer hinzu (siehe Tabelle der Materialien):40 ng DNA in bis zu 10,5 l Gesamtvolumen (anpassen sie das Gesamtvolumen mit PCR-Wasser): 1 l (jeweils) vorwärts und Reverse Primer bei einer Konzentration von 1 M.
HINWEIS: Die Sequenzen der Primer sind wie folgt:
Vorwärtsgrundierung = 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' Reverse Primer = 5'-GTCTTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTCTCTAATC C-3'. Fügen Sie einen Kit-Rohling aus Schritt 2.3 (Kit-Reagenz-Steuerung) in die PCR-Platte ein. - PCR-Platte und Zentrifuge bei 1.000 x g bei 20 °C für 1 min in einer Tischplattenzentrifuge versiegeln (siehe Materialtabelle) und PCR in einem thermocycler durchführen, der für: 95 °C für 3 min programmiert ist; 25 Zyklen von 1) 95 °C für 30 s, 2) 55 °C für 30 s, 3) 72 °C für 30 s; Endverlängerung bei 72 °C für 5 min; und halten Sie bei 4 °C.
HINWEIS: Obwohl diese 16S rRNA Genverstärkungsmethode mit verschiedenen Arten von Biospecimenn funktionieren sollte, wird empfohlen, die Anzahl der Amplifikationszyklen zu standardisieren, wenn ein neues Projekt gestartet wird. - Bestätigen Sie die Größe des PCR1-Produkts, indem Sie 1 l der DNA auf einen hochempfindlichen Elektrophorese-Chip laden. Alternativ können Sie 5 l 16S rRNA-verstärktes Produkt auf einem 1,5%igen Agaro-Gel ausführen, um 550 bp des PCR1-Produkts zu bestätigen.
HINWEIS: Die Reinigung des 16S rRNA-verstärkten Produkts ist optional und hängt vom verwendeten DNA-Isolationskit/-Verfahren ab. Bei Verwendung einer internen DNA-Isolationsmethode kann das PCR1-Produkt mit einem Mikrobiom-DNA-Reinigungskit gemäß dem Herstellerprotokoll gereinigt werden (siehe Tabelle der Materialien). Das hier verwendete DNA-Isolationskit liefert eine ultrareine DNA und erfordert keine Reinigung des PCR1-Produkts.
4. DNA-Bibliotheksbau mit indizierter PCR (PCR2)
-
Platzieren Sie die Barcode-Primer Index 1 und Index 2 in einem speziellen Rack (siehe Materialtabelle) für 96 Bibliotheken.
- Ordnen Sie Index 1 Primer in den Spalten 1–12 und Index 2 in den Zeilen A–H des speziellen Racks an.
- Fügen Sie in den Spalten 1–12 2,5 l Index 1 und Index 2 in den Zeilen A–H mithilfe von Mehrkanalpipetten hinzu. Platzieren Sie die neue Kappe (siehe Materialtabelle) auf Index 1 und Index 2 Adopter Primer und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank von -20 °C.
- Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette zusätzlich zu den dNTPs 12,5 l 2x Hochtreue-Polymerase-Enzym-Mix hinzu, der einen Puffer enthält(siehe Tabelle der Materialien); 5 l PCR-Wasser und 2,5 l 16S rRNA-verstärktes Produkt.
HINWEIS: Fügen Sie jedem Beispiel eindeutige Indizes für das Multiplexing von mehr als 96 Bibliotheken in einem einzigen Durchlauf hinzu, wie in Kiernan et al.27beschrieben. Das vorliegende Protokoll verwendet Adapter aus einem kommerziellen Kit (z. B. Nextera XT Index Kit) gemäß der Anweisung des Herstellers in der 16S-Metagenomics-Sequenzierungsmethode (z. B. Illumina). - Versiegeln und zentrifugieren Sie die indizierte PCR-Platte bei 1.000 x g bei 20 °C für 1 min und führen Sie PCR in einem thermo cycler aus, der für: 95 °C für 3 min programmiert ist; 8 Zyklen von 1) 95 °C für 30 s, 2) 55 °C für 30 s, 3) 72 °C für 30 s; und Endverlängerung bei 72 °C für 5 min.
- Bestätigen Sie die 630-Basisgröße des indizierten PCR-Produkts, indem Sie 1 L DNA auf einen hochempfindlichen Elektrophorese-Chip laden. Alternativ können Sie 5 l indiziertes PCR-Produkt auf einem 1,5%-Agaro-Gel ausführen, um die Größe und Intensität des Produkts zu bestätigen.
5. Bereinigung der indizierten PCR (PCR2) und Quantifizierung
- Pool 5 l PCR2-Amplicon mit Mehrkanalpipetten aus jedem Bohrplatz in ein Mehrkanal-Reservoir-Tray frei von nachweisbaren DNase, RNase, menschlicher DNA und pyrogenen Bakterien (siehe Tabelle der Materialien).
- Übertragen Sie das gepoolte Produkt aus dem Mehrkanal-Reservoir-Tray in ein leeres, vorbeschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und Wirbel zum Mischen.
- Reinigen Sie PCR2-Produkt mit Standard-Magnetperlen-Kit(siehe Tabelle der Materialien) nach der Anweisung des Herstellers. Versiegeln und lagern Sie die restlichen 20 l PCR2 bei Bedarf bei -80 °C in derselben Platte.
- Bereiten Sie frisches 80% Ethanol vor, indem Sie 4 ml 100% Ethanol zu 1 ml PCR-Wasser hinzufügen.
- Equilibrate die magnetische Perle zu RT und Wirbel für 30 s, um die Perlen gleichmäßig zu dispergieren.
- Kurz wirbeln und drehen Sie die gepoolten PCR2-Ampliconproben herunter.
- Fügen Sie 80 l magnetische Perlen in ein vorbeschriftetes, steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 80 l gepoolten PCR-Produkten, dann Wirbel und drehen Sie sich kurz, um die magnetischen Perlen gleichmäßig wieder aufzuhängen.
- Inkubieren Sie den Inhalt bei RT, ohne die Rohre 15 min zu stören.
- Legen Sie die Röhre mit der DNA und magnetischen Perlen auf einem magnetischen Ständer(siehe Tabelle der Materialien) für 5 min.
- Entfernen und entsorgen Sie 150 L des Überstandes vorsichtig.
- Fügen Sie 200 l frisch zubereitetes 80% Ethanol hinzu, ohne die Perlen zu stören und 30 s zu brüten.
- Entfernen Sie vorsichtig, und entsorgen Sie alle Überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.11–5.12. Entfernen Sie das restliche Volumen mit einer P10 Pipette. Lassen Sie die Perlen 15 min lufttrocknen, wobei das Index-PCR-Rohr auf dem magnetischen Ständer verbleibt.
- Aus dem magnetischen Ständer entfernen. Fügen Sie 33 l Elutionspuffer hinzu (Elutionspuffer des DNA-Kits ist akzeptabel). Vortex gut, und führen Sie eine schnelle Drehung, um alle verbleibenden Flüssigkeit auf der Seite zu entfernen. 2 min inkubieren und 5 min auf den Magnetischen Ständer stellen.
- Übertragen Sie 30 l des Überstandes (saubere PCR-Produkte) auf ein vorbeschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Quantifizieren Sie den gereinigten Pool, indem Sie 1 l des gereinigten Beckens auf einen Fluorimeter- oder hochempfindlichen Elektrophoresechip laden, da dies bei der Sequenzierung erforderlich ist. Führen Sie MiSeq wie unten beschrieben aus.
6. MiSeq-Sequenzierung
- Erstellen Sie ein Beispielblatt mit beispielspezifischen Barcodeinformationen für den Metagenomik-Workflow und die Entmultiplexing auf dem MiSeq-Instrument(siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie dieses Beispielblatt in die Software hoch (z. B. Illumina Experiment Manager).
- Verdünnen Sie die gepoolten Bibliotheken von Schritt 5.15 auf 4 nM.
- Denaturierte Bibliotheken, indem 5 l des 4 nM Bibliothekspools mit 5 l frisch zubereiteten 0,2 M NaOH in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr kombiniert werden. Wirbel kurz mischen, kurz zentrifugieren und 5 min bei Ambient RT inkubieren.
- Fügen Sie 990 L eiskalten Hybridisierungspuffer (HB-Puffer) und Pipette sanft zu mischen. Dies ergibt eine 20 pM-Bibliothek.
- Kombinieren Sie 2 l der 10 nM-Steuerbibliothek mit 3 l EBT-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8,5, mit 0,1% Tween 20), um eine 4 nM-Steuerbibliothek zu erhalten. Fügen Sie 5 l frisch zubereitete 0,2 N NaOH und Wirbel kurz zu mischen. 5 min bei RT inkubieren.
-
Fügen Sie 990 L Eiskalt-Hybridisierungspuffer (HB-Puffer) und Pipette sanft zu mischen. Dadurch ergeben sich 20 pM-Steuerelementbibliotheken.
HINWEIS: Denaturierte 20 pM-Steuerbibliotheken können bei -20 °C bis zu 4 Wochen gespeichert werden. Nach 4 Wochen nehmen die Clusterzahlen tendenziell ab.- Kombinieren Sie 210 l der 20 pM-Bibliothek mit 40 l der 20 pM-Steuerbibliothek (Endkonzentration = 18 %), und fügen Sie 350 L HB-Puffer hinzu. Laden Sie die Bibliothek bei einer endletzten Konzentration von 7 pM.
HINWEIS: Eingabedetails sollten je Laufleistung angepasst werden.
- Kombinieren Sie 210 l der 20 pM-Bibliothek mit 40 l der 20 pM-Steuerbibliothek (Endkonzentration = 18 %), und fügen Sie 350 L HB-Puffer hinzu. Laden Sie die Bibliothek bei einer endletzten Konzentration von 7 pM.
- Proben für 2 min bei 96 °C inkubieren. 5 min auf Eis legen. Laden Sie 600 l des Endbeckens in den entsprechenden Brunnen der MiSeq-Patronen.
HINWEIS: Abschnitt 6 oben kann in einer genomischen/DNA-Kernanlage durchgeführt werden.
7. Datenverarbeitung und Sequenzanalyse
- Verwenden Sie die R-Software (Version 3.5) für die DADA2-Datenverarbeitung und -Analyse. Verwenden Sie für die Schritte 7.1–7.4 die Open-Access-Software, wie sie im zuvor entwickelten DADA2-Online-Tutorial unter
HINWEIS: Ein leicht verwendbares R-Skript wurde als Zusatzdatei 2angehängt, und Benutzer müssen den Namen und die Quelle von Sequenzierungsdateien ändern (z. B. SAMPLENAME_R1_001.fastq und SAMPLENAME_R2_001.fastq). - Visualisieren Sie die Qualitätsprofile der Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge mit dem Befehl plotQualityProfile.
- Nukleotide von vorwärts und rückwärts lesen basierend auf der Qualitätsdiagramm. Diese Parameter werden durch den Parameter truncLen in DADA2 angegeben.
HINWEIS: Hier wird 280 als Längenschwellenwert verwendet, für den die Vorwärtslesevorgänge verworfen werden, und 260 wird als Längenschwellenwert verwendet, für den die umgekehrten Lesevorgänge verworfen würden. - Verarbeiten Sie die 16S-Rohdaten als Fastq-Dateien der DADA2-Pipeline, wie im Online-Tutorial beschrieben (gefunden unter
HINWEIS: Eine aus der DADA2-Pipeline generierte Beispiel-Amplicon-Sequenz-Variantentabelle ist als Zusatzdatei 3enthalten. Es kann entweder eine Greengene- oder Silva-Referenzdatenbank verwendet werden, da mit einer dieser Datenbanken keine Unterschiede in der bakteriellen Klassifizierung gefunden wurden. - Generieren Sie eine benutzerdefinierte Zuordnungsdatei, die die Metadaten (d. h. Genotyp, Geschlecht, Behandlung usw.) für jedes Beispiel enthält. Eine Beispielmetadatendatei wurde als Ergänzungsdatei 4enthalten.
- Berechnen Sie alpha diversity (Shannon index) und beta diversity using principal coordinates analysis (PCA) based on the rarefied OTU counts using Phyloseq28 as outlined in the online tutorial, found at
- Führen Sie die folgende Analyse in METAGENassist29durch.
HINWEIS: Führen Sie die Differential-Überflussanalyse mit dem Wilcoxon-Rangsummentest auf Gattungsebene durch. Heatmaps und differenziell reichlich Taxa werden mit METAGENassist29, einer öffentlich zugänglichen und webbasierten Analysepipeline, hervorgehoben.- Laden Sie die taxonomische Häufigkeitstabelle (CSV-Format) hoch, und wählen Sie Samples in der Spalteaus.
- Laden Sie die Zuordnungsdatei (CSV-Format) hoch, und wählen Sie Samples in einer Zeileaus.
- Wählen Sie Optionen aus, um Variablen mit mehr als 50 % Nullen zu entfernen und nicht zugewiesene und nicht zugeordnete Lesevorgänge auszuschließen.
- Wählen Sie Optionen zum Normalisieren von Zeilen nach Summe und Protokollieren von Normalisierungsspalten aus.
- Erstellen Sie ein Volcano-, PCA- oder PLSDA-Diagramm, indem Sie in der linken Spalte auf dasselbe klicken und auf Samplesname entfernen klicken, um das Diagramm zu erstellen.
- Führen Sie einen t-Test(wenn nur zwei Gruppen) oder ANOVA (wenn größer als zwei Gruppen) durch, um die Features (Bakterien) zu visualisieren, die sich zwischen Den Gruppen unterscheiden. Klicken Sie auf Ausgewählte Features, um bestimmte Bakterien zu visualisieren, die sich von Gruppen zu Gruppen unterscheiden.
- Klicken Sie auf Dendrogram oder Heat Map, um entsprechende Diagramme zu erstellen. Zusätzliche Analysen, z. B. Beispielvisualisierung nach Gruppen oder t-test/ANOVA-basierte Top 25-Features, können durchgeführt werden.
- Klicken Sie auf RandomForest, um Diagramme mit Features zu erstellen, die für die Klassifizierung verwendet werden können. Klicken Sie oben auf die Registerkarte Varianz, um Diagramme für die obersten Features zu erstellen, die sich zwischen/zwischen Gruppen unterscheiden. Klicken Sie auf Feature-Details, um eine Liste der Bakterien anzuzeigen, die sich zwischen Den Gruppen unterscheiden, und klicken Sie auf jedes Bakterium, um eine grafische Zusammenfassung desselben zu erstellen.
- Klicken Sie oben auf die Registerkarte Ausreißer, um Beispiele zu visualisieren, die Ausreißer sind.
- Klicken Sie schließlich auf Herunterladen und wählen Sie entweder 1) eine ZIP-Datei mit allen durchgeführten Analysen oder 2) die gewünschten Funktionen zum Herunterladen aus. Diese Datei sollte als eindeutiger Name gespeichert werden und muss vor der Verwendung entpackt werden.
HINWEIS: Detaillierte statistische Tests, die während der Mikrobiomanalyse durchgeführt wurden, finden Sie in den Werken von Chen et al. und Hugerth et al.14,30.
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Representative Results
Da MHC-Klasse-II-Moleküle (HLA beim Menschen) zentrale Akteure in der adaptiven Immunantwort sind und starke Assoziationen mit einer Veranlagung zu MS24,25,26aufweisen, wurde vermutet, dass das Molekül der HLA-Klasse II würde die mikrobielle Zusammensetzung des Darms beeinflussen. Daher wurden Mäuse, denen das Gen der MHC-Klasse II (AE.KO) oder das exmittierte menschliche HLA-DQ8-Gen (HLA-DQ8) fehlten, verwendet, um die Bedeutung von HLA-Klasse-II-Molekülen für die Gestaltung der mikrobiellen Darmgemeinschaft zu verstehen.
Fäkalproben wurden von transgenen AE.KO (n = 16) und HLA-DQ8 (n = 12) transgenen Mäusen entnommen, bakterielle DNA extrahiert und die V3-V4-Region des 16S rRNA-Gens verstärkt. Die Amplicongröße (550 bp) wurde durch ausführen der Proben auf einem 1,5% Agarose-Gel bestätigt (Abbildung 2A, Bahnen 1–6). Eine weitere Bestätigung der 16S rRNA Amplicon Größe (550 bp) wurde durchgeführt, indem 1 l des PCR1-Produkts auf einen hochempfindlichen Elektrophorese-Chip geladen wurde (Abbildung 2B, Bahnen 1–7).
Ein Elektropherogramm wurde aus dem 16S rRNA PCR-Produkt erzeugt, das Spitzenregionen mit Fragmenten von 550 bp zeigte (Abbildung 2C). Duale Indizes und Sequenzierungsadapter wurden mit indizierter PCR (PCR2) angefügt, die jedem Beispiel eine eindeutige Identität zugewiesen und das Multiplexing vieler Samples in einem einzelnen MiSeq-Sequenzierungslauf ermöglichten. Die Bestätigung der indizierten PCR erfolgte durch Agarose-Gel-Elektrophorese (Abbildung 2A, Bahnen 7–12) und einen hochempfindlichen Elektrophorese-Chip (Abbildung 2B, Bahnen 8–12), Abbildung 2D]. Alle Samples von PCR2 wurden gepoolt, gereinigt und auf einen Sequenzer der nächsten Generation geladen, der Vorwärts-R1- und Reverse-R2-Lesevorgänge von guter Qualität lieferte (Abbildung 3). Der Median der lesenach Qualitätsfilterung und -beschneidung lag bei 88.125 (Bereich 9.597–111.848).
Die Gemeinschaftliche Ökologieanalyse wurde mit hilfe der DADA2-Analysepipeline durchgeführt und mit Phyloseq und METAGENassist visualisiert, um Unterschiede in der Alpha-Vielfalt (Abbildung 4) und der Beta-Vielfalt (Abbildung 5) sowie Unterschiede an der Gattungen und Artenniveaus zwischen Gruppen. Die DADA2-Analyse erzeugte eine Abundance-Tabelle mit durch Kommas getrennten Werten im csv-Format, die für weitere Downstream-Analysen mit einer webbasierten Plattform (z.B. Phyloseq und/oder METAGENassist) verwendet wurde. Die Alpha- und Beta-Diversity-Analysen wurden auf der Grundlage benutzerdefinierter Kategorien durchgeführt, die in einer Zuordnungsdatei aufgeführt sind.
Die Shannon-Diversitätsanalyse ergab eine insgesamt geringere Alpha-Diversität von AE.KO-Mäusen im Vergleich zu transgenen HLA-DQ8-Mäusen(Abbildung 3). Die Ordination mit Hauptkoordinaten-Analysen zeigte eine deutliche räumliche Clusterbildung zwischen AE.KO-Mäusen und TRANSgenen HLA-DQ8-Mäusen (Abbildung 5). Eine Fülle Tabelle von DADA2 wurde auch verwendet, um eine umfassende metagenomische Analyse mit Open-Access-Software METAGENassist29durchzuführen. Wärmekartenbasierte Clusterbildung von Bakteriellen (Gattungsebene) (Abbildung 6A) und ein Kastendiagramm für bestimmte Bakterien, das die Unterschiede zwischen zwei Gruppen zeigt (Abbildung 6B), wurden unter Verwendung einer METAGENassist-Pipeline erzeugt.
Heatmap-Analyse zeigte, dass bestimmte Bakterien wie Allobacullum, Desufovibrio und Rikenella häufiger bei transgenen HLA-DQ8-Mäusen vorhanden waren. Im Gegensatz dazu war Biolophila bei AE.KO-Mäusen häufiger vorhanden (Abbildung 6B). Relative Überfluss an einzelnen Bakterien (Bilophila und Rikenella) werden in einem repräsentativen Kastendiagramm gezeigt (Abbildung 6B). Insgesamt zeigen die Daten, dass AE.KO-Mäuse eine ausgeprägte mikrobielle Gemeinschaft im Vergleich zu HLA-DQ8 transgene Mäuse besitzen, mit einem Fehlen spezifischer Bakterien bei AE.KO-Mäusen. Die Daten deuten auch darauf hin, dass MHC-Klasse-II-Moleküle eine wichtige Rolle in der Fülle bestimmter Bakterien spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses einfache und detaillierte Protokoll Forschern helfen wird, die neu im Mikrobiombereich sind, sowie denjenigen, die Aktualisierungen der Methoden zur Erreichung einer höheren taxonomischen Auflösung benötigen.
Abbildung 1: Flussdiagramm der Darmmikrobiomsequenzierung. Alle Schritte der Mikrobiomsequenzierung (Probensammlung bis Mikrobiomdatenanalyse) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: 16S rRNA-Genverstärkung und Qualitätskontrolle der V3-V4-Region. (A) Repräsentatives Agarose-Gel-Elektrophorese-Bild der transgenen 16S-Amplikon (PCR1, Größe 550 bp) und der indizierten PCR (PCR2, Größe = 630 bp) von AE.KO-Mäusen (Lanes 1–3 und 7–9) und HLA-DQ8 transgenic Mäusen (Lanes 4–6 und 10–12). (B) Repräsentatives Gelbild der transgenen 16S-Amplicon (PCR1, Größe = 550 bp) und der indizierten PCR (PCR2, Größe = 630 bp) von AE.KO-Mäusen (Lanes 1–3 und 8–10) und HLA-DQ8 transgene Mäuse (Lanes 4–7 und 11–12), die durch Elektrophorese gelöst werden. (C) Repräsentatives Elektropherogramm des 16S-Amplicons (PCR1) zeigte einen Spitzenbereich mit Fragmenten in der Größe von 550 bp. (D) Repräsentatives Elektropherogramm der indizierten PCR (PCR2) zeigte einen Spitzenbereich, der aus Fragmenten mit der Größe von 630 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Qualitätsprofil von Vorwärtslesevorgängen (R1, oben) für zwei repräsentative Stichproben und entsprechenden Reverse-Reads (R2, unten) für dieselben Stichproben. Die Analyse wurde mit einer DADA2-Pipeline durchgeführt, in der die x-Achse die Leselänge (0–300 Basen) und die y-Achse die Qualität der Lesevorgänge anzeigt. Die grüne Linie stellt die mittlere Qualitätsbewertung dar, während die orange Linie Quartile der Qualitätsbewertungsverteilung an jeder Basisposition darstellt. Vorwärtslesevorgänge (R1) zeigten immer eine bessere Qualität als Reverse Reads (R2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Alpha-Diversitätsmaßnahmen (Shannon-Vielfalt) von AE.KO-Mäusen und transgenen HLA-DQ8-Mäusen. Jeder Punkt steht für die Vielfalt (Shannon-Vielfalt) in einem Beispiel aus einer einzigen Maus. Die Shannon-Diversität war bei AE.KO-Mäusen insgesamt geringer als bei transgenen HLA-DQ8-Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ordination mit teilweisem, auf kleinstem Quadraten basierenden Dimensionsanalysediagramm. Die Handlung zeigt eine klare Trennung zwischen AE.KO-Mäusen und TRANSgenen HLA-DQ8-Mäusen. Jeder Punkt stellt die bakterielle Zusammensetzung innerhalb einer Probe dar, und gepunktete Sonnenfinsternisse zeigen 80% Konfidenzintervalle an. Die PLS-DA-Plots wurden mit METAGENassist generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: AE.KO-Mäuse mit ausgeprägter mikrobieller Gemeinschaft im Vergleich zu transgenen HLA-DQ8-Mäusen, wobei bei AE.KO-Mäusen keine spezifischen Bakterien enthalten sind. (A) Wärmekarte kombiniert mit agglomerativen hierarchischen Clustern, die die relative Häufigkeit von Bakterien (Gattungsniveau) zeigen. (B) Kastendiagramm, das eine normalisierte relative Häufigkeit von zwei repräsentativen Bakterien (Bilophila und Rikenella) bei transgenen AE.KO- und HLA-DQ8-Mäusen zeigt. Beide Parzellen wurden mit METAGENassist generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentatives Bild des Trennkastens für die Entnahme von Fäkalienproben von mehreren Mäusen gleichzeitig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 2: DADA2 R-Skript zum Generieren von Abundance-Tabellen aus Rohsequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 3: Repräsentative Gattung Sabundance-Tabelle (CSV-Format). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 4: Repräsentative Zuordnungsdatei (CSV-Format). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das beschriebene Protokoll ist einfach, mit einfach zu befolgenden Schritten, um Mikrobiom-Profiling mit 16S rRNA metagenomische Sequenzierung aus einer großen Anzahl von Biospecimenn von Interesse durchzuführen. Die Sequenzierung der nächsten Generation hat mikrobielle Ökologiestudien transformiert, insbesondere in den Modellen für menschliche und präklinische Krankheiten31,32. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, komplexe mikrobielle Zusammensetzungen (kultierbare und nicht kultierbare Mikroben) in einem gegebenen Biospecimen bei hohem Durchsatz und kostengünstig32erfolgreich zu analysieren. Mehrere Faktoren (z. B. Batch-Effekte, Auswahl von Primern für das 16S-rRNA-Gen und Sequenzdatenanalyse) bleiben jedoch ein großes Hindernis für den weit verbreiteten Einsatz dieser Technologie.
Fortschrittliche 16S rRNA-basierte MiSeq-Sequenzierungstechnologien (2x300bp)33 ermöglichen die Sequenzierung von 600 Nukleotiden aus dem 1.500 Nukleotid-langen 16S-rRNA-Gen von Bakterien, die den früheren Engpass der kurzen Sequenzierungslesevorgänge überwanden. Primer, die für eine andere rRNA-Region spezifisch sind, wie V1–V2, V3–V5 oder V6–V9, können mit jedem regionsspezifischen Primer verwendet werden, die eine gewisse Verzerrung für über- oder unterdetektionierte bestimmte Taxa34,35zeigen. Einige Gruppen bevorzugen die V1-V2-Region21, die eine erhöhte Voreingenommenheit für Clostridium zeigt, aber Unterdetektion für bestimmte Bacteroidetes-Arten. Im Gegensatz dazu bevorzugen andere Gruppen die Regionen V4, V3–V4 und V3–V5, die die am wenigsten verzerrte Klassifizierung von bakteriellen Taxa15,20,36,37aufweisen.
Das vorliegende Protokoll verwendet Primer, die für V3-V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens spezifisch sind, da es die längere Region von 16S rRNA mit zwei hypervariablen Regionen (V3 und V4) im Vergleich zu V4 allein abdeckt. Darüber hinaus ermöglicht V3-V4-spezifisches Amplikon das Zusammenführen von Vorwärts- (R1) und Reverse(R2)-Lesevorgängen, was zu einer besseren Auflösung der bakteriellen Klassifizierung führt. Obwohl die V3-V5-Region längere Lesevorgänge bietet und mehr hypervariable Bereiche abdeckt (V3, V4 und V5), ist es schwierig, R1- und R2-Lesevorgänge zusammenzuführen, da sich keine/wenig überlappende Bereiche zwischen R1- und R2-Lesevorgängen befinden. Daher haben eine Reihe von Studien nur Daten aus R1-Lesevorgängen für die bakterielle Klassifizierung verwendet, wenn 16S rRNA metagenomische Sequenzierung mit V3-V5-Region14durchgeführt wurde.
Die richtige Lagerung und Handhabung von Bioproben ist für die Mikrobiomanalyse von entscheidender Bedeutung, um den Abbau bakterieller DNA oder Umweltkontamination zu verhindern38. Die langfristige Lagerung von Bioproben bei RT oder 4 °C kann zu einem Überwuchern bestimmter Bakterien oder Pilze führen. Proben können entweder sofort eingefroren oder bei 4 °C (für 1–3 Tage) transportiert und dann eingefroren werden. Biospecimen kann auch direkt in Konservierungsstoffen wie Nukleinsäurestabilisierungslösung (z.B. RNA-später), 95% Ethanol oder einem kommerziellen Speicherset gelagert werden. Der allgemeine Konsens ist, dass eine dieser Speichermethoden keine signifikanten Unterschiede in den bakteriellen Gemeinschaftsprofilen39,40verursacht. Obwohl eine Lösung mit Konservierungsstoffen die Lagerung und den Transport bei RT ermöglicht, können diese Proben nicht für RNA-basierte Assays, Metabolitenanalysen oder Fäkaltransplantationsexperimente verwendet werden. Diese Fragen wurden an anderer Stelle ausführlich erörtert39,40.
Einer der entscheidenden Schritte in diesem Protokoll ist die Verwendung einer Perlenschlag-basierten Methode zur mechanischen Störung von grampositiven Bakterien und Archaeen. Eine frühere Studie zeigte die höchste bakterielle Vielfalt mit der Perlenschlag-basierten Methode im Vergleich zu anderen Methoden der Zelllyse41. Eine unvollständige bakterielle Lyse oder Kontamination während der DNA-Extraktion kann Zuneigung in Darmmikrobiom-Daten einführen42. Ein weiterer wichtiger Punkt zu berücksichtigen ist Kontamination aufgrund von Laborreagenzien in Kits enthalten genannt die Kitome43,44,45. Proben mit großer Biomasse und einer reichen bakteriellen Vielfalt wie Boden oder Kot zeigen weniger dieser Probleme als Proben mit geringerer Biomasse wie der Haut. Daher sollte bei jeder Extraktion eine Wasserentnahmekontrolle enthalten sein, die mit anderen Proben verarbeitet wird, um die Einführung einer potenziellen Kontamination aufgrund der DNA-Extraktion43,44,45zu identifizieren.
In der Mikrobiomanalyse kann die Diversität innerhalb einer Stichprobe anhand der Alpha-Vielfalt, eines Maßes für den Artenreichtum, oder der Beta-Vielfalt gemessen werden, die Unterschiede zwischen Proben/Gruppen schätzt. Beliebte Methoden zur Messung der A-Diversität sind UniFrac (gewichtet und ungewichtet) gekoppelt mit multivariaten statistischen Techniken wie Principal Coordinate Analysis (PCoA) oder Brey-Curtis-Unähnlichkeit. Während UniFrac auf phylogenetischen Entfernungen basiert, nutzt Brey-Curtis Unähnlichkeitsanalyse bakterielle Fülle für die Erzeugung von Plots. Ausführliche Beschreibungen über die Vielfalt von A- und B-Diversity iare an anderer Stelle diskutiert30,46,47. Eine Reihe statistischer Methoden kann verwendet werden, um Unterschiede in mikrobiellen Gemeinschaften zwischen den Gruppen14,48zu vergleichen. Es wird empfohlen, angepasste p-Werte anstelle von rohen p-Werten zu verwenden, um für mehrere Tests14zu korrigieren.
Es gibt eine Vielzahl von Bioinformatik-Software, um gezielte Sequenzierungsdaten unabhängig zu analysieren49. Das vorgeschlagene Protokoll verwendet R-basierte Open-Source-Softwarepakete, die eine benutzerfreundliche und schnelle Profilierung von bakteriellen Taxa durch R-basierte DADA2-Pipelines ermöglichen. Die aus DADA2 erzeugte Überflusstabelle kann für die nachgelagerte Analyse mit phyloseq und METAGENassist verwendet werden. DADA2-Pipeline ist vorteilhaft gegenüber QIIME, da sie keine speziellen Funktionen (d. h. die Installation virtueller Maschinen oder Docker-Container) erfordert, die relativ große Rechenressourcen und spezielles technisches Know-how benötigen. Speziell für Anfänger der 16S-Analyse ist R ansprechend, da es kostenlos ist und es Benutzern ermöglicht, zugängliche Online-Tutorials und Analyseskripte zu nutzen, die einfach auszuführen sind. Wichtig ist, dass diese Analysetools relativ kleine Rechenressourcen erfordern und auf einer PC-, Macintosh- oder Linux-basierten Plattform ausgeführt werden können. Darüber hinaus kann METAGENassist über Flusstabellen aus DADA2-Pipelines sowie bioM-Dateien (BioM) verwenden, die aus QIIME/MG-RAST generiert werden, um Analysen wie PCA, partielle kleinste Diskriminatanalysen (PLS-DA) durchzuführen. Vulkanplots, t-Tests(Vergleich von zwei Gruppen), ANOVA (Vergleich von drei oder mehr Gruppen), Heatmap-Plots, zufällige Waldanalyse usw. METAGENassist wurde als sehr benutzerfreundlich befunden.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine einfache 16S rRNA metagenomische Profiling-Pipeline mit einer detaillierten Anleitung zur Probenentnahme, DNA-Extraktion, metagenomischen Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung auf Illumina MiSeq und benutzerfreundlicher Datenanalyse mit frei verfügbaren Plattformen (z. B. DADA2, phyloseq und METAGENassist). Obwohl 16S rRNA metagenomische taxonomische Profilierung zuverlässig für die Charakterisierung von Bakterien ist, die in bestimmten Bioproben vorhanden sind, kann die metagenomische Sequenzierung von Schrotflinten ein besserer Ansatz für eine detaillierte Metabolpfadanalyse und bakterielle Identifizierung.
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Disclosures
A. M. erhielt Lizenzgebühren von der Mayo Clinic (bezahlt von Evelo Biosciences) als einer der Erfinder einer Technologie, die die Verwendung von Prevotella histicola zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen beansprucht.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die Finanzierung durch das NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust Medical Research Initiative Grant und das University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al.
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
