Summary
ここでは、自由に利用可能なツールを使用して16S rRNAメタゲノムシーケンシングおよび分析を使用したマイクロバイオームプロファイリングの簡略化された標準的な操作手順を説明します。このプロトコルは、マイクロバイオーム分野に新しい研究者だけでなく、より高い解像度で細菌プロファイリングを達成するための方法の更新を必要とする研究者を支援します。
Abstract
人間の腸は、食物代謝、エネルギー収穫、免疫系の調節などの生理学的機能をサポートする細菌の兆によって植民地化されています。健康な腸内微生物叢の摂動は、多発性硬化症(MS)を含む炎症性疾患の発症に役割を果たすることが示唆されている。環境および遺伝的要因は、マイクロバイオームの組成に影響を与えることができます。したがって、疾患表現型と関連する微生物群の同定は、健康と疾患における微生物叢の役割を定義するための第一歩となっている。細菌コミュニティのプロファイリングのための16S rRNAメタゲノムシーケンシングの使用は、マイクロバイオーム研究の進めに役立ちました。広い使用にもかかわらず、16S rRNAベースの分類プロファイリング分析のための均一なプロトコルはありません。もう 1 つの制限は、シーケンス読み取りの小ささなどの技術的な問題による分類割り当ての低解像度と、リバース (R2) 読み取りの品質が低いため、最終分析でのフォワード (R1) 読み取りのみの使用です。所定の生体試料中の細菌多様性を特徴付ける高解像度の方法が必要である。高解像度でより長い読み取りをシーケンスする機能を備えたシーケンシング技術の進歩は、これらの課題のいくつかを克服するのに役立ちました。現在のシーケンシング技術と、Rベースの分裂アンプリコンデノイズアルゴリズム-2(DADA2)などの一般に利用可能なメタゲノム解析パイプラインを組み合わせることで、DADA2は属でシーケンスを割り当てることができるため、高解像度で微生物プロファイリングを進めるのに役立っています。と種のレベル。ここでは、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域の2段階増幅を用いて細菌プロファイリングを行うためのガイドであり、その後、自由に利用可能な分析ツール(すなわち、DADA2、Phyloseq、およびMETAGENassist)を用いた分析を行う。このシンプルで完全なワークフローは、マイクロバイオームプロファイリング研究を行うことに興味を持つ研究者のための優れたツールとして役立つと考えられています。
Introduction
微生物叢は、特定の環境に生息する微生物(細菌、ウイルス、考古学、細菌、真菌)の集合体を指し、微生物叢は常在微生物の集合ゲノムを指す。細菌はヒトとマウスで最も豊富な微生物の一つであり、この研究は細菌プロファイリングのみに焦点を当てています。人間の腸は何兆もの細菌と何百もの細菌株1によって植民地化される。正常な腸内微生物叢は、機能を調節することによって宿主の健康な状態を維持する上で重要な役割を果たしている(すなわち、無傷の腸バリアの維持、食物代謝、エネルギー恒常性、病原性生物による植民地化の阻害、および免疫応答の調節)2,3,4,5.腸内微生物叢の組成摂動(腸ジビオシス)は、胃腸障害6、肥満7、8、脳卒中9、癌10を含む多くのヒト疾患にリンクされている。糖尿病8,11,関節リウマチ12,アレルギー13,多発性硬化症(MS)14,15およびアルツハイマー病などの中枢神経系関連疾患病気 (AD)8,16.そこで、近年、異なる身体部位で細菌組成を同定するツールへの関心が高まっている。信頼性の高い方法は、高スループットと使いやすい、高分解能で細菌微生物叢を分類する能力を有し、低コストであることなどの特性を有する必要があります。
培養に基づく微生物学的手法は、培養中に成長するいくつかの腸内細菌の不全に起因する複雑な腸内微生物叢を同定し、特徴付けるのに十分な感受性を持たない。シーケンシングベースの技術、特に16S rRNAベースのメタゲノムシーケンシングの出現は、これらの課題のいくつかを克服し、マイクロバイオーム研究17を変換しました。高度な16S rRNAベースのシーケンシング技術は、ヒトの健康における腸内微生物叢の重要な役割を確立するのに役立ちました。ヒューマン・マイクロバイオーム・プロジェクト、国立衛生研究所イニシアティブ18、MetaHITプロジェクト(欧州イニシアティブ)19は、いずれもマイクロバイオーム分析の基本的な枠組みの確立に貢献しています。これらのイニシアチブは、ヒトの健康と病気における腸内微生物叢の役割を決定するために、複数の研究を開始するのに役立ちました。
多くのグループは、炎症性疾患12、14、15、20、21、22の患者において腸ジスビオシスを示している。多重化および低コストの能力のために分類プロファイリングのために広く使用されているにもかかわらず、16S rRNAベースの分類プロファイリングのための統一されたプロトコルはありません。もう 1 つの制限は、シーケンス読み取り(150 bp または 250 bp)が小さく、低品質の逆シーケンス読み取り (R2) による前方シーケンス読み取り (R1) のみの使用による分類割り当ての低解像度です。しかし、シーケンシング技術の進歩は、ペアエンドの読み取り(例えば、Illumina MiSeq 2x300bp)を使用して長い読み取りをシーケンスする機能など、これらの課題のいくつかを克服するのに役立ちました。
現在のシーケンシング技術は、R1とR2の読み取りをマージすることができ、600 bpの良質の読み取りをシーケンスすることができます。これらのマージされた長いR1とR2の読み取りは、特にオープンアクセスのRベースのディバイシスアンプリソンデノイズアルゴリズム-2(DADA2)プラットフォームで、より良い分類割り当てを可能にします。DADA2は、QIIME23で利用される97%の類似性に基づいて、操作分類単位(OTU)割り当ての代わりにアンプリコン配列バリアント(ASV)ベースの割り当てを利用します。ASVの一致は、1~2ヌクレオチド内のデータベース内の完全な配列一致をもたらし、属および種レベルでの割り当てにつながる。したがって、より長く、良質のペアエンド読み取りとより良い分類割り当てツール(DADA2など)の組み合わせは、マイクロバイオーム研究を変革しました。
ここでは、16S rRNAのV3-V4領域の2段階増幅とDADA2、Phyloseq、METAGENassistパイプラインを使用したデータ解析を使用して細菌プロファイリングを実行するためのステップバイステップガイドを提供します。本研究では、ヒト白血病抗原(HLA)クラスIIトランスジェニックマウスが用いられるが、特定のHLAクラスII対照体がMS20、24、25などの自己免疫疾患の素因と連結される。しかしながら、腸内微生物叢の組成を調節する上でのHLAクラスII遺伝子の重要性は不明である。HLAクラスII分子は、特定の細菌を選択することによって腸内微生物コミュニティに影響を与えると仮定される。主組織適合性錯視(MHC)クラスIIノックアウトマウス(AE.KO)またはヒトHLA-DQ8分子を発現するマウス(HLA-DQ8)24、25、26においてHLAクラスII分子の重要性を理解するために用いた。腸内微生物コミュニティを形成する。Rベースのデータ分析を用いたこの完全で簡素化されたワークフローは、マイクロバイオームプロファイリング研究に興味を持つ研究者にとって優れたツールになると考えられています。
内因性マウスMHCクラスII遺伝子(AE.KO)およびAE-/-を欠くマウスの生成。HLA-DQA1*0103、DQB1*0302(HLA-DQ8)C57BL/6J背景を有するトランスジェニックマウスは、前述の26。胎児サンプルは、両方の性別(8-12週齢)のマウスから採取される。マウスは、NIHおよび制度ガイドラインに従事し、アイオワ大学の動物施設で以前に飼育および維持された。層流キャビネット内のマウスの引き取り、マウスの異なる株間の手袋の交換、およびマウスの適切な維持などの汚染制御戦略は、腸内微生物叢のプロファイリングのための重要なステップです。
適切な個人用保護具(PPE)は、手順全体の間に強くお勧めします。DNA分離、PCR1およびPCR2増幅、およびシーケンシングステップを実行する際には、適切な負のコントロールを含める必要があります。無菌、DNaseフリー、RNaseフリー、パイロゲンフリーの使用をお勧めします。マイクロバイオーム作業および濾過されたピペットの先端のための指定されたピペットは、プロトコル全体で使用されるべきです。微生物叢分析は7つのステップで構成されています:1)fecalサンプルの収集と処理;2)DNAの抽出;3) 16S rRNA遺伝子増幅;4)インデックス付きPCRを使用したDNAライブラリ構築;5)インデックス付きPCR(ライブラリ)のクリーンアップと定量。6) ミセックシーケンス;7)データ処理とシーケンス分析。すべてのプロトコル ステップの概略図を図 1 に示します。
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Protocol
このプロトコルは、アイオワ大学の施設動物管理・使用委員会によって承認されました。
1. フェカルサンプルの収集と取り扱い
- 70%のエタノールで仕切り箱を殺菌する(材料の表、補足図1を参照)。
- サンプルIDおよび治療群(該当する場合)を持つマイクロ遠心管(マウス1匹につき1本)を事前標識する。
- マウスを殺菌仕切り箱に入れ、1時間まで通常の排便を行います。
- 無菌鉗子を使用して、あらかじめラベルが付いた1.5 mLマイクロ遠心分離管にfecalペレットを集め、チューブをしっかりと閉じます。各マウスから収集した後、鉗子を殺菌します。
- さらに処理するまで-80°Cの冷凍庫にフェカルペレットを含むマイクロ遠心管を置きます。
注:仕切り箱は複数のマウスからの胎児サンプルの同時コレクション(12まで)を一度に可能にするので有利である。
2. DNAの抽出
- 冷凍庫から大腿骨サンプル(マウスまたはヒト)を取り出し、室温(RT)で解凍します。
注:必要に応じて4°Cで一晩解凍し、200mgまたはストックサンプルから必要量を収集することをお勧めします。 - 200mgの開始材料を使用し、DNAを50 μLの最終容積に溶出します。
- fecalサンプルは追加されていないが、すべてのDNA抽出ステップを通じて処理されるDNA単離キットを空白にします。
注:ヒトおよびマウス便に存在する分解された赤血球から、バイオソリッド、未消化植物材料、ヘム化合物などの阻害物質を除去する特定の試薬が含まれているため、特定のDNA単離キット(材料の表を参照)が使用されました。サンプル。 - ビーズチューブをホモジナイザー(材料の表を参照)に入れ、RTで45sのサンプルを均質化し、4.5 m/sの速度を測定します。
注:任意のメーカーからのビーズビートホモジナイザーを使用することができます。しかし、他のベンダーからビーズ打ちホモジナイザーを使用する場合は、方法、特に均質化の速度と持続時間を標準化することをお勧めします。 - メーカーのプロトコル(材料の表を参照)に従って細菌DNA単離キットを使用して、個々のマウスのfecalサンプルからDNAを分離します。フッ素計または高感度電気泳動チップにDNAの1 μLをロードすることにより、単離されたDNAを定量化します(材料の表を参照)。
注:DNAの期待収量は、200mgの大腿骨サンプルから始まると500~2,500ngの範囲に及ぶことができる。 - 溶出バッファーを使用してDNAの濃度を4~20ng/μLに調整します。PCR1が同じ日に行われなかった場合、16S rRNA遺伝子増幅(PCR1)に進む前にDNAを再定量する(ステップ2.5で行われるように)。
3. 16S rRNA遺伝子増幅(PCR1)
- 25 μL反応体積を用いて96ウェルPCRプレートに16S rRNA遺伝子増幅(PCR1)をセットアップします。
- マルチチャネルピペットを使用して、dNTP(材料表を参照)に加えて、バッファーを含む2倍の高忠実度ポリメラーゼ酵素ミックスの12.5 μLを追加します(材料の表を参照):最大10.5 μLの総体積でDNAの40 ng(PCRグレードの水で総体積を調整):1 μL(各)前方1 μM濃度でプライマーを逆にします。
注:プライマーのシーケンスは次のとおりです。
フォワードプライマー = 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GGGTGTACGGGGGGGGAGAG-3' リバースプライマー = 5'-GTCTCGTGGGGGGGGGGAGATGTGTA TAAGAGAAGGAGATTAAAATATACATACATACATACATACATACATACATACATACA.ステップ2.3(キット試薬制御)からPCRプレートにキットを含めます。 - 卓上プレート遠心分離機(材料の表を参照)で1分間20°Cで1,000 x gでPCRプレートと遠心分離機をシールし、3分間95°CのサーマルサイクラーでPCRを実行します。1) 95 °C の 25 サイクル 30 s, 2) 55 °C 30 s, 3) 72 °C 30 s;5分間72 °Cで最終的な延長;4 °Cで保持します。
注:この16S rRNA遺伝子増幅法は異なる種類の生体試料で動作するはずですが、新しいプロジェクトを開始する際には増幅サイクルの数を標準化することをお勧めします。 - 高感度電気泳動チップにDNAの1μLをロードしてPCR1製品のサイズを確認します。または、1.5%のアガロースゲル上で16S rRNA増幅産物の5 μLを実行し、PCR1製品の550 bpを確認します。
注:16S rRNA増幅製品のクリーンアップはオプションであり、使用されているDNA絶縁キット/方法に依存します。社内のDNA分離法を用いれば、PCR1製品はメーカーのプロトコルに従ってマイクロバイオームDNA精製キットを用いて洗浄することができる(材料の表参照)。ここで使用されるDNA分離キットは、超純DNAを生成し、PCR1製品のクリーンアップを必要としません。
4. インデックス付きPCR(PCR2)を用いたDNAライブラリ構築
-
インデックス 1 とインデックス 2 バーコードされたプライマーを 96 のライブラリの特別なラック (材料の表を参照) に配置します。
- 特殊ラックの行 A-H にインデックス 1 プライマーを列 1 ~ 12 列に配置し、インデックス 2 プライマーを配置します。
- 列 1~12 列にインデックス 1 の 2.5 μL を追加し、マルチチャネル ピペットを使用して行 A-H にインデックス 2 プライマーを追加します。新しいキャップ(材料の表を参照)をインデックス1とインデックス2の採用プライマーに置き、-20°Cの冷凍庫に保管します。
- マルチチャネルピペットを使用して、dNTPに加えて、バッファーを含む2倍の高忠実度ポリメラーゼ酵素ミックスの12.5 μLを追加します(材料の表を参照)。PCRグレードの水の5 μLと16S rRNA増幅産物の2.5 μL。
注:Kiernan et al.27で説明したように、1 回の実行で 96 を超えるライブラリを多重化するための一意のインデックスを各サンプルに追加します。本プロトコルは、16Sメタゲノミクスシーケンシング法(例えば、Illumina)で提供されるメーカーの指示に従って、商用キット(例えば、Nextera XTインデックスキット)のアダプタを使用します。 - 1分間20°Cで1,000 x gでインデックス付きPCRプレートをシールし、遠心分離し、3分間95°CのサーマルサイクラーでPCRを実行します。1) 95 °C の 8 サイクル 30 s, 2) 55 °C 30 s, 3) 72 °C 30 s;そして5分間72 °Cの最終的な延長。
- 高感度電気泳動チップに1μLのDNAをロードして、インデックス付きPCR製品の630塩基サイズを確認します。または、1.5%のアガロースゲル上でインデックス付きPCR製品の5 μLを実行して、製品のサイズと強度を確認します。
5. インデックス付き PCR (PCR2) のクリーンアップと定量
- 検出可能なDNase、RNase、ヒトDNA、および発熱性細菌を含まないマルチチャネルリザーバトレイに各ウェルからマルチチャネルピペットを使用してPCR2アンプリコンのプール5 μL(材料の表を参照)。
- プールされた製品をマルチチャンネルリザーバートレイから、あらかじめラベル付けされた1.5mLマイクロ遠心管と渦に移して混合します。
- メーカーの指示に従い、標準の磁気ビーズキット(材料の表を参照)を使用してPCR2製品を精製します。必要に応じて、PCR2の残りの20 μLを-80 °Cで同じプレートにシールして保管してください。
- PCRグレードの水の1mLに100%エタノールの4 mLを加えて新鮮な80%エタノールを調べます。
- 磁気ビーズをRTに平衡化し、30sの渦を平衡化してビーズを均等に分散させます。
- 簡単に渦を起こすとプールされたPCR2アンプリコンサンプルをスピンダウンします。
- 80 μLの磁気ビーズを、プールされたPCR製品の80 μLを含む無菌1.5mLマイクロ遠心分離管に80 μLを加え、その後、渦とスピンダウンして磁気ビーズを均等に再懸濁させます。
- チューブを15分間邪魔することなく、RTで内容物をインキュベートします。
- 磁気スタンド(材料の表を参照)にDNAと磁気ビーズを入れたチューブを5分間置きます。
- 上清の150μLを慎重に取り出して廃棄します。
- ビーズを乱さずに200μLの80%エタノールを加え、30sのインキュベートします。
- 慎重に取り外し、すべての上清を廃棄します。
- 手順 5.11 ~ 5.12 を繰り返します。P10ピペットで残りのボリュームを取り外します。ビーズを15分間空気乾燥させ、インデックスPCRチューブを磁気スタンドに残します。
- 磁気スタンドから取り外します。溶出バッファーの33 μLを追加します(DNAキットの溶出バッファーは許容可能です)。渦はよく、側面に残っている液体を除去するために迅速なスピンを行います。2分間インキュベートし、磁気スタンドに5分間置きます。
- 上清(クリーンPCR製品)の30μLを、あらかじめ標識された1.5mLマイクロ遠心管に移します。
- これは、シーケンシング中に必要とされるため、蛍光計または高感度電気泳動チップに精製プールの1 μLをロードすることにより、精製プールを定量化します。以下に詳しく説明するように MiSeq を実行します。
6. ミセックシーケンシング
- メタゲノミクスワークフローのサンプル固有のバーコード情報を含むサンプルシートを作成し、MiSeq計測器の多重化を解除します(「材料の表」を参照)。このサンプルシートをソフトウェア(例:イルミナ実験マネージャー)にアップロードします。
- プールされたライブラリーをステップ 5.15 から 4 nM に希釈します。
- 4 nMライブラリプールの5 μLと、1.5 mLマイクロ遠心管で新たに準備された0.2 M NaOHの5 μLを組み合わせることで、変性プールライブラリ。渦は短時間混合し、遠心分離機を短時間で混合し、周囲RTで5分間インキュベートする。
- 990 μLの氷冷ハイブリダイゼーションバッファ(HBバッファ)とピペットを穏やかに加えて混ぜます。これにより、20 pM ライブラリが生成されます。
- 10 nM制御ライブラリの2 μLと3 μLのEBTバッファー(10 mM Tris-HCl、pH = 8.5、0.1%Tween 20)を組み合わせて、4 nM制御ライブラリを生成します。作りたての0.2 N NaOHと渦を5μL加えて短時間混ぜます。RTで5分間インキュベートします。
-
990 μL の氷冷ハイブリダイゼーション バッファー (HB バッファー) とピペットを穏やかに混合します。これにより、20 の pM コントロール ライブラリが生成されます。
注:変性20 pM制御ライブラリは、最大4週間-20°Cで保存することができます。4週間後、クラスター数は減少する傾向があります。- 20 pMライブラリーの210 μLと20 pM制御ライブラリの40 μL(最終濃度=~18%)を組み合わせ、HBバッファーの350 μLを追加します。ライブラリを最終的な濃度 7 pM でロードします。
注:入力の詳細は、実行のパフォーマンスごとに調整する必要があります。
- 20 pMライブラリーの210 μLと20 pM制御ライブラリの40 μL(最終濃度=~18%)を組み合わせ、HBバッファーの350 μLを追加します。ライブラリを最終的な濃度 7 pM でロードします。
- 96 °Cで2分間サンプルをインキュベートします。最終プールの600 μLをMiSeqカートリッジの適切な井戸に5分間氷の上に置きます。
注:上記のセクション6は、ゲノム/DNAコア施設で行うことができる。
7. データ処理とシーケンス分析
- DADA2 データ処理および分析には R ソフトウェア (バージョン 3.5) を使用します。手順 7.1 -7.4 では、以前に開発された DADA2 オンライン チュートリアル
注:簡単に使用可能な R スクリプトが補足ファイル 2として添付されており、ユーザーはシーケンス ファイルの名前とソース (SAMPLENAME_R1_001.fastq や SAMPLENAME_R2_001.fastq など) を変更する必要があります。 - plotQualityProfileコマンドを使用して、前方読み取りと逆読み取りの品質プロファイルを視覚化します。
- 品質プロットに基づいて、前方読み取りと逆読み取りからヌクレオチドをトリムします。これらのパラメーターは、DADA2 の truncLen パラメーターによって指定されます。
注:ここでは、フォワード読み取りが破棄される長さしきい値として 280 が使用され、逆読み取りが破棄される長さしきい値として 260 が使用されます。 - オンラインチュートリアルで説明されているように、DADA2パイプラインによって生の16Sデータをfastqファイルとして処理します(
注: DADA2 パイプラインから生成されたサンプルアンプリコン シーケンスバリアント テーブルは、補足ファイル 3として含まれます。これらのデータベースのいずれかを使用して細菌分類の違いが見つからなかったため、Greengene または Silva 参照データベースを使用できます。 - 各サンプルのメタデータ(遺伝子型、性別、処理など)を含むユーザー定義のマッピング ファイルを生成します。サンプル メタデータ ファイルが補足ファイル 4として含まれています。
- アルファダイバーシティ(シャノン指数)とベータの多様性を計算し、オンラインチュートリアルで概説されているPhyloseq28を使用して希少なOTUカウント(PCA)に基づいて、
- METAGENassist29で以下の分析を実行します。
注:属レベルでウィルコクソンランクサム検定を使用して差分の豊富度分析を実行します。ヒートマップと差別化された豊富なタキサは、一般に公開されているWebベースの分析パイプラインであるMETAGENassist29を使用して強調表示されます。- 分類豊富なテーブル (CSV 形式) をアップロードし、列の [サンプル] を選択します。
- マッピング ファイル (CSV 形式) をアップロードし、行のサンプルを選択します。
- [オプション] を選択して、ゼロが 50% を超える変数を削除し、未割り当ておよびマップされていない読み取り値を除外します。
- [オプション] を選択して行を合計で正規化し、列を正規化するログを選択します。
- 左側の列で同じをクリックして火山、PCA、またはPLSDAプロットを作成し、[サンプル名を削除]をクリックしてグラフを作成します。
- t検定 (2 つのグループのみの場合) または ANOVA (2 つのグループより大きい場合) を実行して、グループ間で異なるフィーチャ (細菌) を視覚化します。[選択したフィーチャ]をクリックして、グループ間で異なる特定の細菌を視覚化します。
- [デンドログラム]または [ヒート マップ]をクリックして、それぞれのプロットを作成します。グループによるサンプルビジュアライゼーションやt-test/ANOVAベースのトップ25の機能など、追加の分析を実行できます。
- [ランダムフォレスト]をクリックして、分類に使用できるフィーチャを示すグラフを作成します。上部の[分散]タブをクリックして、グループ間で異なる上位フィーチャのグラフを作成します。[フィーチャの詳細]をクリックすると、グループ間で異なる細菌の一覧が表示され、各細菌をクリックして同じグラフィカルなサマリーが作成されます。
- 上の[外れ値]タブをクリックして、外れ値であるサンプルを視覚化します。
- 最後に、[ダウンロード]をクリックし、実行されたすべての分析を含む zip ファイルを 1) 選択するか、2) ダウンロードする必要な機能を選択します。このファイルは一意の名前として保存する必要があり、使用する前に解凍する必要があります。
注:マイクロバイオーム分析中に行われた詳細な統計試験については、Chen et al. および Hugerth et al.14,30 の研究を参照してください。
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Representative Results
MHCクラスII分子(ヒトにおけるHLA)は適応免疫応答の中心的な遊体であり、MS24、25、26に対する素因との強い関連を示すように、HLAクラスII分子と仮定した。腸内微生物組成に影響を与えるだろう。そこで、MHCクラスII遺伝子(AE.KO)またはヒトHLA-DQ8遺伝子(HLA-DQ8)を発現するマウスを用いて、腸内微生物群集を形成する上でHLAクラスII分子の重要性を理解した。
AE.KO(n=16)およびHLA-DQ8(n=12)トランスジェニックマウスから採取した偽サンプルを採取し、細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅した。アンプリコンサイズ(550bp)を1.5%のアガロースゲルでサンプルを走らせて確認した(図2A、レーン1~6)。 さらに16S rRNAアンプリコンサイズ(550bp)の確認は、高感度電気泳動チップにPCR1産物の1μLを装填することにより行った(図2B、レーン1-7)。
16S rRNA PCR産物からエレクトロフェログラムを生成し、約550bp(図2C)の断片を有するピーク領域を示した。デュアルインデックスとシーケンス・アダプターは、各サンプルに一意の ID を割り当て、単一の MiSeq シーケンス実行で多数のサンプルを多重化できるインデックス付き PCR (PCR2) を使用してアタッチされました。インデックス付きPCRの確認は、アガロースゲル電気泳動(図2A、レーン7-12)および高感度電気泳動チップ(図2B、レーン8-12)、図2D)によって行った。 PCR2からのすべてのサンプルをプールし、精製し、良好な品質の前方R1とリバースR2読み取りを生み出した次世代シーケンサーにロードしました(図3)。品質フィルタリングおよびトリミング後に得られた読み取りの中央値は88,125(9,597-111,848の範囲)であった。
コミュニティ生態学解析は、DADA2分析パイプラインを用いて行い、フィロセックとMETAGENassistを用いて可視化し、α多様性(図4)とβ多様性(図5)の違いを実証した。グループ間の属と種のレベル。DADA2分析は、ウェブベースのプラットフォーム(Phyloseqおよび/またはMETAGENassist)を使用してさらに下流分析に使用されたcsv形式でコンマ区切り値を持つ豊富なテーブルを生成しました。アルファとベータの多様性分析は、マッピング ファイルにリストされているユーザー定義のカテゴリに基づいて実行されました。
シャノン多様性解析では、HLA-DQ8トランスジェニックマウスと比較して、AE.KOマウスの全体的に低いアルファ多様性が明らかになった(図3)。主座標解析を用いての座標解析では、AE.KOマウスとHLA-DQ8トランスジェニックマウスとの間に明確な空間クラスタリングが見られました(図5)。DADA2からの豊富なテーブルはまた、オープンアクセスソフトウェアMETAGENassist29を使用して包括的なメタゲノム分析を実行するために使用されました.細菌の豊富さ(属レベル)のヒートマップベースのクラスタリング(図6A)と、METAGENassistパイプラインを用いて2つの群間の差異を示す特定細菌の箱プロット(図6B)を生成した。
ヒートマップ分析では、HLA-DQ8トランスジェニックマウスにおいて、アロバクラム、デスフォビブリオ、リケネラなどの特定の細菌がより多く含まれることが示された。対照的に、バイオロフィラはAE.KOマウスにおいてより豊富であった(図6B)。個々の細菌の相対的な存在量(胆汁性およびリケネラ)は、代表的な箱プロット(図6B)に示されている。全体として、AE.KOマウスはHLA-DQ8トランスジェニックマウスと比較して明確な微生物群異を有し、AE.KOマウスに特定の細菌が存在しないことが示された。このデータはまた、MHCクラスII分子が特定の細菌の豊富さにおいて重要な役割を果たしていることを示唆している。要約すると、このシンプルで詳細なプロトコルは、マイクロバイオーム分野に新しい研究者だけでなく、より高い分類分解能を達成するための方法の更新を必要とする研究者を助けます。
図1:腸内微生物叢シーケンシングの流れ図。マイクロバイオームシーケンシング(マイクロバイオームデータ分析へのサンプル収集)のすべてのステップが表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:V3-V4領域の16S rRNA遺伝子増幅および品質管理解析(A)AE.KOマウス(レーン1-3および7-9)およびHLA-DQ8トランスジェニックマウス(レーン4-6および10-12)から16Sアンプリコン(PCR1、サイズ550bp)およびインデックス付きPCR(PCR2、サイズ=630bp)の代表的なアガロースゲル電気泳動画像。(B)AE.KOマウス(レーン1-3および8-10)およびHLA-DQ8トランスジェニックマウス(レーン4-7および11-12)の16Sアンプリコン(PCR1、サイズ=550bp)およびインデックス付きPCR(PCR2、サイズ=630bp)の代表的なゲル画像を電気フォアシスによって解決した。(C)16Sアンプリコンの代表電フェログラム(PCR1)は、約550bp.(D)指数化されたPCR(PCR2)の代表的なエレクトロフェログラムを含む断片を含むピーク領域を示した〜サイズの断片を含むピーク領域を示した〜630 bp.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 2 つの代表的なサンプルのフォワード読み取り (R1、上) の品質プロファイルと、同じサンプルに対する対応する逆読み取り (R2、下部) 。分析は、X 軸が読み取り長 (0 ~ 300 ベース) を示し、Y 軸が読み取りの品質を示す DADA2 パイプラインを使用して実行されました。緑色の線は中央値の品質スコアを表し、オレンジ色の線は各基準位置の品質スコア分布の四分位数を表します。フォワード読み取り(R1)は、常に逆読み取り(R2)よりも優れた品質を示しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:AE.KOマウス及びHLA-DQ8トランスジェニックマウスのアルファ多様性測定(シャノン多様性)。各ドットは、単一のマウスからのサンプル中のα多様性(シャノン多様性)を表します。シャノンの多様性は、HLA-DQ8トランスジェニックマウスと比較してAE.KOマウスでは全体的に低かった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 部分最小二乗ベースの寸法解析プロットを使用した調整。プロットは、AE.KOマウスとHLA-DQ8トランスジェニックマウスとの間の明確な分離を示す。各ドットはサンプル内の細菌組成を表し、点線の日食は80%の信頼区間を示します。PLS-DAプロットはMETAGENassistを用いて生成された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:HlA-DQ8トランスジェニックマウスと比較して明確な微生物群異を示すAE.KOマウスは、AE.KOマウスに特異的な細菌が存在しない。(A)ヒートマップと、細菌の相対的な存在量(属レベル)を示す凝集階層クラスタリングを組み合わせたもの。(B)AE.KOおよびHLA-DQ8トランスジェニックマウスにおける2つの代表的な細菌(胆汁フィラおよびリケネラ)の正規化相対存在を示すボックスプロット。両方のプロットはMETAGENassistを使用して生成された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:一度に複数のマウスから採取したフェチサンプルの採取用分周ボックスの代表図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2:生のシーケンスから豊富なテーブルを生成するための DADA2 R スクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 3:代表的な属の豊富なテーブル(CSV形式)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 4:代表的なマッピング ファイル (CSV 形式)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載されたプロトコルは簡単で、目的の多数の生体標本から16S rRNAメタゲノムシーケンシングを使用してマイクロバイオームプロファイリングを実行するための簡単な手順を用いられます。次世代シーケンシングは、特にヒトおよび前臨床疾患モデル31,32において、微生物生態学研究を変革した。この技術の主な利点は、高スループットレベルおよび低コスト32で、所定の生体試料中の複雑な微生物組成物(培養可能および非培養可能な微生物)を正常に分析できることである。しかしながら、いくつかの要因(すなわち、バッチ効果、16S rRNA遺伝子のプライマーの選択、および配列データ解析)は、この技術の広範な使用における主要な障害のままである。
高度な16S rRNAベースのMiSeqシーケンシング技術(2x300bp)33は、短いシーケンシング読み取りの以前のボトルネックを克服した細菌の1,500ヌクレオチド長い16S rRNA遺伝子のうち、約600ヌクレオチドのシーケンシングを可能にします。V1-V2、V3-V5、またはV6-V9などのrRNAの異なる領域に固有のプライマーは、特定のタキサ34、35の過剰検出または過小検出に対するいくつかのバイアスを示す各領域固有のプライマーで使用することができる。一部のグループはV1-V2領域21を好み、クロストリジウムのバイアスは増加しているが、特定のバクテロイデテス種に対する検出不足を示す。対照的に、他のグループは、細菌タキサ15、20、36、37の最も偏った分類を示すV4、V3-V4、およびV3-V5領域を好む。
本プロトコルは、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域に特異的なプライマーを使用し、V4単独と比較して2つの超可変領域(V3およびV4)を有する16S rRNAの長い領域をカバーする。さらに、V3-V4特異的アンプリコンは、前方(R1)と逆(R2)の両方の読み取りが可能になり、細菌分類のより良い分解能につながります。V3-V5 領域は長い読み取りを提供し、より多くの超可変領域(V3、V4、および V5)をカバーしますが、R1 読み取りと R2 読み取りの間に重複する領域がないため、R1 読み取りと R2 読み取りのマージは困難です。したがって、多くの研究は、V3-V5領域14を用いて16S rRNAメタゲノムシーケンシングを行う際に細菌分類のためにR1読み取りからのみデータを使用している。
細菌DNAの劣化や環境汚染を防ぐためには、適切な生体試料の貯蔵と取り扱いがマイクロバイオーム分析に不可欠です 38.RTまたは4°Cでの生体試料の長期保存は、特定の細菌または真菌の過剰増殖につながる可能性があります。サンプルは直ちに凍結するか、または4°C(1〜3日間)で輸送し、その後凍結することができる。生体試料は、核酸安定化溶液(例えば、RNA-later)、95%エタノール、または市販の貯蔵キットなどの防腐剤に直接保存することもできる。一般的なコンセンサスは、これらの貯蔵方法のいずれも細菌コミュニティプロファイル39、40に有意な差を生じさせないということです。防腐剤を含む溶液はRTでの貯蔵と輸送を可能にしますが、これらのサンプルはRNAベースのアッセイ、代謝物分析、またはfecal移植実験には使用できません。これらの問題は、他の場所で詳細に議論されています39,40.
このプロトコルの重要なステップの1つは、グラム陽性細菌およびArchaeaの機械的破壊のためのビーズ打ち方ベースの方法の使用である。以前の研究は、細胞リシス41の他の方法と比較してビーズ打撃ベースの方法を使用して最も高い細菌多様性を示した。DNA抽出中の不完全な細菌分解または汚染は、腸内微生物叢データ42にバイアスを導入しうる。考慮すべきもう一つの重要な点は、キトメ43、44、45と呼ばれるキットに含まれる実験室試薬による汚染です。大きなバイオマスと土壌や便器などの豊富な細菌多様性を持つサンプルは、皮膚などの低いバイオマスを持つサンプルに比べて、これらの問題の少なさを示しています。したがって、水抽出制御は、各抽出に含まれ、DNA抽出43、44、45による潜在的な汚染の導入を識別するために他のサンプルと共に処理されるべきである。
マイクロバイオーム分析では、サンプル内の多様性は、サンプル/グループ間の相違点を推定する、種の豊かさの尺度であるアルファ多様性、またはベータ多様性によって測定することができる。α多様性を測定するための一般的な方法には、UniFrac(重み付けおよび重み付けされていない)と、主座標解析(PCoA)やブレイカーティスの不類似性などの多変量統計手法が含まれます。UniFracは系統的距離に基づいていますが、Brey-Curtisの非類似性分析は、プロットを生成するために細菌の豊富さを利用しています。α-およびβ多様性に関する詳細な説明では、他の場所で議論30、46、47.多くの統計的方法を利用して、グループ14,48間の微生物群の違いを比較することができる。複数の検定14を修正するには、未加工のp値の代わりに調整されたp値を使用することをお勧めします。
対象となるシーケンシングデータを個別に分析するバイオインフォマティクスソフトウェアは様々です49.提案されたプロトコルは、Rベースのオープンソースソフトウェアパッケージを使用しており、RベースのDADA2パイプラインを介して細菌タキサをユーザーフレンドリーかつ迅速にプロファイリングできます。DADA2から生成された豊富なテーブルは、フィロセックとMETAGENassistを用いて下流分析に使用することができる。DADA2 パイプラインは、比較的大きな計算リソースと特別な技術的専門知識を必要とする特別な機能 (仮想マシンや Docker コンテナーのインストールなど) を必要としないため、QIIME よりも有利です。特に16S分析の初心者のために、Rは無料で、ユーザーが実行しやすいアクセス可能なオンラインチュートリアルや分析スクリプトを利用することができますので、魅力的です。重要なのは、これらの分析ツールは比較的小さな計算リソースを必要とし、PC、Macintosh、または Linux ベースのプラットフォームで実行できることです。さらに、METAGENassistは、DADA2パイプラインから生成された豊富なテーブルだけでなく、QIIME/MG-RASTから生成された生物学的観察マトリックス(BIOM)ファイルを使用して、PCA、部分的な最小二乗性分析(PLS-DA)などの分析を実行することができます。火山プロット、t-検定(2つのグループを比較する)、ANOVA(3つ以上のグループを比較する)、ヒートマッププロット、ランダムフォレスト解析などMETAGENassistは非常にユーザーフレンドリーであることが判明しました。
要約すると、このプロトコルは、サンプル収集、DNA抽出、メタゲノムライブラリー調製、イルミナMiSeqのシーケンシング、および自由に使用してユーザーフレンドリーなデータ分析に関する詳細なガイドと、単純な16S rRNAメタゲノムプロファイリングパイプラインを説明します。利用可能なプラットフォーム(すなわち、DADA2、フィロセック、およびMETAGENassist)。16S rRNAメタゲノムベースの分類ゲノムプロファイリングは、特定の生体標本に存在する細菌の特性解析に信頼性がありますが、ショットガンメタゲノムシーケンシングは、詳細な代謝経路解析および歪み特異的なアプローチに対するより良いアプローチである可能性があります。細菌の同定。
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Disclosures
A. M. 自己免疫疾患の治療にプレボテッラヒスティコラの使用を主張する技術の発明者の一人としてメイヨークリニック(エベロバイオサイエンスによって支払われた)からロイヤリティを受け取りました。
Acknowledgments
著者らは、NIAID/NIH(1R01AI137075-01)、カーバートラスト医学研究イニシアチブ助成金、アイオワ大学環境保健科学研究センター(NieHS/NIH(P30 ES005605)からの資金提供を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
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