Summary
Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.
Abstract
L'intestin humain est colonisé par des milliards de bactéries qui soutiennent les fonctions physiologiques telles que le métabolisme alimentaire, la récolte d'énergie et la régulation du système immunitaire. La perturbation du microbiome intestinal sain a été suggérée pour jouer un rôle dans le développement des maladies inflammatoires, y compris la sclérose en plaques (SEP). Les facteurs environnementaux et génétiques peuvent influencer la composition du microbiome; par conséquent, l'identification des communautés microbiennes liées à un phénotype de la maladie est devenue la première étape vers la définition du rôle du microbiome dans la santé et la maladie. L'utilisation du séquençage métagénomique 16S rRNA pour le profilage de la communauté bactérienne a contribué à faire progresser la recherche sur le microbiome. Malgré son utilisation large, il n'y a pas de protocole uniforme pour l'analyse de profilage taxonomique basée sur l'ARNr16. Une autre limitation est la faible résolution de l'affectation taxonomique en raison de difficultés techniques telles que des lectures de séquençage plus petits, ainsi que l'utilisation de l'avant seulement (R1) lit dans l'analyse finale en raison de la faible qualité de l'inverse (R2) lit. Il est nécessaire d'avoir une méthode simplifiée à haute résolution pour caractériser la diversité bactérienne dans un biospécimen donné. Les progrès de la technologie de séquençage avec la capacité de séquencer des lectures plus longues à haute résolution ont aidé à surmonter certains de ces défis. La technologie actuelle de séquençage combinée à un pipeline d'analyse métagénomique accessible au public, comme l'amplicon de Division Denoising Algorithm-2 (DADA2) basé sur la R, a contribué à faire progresser le profilage microbien à haute résolution, car DADA2 peut assigner une séquence au genre et les niveaux d'espèces. Décrit ici est un guide pour effectuer le profilage bactérien utilisant l'amplification en deux étapes de la région V3-V4 du gène 16S rRNA, suivie d'une analyse utilisant des outils d'analyse librement disponibles (c.-à-d. DADA2, Phyloseq, et METAGENassist). On croit que ce flux de travail simple et complet sera un excellent outil pour les chercheurs intéressés à effectuer des études de profilage du microbiome.
Introduction
Le microbiote désigne une collection de micro-organismes (bactéries, virus, archées, bactériophages et champignons) vivant dans un environnement particulier, et le microbiome fait référence au génome collectif des microorganismes résidents. Comme les bactéries sont l'un des microbes les plus abondants chez l'homme et la souris, cette étude se concentre uniquement sur le profilage bactérien. L'intestin humain est colonisé par des milliards de bactéries et des centaines de souches bactériennes1. Le microbiote intestinal normal joue un rôle vital dans le maintien d'un état sain dans l'hôte en régulant les fonctions (c.-à-d. le maintien d'une barrière intestinale intacte, le métabolisme alimentaire, l'homéostasie énergétique, l'inhibition de la colonisation par des organismes pathogènes, et régulation des réponses immunitaires)2,3,4,5. Les perturbations de composition du microbiote intestinal (dysbiose intestinale) ont été liées à un certain nombre de maladies humaines, y compris les troubles gastro-intestinaux6, l'obésité7,8, accident vasculaire cérébral9, cancer10, diabète8,11, polyarthrite rhumatoïde12, allergies13, et les maladies liées au système nerveux central tels que la sclérose en plaques (SEP)14,15 et la maladie d'Alzheimer maladie (AD)8,16. Par conséquent, ces dernières années, il ya eu un intérêt croissant pour les outils pour identifier la composition bactérienne à différents sites du corps. Une méthode fiable devrait avoir des caractéristiques telles que le haut débit et facile à utiliser, ayant la capacité de classer le microbiote bactérien avec une haute résolution, et d'être à faible coût.
Les techniques microbiologiques basées sur la culture ne sont pas assez sensibles pour identifier et caractériser le microbiome intestinal complexe en raison de l'échec de plusieurs bactéries intestinales à se développer en culture. L'avènement de la technologie basée sur le séquençage, en particulier le séquençage métagénomique à base de rRNA 16S, a surmonté certains de ces défis et transformé la recherche sur le microbiome17. La technologie avancée de séquençage à base de rRNA 16S a aidé à établir un rôle critique pour le microbiome intestinal dans la santé humaine. Le Projet Microbiome Humain, une initiative des Instituts Nationaux de la Santé18et le projet MetaHIT (une initiative européenne)19 ont tous deux contribué à l'établissement d'un cadre de base pour l'analyse du microbiome. Ces initiatives ont aidé à lancer de multiples études pour déterminer le rôle du microbiome intestinal dans la santé humaine et les maladies.
Un certain nombre de groupes ont montré la dysbiose intestinale dans les patients présentant des maladies inflammatoires12,14,15,20,21,22. En dépit d'être employé couramment pour le profilage taxonomique dû à la capacité au multiplexe et aux coûts bas, il n'y a aucun protocole uniforme pour le profilage taxonomique 16S rRNA-basé. Une autre limitation est la faible résolution de l'affectation taxonomique en raison de lectures de séquençage plus petites (150 bp ou 250 pb) et l'utilisation de la lecture de séquençage vers l'avant seulement (R1) en raison de la faible qualité des lectures de séquençage inverse (R2). Cependant, les progrès de la technologie de séquençage ont aidé à surmonter certains de ces défis, tels que la capacité de séquencer des lectures plus longues à l'aide de lectures à extrémité appariée (p. ex., Illumina MiSeq 2x300bp).
La technologie de séquençage actuelle peut séquencer 600 bp de bonnes lectures de bonne qualité, ce qui permet la fusion de R1 et R2 lit. Ces lectures R1 et R2 fusionnées plus longues permettent de meilleures affectations taxonomiques, en particulier avec la plate-forme d'amplicon de désamorçant de l'algorithme de désamorçant de Division-2 (DADA2) basée sur r-accès en libre accès. DADA2 utilise des affectations basées sur la variante de séquence d'amplicon (ASV) au lieu d'affectations d'unité taxonomique opérationnelle (OTU) basées sur une similitude de 97 % utilisée par QIIME23. Les correspondances ASV donnent lieu à une séquence exacte dans la base de données dans 1/2 nucléotides, ce qui conduit à l'affectation au niveau du genre et des espèces. Ainsi, la combinaison de lectures plus longues et de bonne qualité et de meilleurs outils d'affectation taxonomique (comme DADA2) a transformé les études sur le microbiome.
Fourni ici est un guide étape par étape pour effectuer le profilage bactérien en utilisant l'amplification en deux étapes de la région V3-V4 de 16S rRNA et l'analyse des données à l'aide de pipelines DADA2, Phyloseq et METAGENassist. Pour cette étude, des souris transgéniques de classe II d'antigène de leucocyte humain (HLA) sont employées, car certains allèles de classe II de HLA sont liés à une prédisposition aux maladies autoimmunes telles que MS20,24,25. Cependant, l'importance des gènes de classe II de HLA dans la régulation de la composition du microbiote intestinal est inconnue. On suppose que la molécule de classe II de HLA influencera la communauté microbienne intestinale en sélectionnant pour des bactéries spécifiques. Major histocompatibility complex (MHC) class II knockout mice (AE.KO) or mice expressing human HLA-DQ8 molecules (HLA-DQ8)24,25,26ont été utilisés afin de comprendre l'importance des molécules de classe II HLA dans façonner la communauté microbienne intestinale. On croit que ce flux de travail complet et simplifié avec l'analyse des données R servira d'excellent outil pour les chercheurs intéressés à effectuer des études de profilage des microbiomes.
La génération de souris dépourvues de gènes murine sinain sinain isancées de classe II (AE.KO) et AE-/-. HLA-DQA1-0103, DQB1-0302 (HLA-DQ8) souris transgéniques avec un fond C57BL/6J a été décrit précédemment26. Des échantillons fécaux sont prélevés sur des souris des deux sexes (8 à 12 semaines d'âge). Les souris ont déjà été élevées et entretenues dans les installations animales de l'Université de l'Iowa conformément aux lignes directrices des NIH et des institutions. Les stratégies de contrôle de la contamination telles que le soudage des souris à l'intérieur d'une armoire à débit laminaire, le changement de gants entre différentes souches de souris, et l'entretien approprié des souris sont des étapes critiques pour le profilage du microbiome intestinal.
Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié est fortement recommandé pendant toute la procédure. Des contrôles négatifs appropriés devraient être inclus lors de l'exécution de l'isolement de l'ADN, de l'amplification PCR1 et PCR2, et des étapes de séquençage. Il est recommandé d'utiliser des fournitures stériles, sans DNase, sans NNase et sans pyrogène. Le pipettor désigné pour le travail de microbiome et les bouts filtrés de pipette devraient être employés tout au long du protocole. L'analyse du microbiote se compose de sept étapes : 1) la collecte et le traitement d'échantillons fécaux; 2) extraction d'ADN; 3) amplification de gène de rRNA de 16S ; 4) Construction de bibliothèque d'ADN utilisant le PCR indexé ; 5) nettoyage et quantification des PCR indexés (bibliothèque); 6) Séquençage MiSeq; et 7) le traitement des données et l'analyse des séquences. Un diagramme schématique de toutes les étapes du protocole est affiché dans la figure 1.
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Protocol
Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Iowa.
1. Collection et manipulation d'échantillons fécaux
- Stériliser les boîtes de diviseur (voir Tableau des matériaux, Figure supplémentaire 1) avec 70 % d'éthanol.
- Tubes de microcentrifuge pré-étiquette (un par souris) avec l'iD de l'échantillon et le groupe de traitement (le cas échéant).
- Placez les souris dans des boîtes de diviseurs stérilisées et laissez-les déféquer normalement jusqu'à 1 h.
- Recueillir les granulés fécaux dans un tube microcentrifuge vide et préétiqueté de 1,5 mL à l'aide de forceps stériles et fermer le tube solidement. Stériliser les forceps après la collecte de chaque souris.
- Placer le tube de microcentrifuge contenant des granulés fécaux dans un congélateur de -80 oC jusqu'à ce qu'il soit traité davantage.
REMARQUE: Les boîtes de diviseur sont avantageuses parce qu'elles permettent la collecte simultanée des échantillons fécaux de plusieurs souris (jusqu'à 12) à la fois.
2. Extraction d'ADN
- Retirer les échantillons de matières fécales (souris ou humains) du congélateur et décongeler à température ambiante (RT).
REMARQUE: Il est conseillé de décongeler les échantillons de selles humaines pendant la nuit à 4 oC au besoin pour recueillir 200 mg ou la quantité requise à partir d'échantillons de stock. - Utilisez 200 mg de matériaux de départ et de l'ADN d'éliner à un volume final de 50 L.
- Inclure un kit d'isolement de l'ADN vierge dans lequel aucun échantillon fécal n'est ajouté, mais est traité à travers toutes les étapes d'extraction de l'ADN.
REMARQUE: Une trousse spécifique d'isolement de l'ADN (voir Tableau des matériaux)a été utilisée, car elle contient des réactifs spécifiques pour éliminer les matériaux inhibiteurs tels que les biosolides, les matières végétales non digérées et les composés hèmes des globules rouges lysés présents dans les selles humaines et de souris. Échantillons. - Placez le tube de perles dans un homogénéisateur (voir Tableau des matériaux) et homogénéiser les échantillons pour 45 s à RT et une vitesse de 4,5 m/s.
REMARQUE: L'homogénéisateur perlé de n'importe quel fabricant peut être utilisé. Cependant, il est recommandé de normaliser la méthode, en particulier la vitesse et la durée de l'homogénéisation, lors de l'utilisation de perle-battant homogénéisateur d'un autre fournisseur. - Isoler l'ADN des échantillons fécaux individuels de souris à l'aide d'une trousse d'isolement de l'ADN bactérien suivant le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux) avec des modifications mineures. Quantifier l'ADN isolé en chargeant 1 L de l'ADN sur un fluorimètre ou sur la puce électrophorésisàme à haute sensibilité (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Le rendement prévu de l'ADN peut varier de 500 à 2 500 ng lorsqu'on commence avec 200 mg de l'échantillon fécal. - Ajuster la concentration d'ADN à 4 à 20 ng/L à l'aide d'un tampon d'élution. Requantifier l'ADN (comme il est fait à l'étape 2.5) avant de procéder à l'amplification du gène rRNA 16S (PCR1), si PCR1 n'est pas effectué le même jour.
3. 16S rRNA Gene Amplification (PCR1)
- Configurez l'amplification du gène 16S rRNA (PCR1) dans une plaque PCR de 96 puits à l'aide d'un volume de réaction de 25 L.
- À l'aide d'une pipette multicanal, ajouter 12,5 l de mélange d'enzymes polymérase haute fidélité de 2 x, y compris le tampon, en plus des dNTP (voir tableau des matériaux): 40 ng d'ADN en volume total jusqu'à 10,5 L (ajuster le volume total avec de l'eau de qualité PCR) : 1 L (chacun) de l'avant et les amorces inversées à une concentration de 1 M.
REMARQUE: Les séquences des amorces sont les suivantes :
Amorce avant 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' amorce inverse 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3'. Inclure un kit vierge à partir de l'étape 2.3 (contrôle de réactif de kit) dans la plaque PCR. - Sceller la plaque PCR et la centrifugeuse à 1 000 x g à 20 oC pendant 1 min dans une centrifugeuse de plaque de table (voir tableau des matériaux)et effectuer le PCR dans un cycleur thermique programmé pour : 95 oC pendant 3 min; 25 cycles de 1) 95 oC pour 30 s, 2) 55 oC pour 30 s, 3) 72 oC pour 30 s; extension finale à 72 oC pendant 5 min; et maintenez à 4 oC.
REMARQUE: Bien que cette méthode d'amplification des gènes de l'ARN1 16S devrait fonctionner avec différents types de biospécimens, il est conseillé de normaliser le nombre de cycles d'amplification lors du démarrage d'un nouveau projet. - Confirmez la taille du produit PCR1 en chargeant 1 L de l'ADN sur une puce d'électrophoresis à haute sensibilité. Alternativement, exécutez 5 l de 16S rRNA-amplifié le produit sur un gel d'agarose de 1.5% pour confirmer 550 bp du produit PCR1.
REMARQUE: Le nettoyage du produit amplifié par l'ARNr 16S est facultatif et dépend du kit/méthode d'isolement de l'ADN utilisé. Si vous utilisez une méthode d'isolement interne de l'ADN, le produit PCR1 peut être nettoyé à l'aide d'un kit de purification de l'ADN de microbiome selon le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux). Le kit d'isolement d'ADN utilisé ici donne un ADN ultrapur et ne nécessite pas de nettoyage du produit PCR1.
4. Construction de bibliothèque d'ADN utilisant LE PCR indexé (PCR2)
-
Placez les amorces à codes-barres Index 1 et Index 2 dans un rack spécial (voir Tableau des matériaux) pour 96 bibliothèques.
- Disposez l'amorce de l'index 1 dans les colonnes 1 à 12 et l'amorce index 2 dans les rangées A-H du rack spécial.
- Ajouter 2,5 L d'index 1 dans les colonnes 1-12 et l'amorce de l'indice 2 en rangées A-H à l'aide de pipettes multicanaux. Placez le nouveau bouchon (voir Tableau des matériaux) sur les amorces adopteurs de l'indice 1 et de l'indice 2 et entreposez-le dans un congélateur de -20 oC.
- À l'aide d'une pipette multicanal, ajouter 12,5 L de mélange d'enzymes polymérase haute fidélité de 2 x 2 x contenant un tampon, en plus des dNTP(voir Tableau des matériaux); 5 L d'eau de qualité PCR et 2,5 l de produit amplifié par l'ARN1 16S.
REMARQUE: Ajoutez des indices uniques à chaque échantillon pour le multiplexage de plus de 96 bibliothèques en une seule exécution, tel que décrit dans Kiernan et al.27. Le protocole actuel utilise des adaptateurs d'un kit commercial (p. ex., Nextera XT Index Kit) conformément à l'instruction du fabricant fournie dans la méthode de séquençage de la métagénomique 16S (p. ex., Illumina). - Sceller et centrifuger la plaque PCR indexée à 1 000 x g à 20 oC pendant 1 min et effectuer la PCR dans un cycleur thermique programmé pour : 95 oC pendant 3 min; 8 cycles de 1) 95 oC pour 30 s, 2) 55 oC pour 30 s, 3) 72 oC pour 30 s; et l'extension finale à 72 oC pendant 5 min.
- Confirmez la taille de base de 630 du produit PCR indexé en chargeant 1 L d'ADN sur une puce d'électrophoresis à haute sensibilité. Alternativement, exécutez 5 ll de produit INDEXé de PCR sur un gel d'agarose de 1.5% pour confirmer la taille et l'intensité du produit.
5. Nettoyage des PCR indexés (PCR2) et Quantification
- Piscine 5 ll d'amplicon PCR2 à l'aide de pipettes multicanaux de chaque puits dans un bac à réservoir multicanal exempt de DNase détectable, De RNase, d'ADN humain et de bactéries pyrogéniques (voir Tableau des matériaux).
- Transférer le produit mis en commun du plateau de réservoir multicanal dans un tube et un vortex microcentrifugevides vides et préétiquetés de 1,5 ml pour mélanger.
- Purifiez le produit PCR2 à l'aide d'un kit de perles magnétiques standard(voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Scellez et entreposez les 20 l de PCR2 restants dans la même assiette à -80 oC pour une utilisation ultérieure, si nécessaire.
- Préparer de l'éthanol frais à 80 % en ajoutant 4 ml d'éthanol à 1 ml d'eau de qualité PCR.
- Équilibrez la perle magnétique à RT et vortex pour 30 s pour disperser les perles uniformément.
- Brièvement vortex et tourner vers le bas les échantillons d'amplicon PCR2 mis en commun.
- Ajouter 80 l de perles magnétiques dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml pré-étiqueté et stérile avec 80 l de produits PCR mis en commun, puis vortex et tourner brièvement pour résuspendre uniformément les perles magnétiques.
- Incuber le contenu à RT sans déranger les tubes pendant 15 min.
- Placez le tube avec l'ADN et les perles magnétiques sur un support magnétique(voir Tableau des Matériaux) pendant 5 min.
- Retirez soigneusement et jetez 150 l du supernatant.
- Ajouter 200 l d'éthanol fraîchement préparé à 80 % sans déranger les perles et incuber pendant 30 s.
- Retirez soigneusement et jetez tout le supernatant.
- Répétez les étapes 5.11-5.12. Retirez le volume restant à l'eau avec une pipette P10. Laisser les perles sécher à l'air pendant 15 minutes, le tube PCR de l'index restant sur le support magnétique.
- Retirer du support magnétique. Ajouter 33 ll de tampon d'élution (tampon d'élution du kit d'ADN est acceptable). Vortex bien, et effectuer une rotation rapide pour enlever tout liquide restant sur le côté. Incuber pendant 2 min et placer sur le support magnétique pendant 5 min.
- Transférer 30 ll du supernatant (produits PCR propres) dans un tube microcentrifuge pré-étiqueté de 1,5 ml.
- Quantifier la piscine purifiée en chargeant 1 'L de la piscine purifiée sur un fluorimètre ou une puce d'électrophoresis à haute sensibilité, car cela sera nécessaire lors du séquençage. Effectuer MiSeq comme détaillé ci-dessous.
6. Séquençage MiSeq
- Créer une feuille d'échantillon contenant des informations spécifiques au code-barres pour le flux de travail et le démultiplexage de la métagénomique sur l'instrument MiSeq(voir Tableau des matériaux). Téléchargez cette feuille d'échantillon sur le logiciel (p. ex., Illumina Experiment Manager).
- Diluer les bibliothèques mises en commun de l'étape 5.15 à 4 nM.
- Dénaturement a mis en commun les bibliothèques en combinant 5 ll de la piscine de la bibliothèque de 4 nM avec 5 'L de 0,2 M NaOH fraîchement préparé dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Vortex brièvement à mélanger, centrifugeuse brièvement et incuber pendant 5 min à RT ambiante.
- Ajouter 990 l de tampon d'hybridation glace-froid (tampon HB) et pipette doucement pour mélanger. Cela donnera une bibliothèque de 20 pM.
- Combiner 2 ll de la bibliothèque de contrôle de 10 nM avec 3 'L de tampon EBT (10 mM Tris-HCl, pH '8,5, avec 0.1% Tween 20) pour produire une bibliothèque de contrôle de 4 nM. Ajouter 5 'L de 0,2 NaOH fraîchement préparé et mélanger brièvement le vortex. Incuber pendant 5 min à RT.
-
Ajouter délicatement le tampon d'hybridation glace-froid de 990 l (tampon HB) et la pipette pour mélanger. Cela donnera 20 pM bibliothèques de contrôle.
REMARQUE : Les bibliothèques de contrôle dénaturées de 20 pM peuvent être stockées à -20 oC jusqu'à 4 semaines. Après 4 semaines, le nombre de grappes a tendance à diminuer.- Combinez 210 l de la bibliothèque de 20 pM avec 40 oL de la bibliothèque de contrôle de 20 pM (concentration finale de 18 %), et ajoutez 350 l de tampon HB. Chargez la bibliothèque à une concentration finale de 7 pM.
REMARQUE: Les détails d'entrée doivent être ajustés selon les performances de l'exécution.
- Combinez 210 l de la bibliothèque de 20 pM avec 40 oL de la bibliothèque de contrôle de 20 pM (concentration finale de 18 %), et ajoutez 350 l de tampon HB. Chargez la bibliothèque à une concentration finale de 7 pM.
- Incuber des échantillons pendant 2 min à 96 oC. Mettre sur la glace pendant 5 min. Chargez 600 l de la piscine finale dans le puits approprié des cartouches MiSeq.
REMARQUE: La section 6 ci-dessus peut être effectuée dans un centre génomique/ADN.
7. Traitement des données et analyse des séquences
- Utilisez le logiciel R (version 3.5) pour le traitement et les analyses de données DADA2. Pour les étapes 7.1-7.4, utilisez le logiciel en libre accès tel que décrit dans le tutoriel en ligne DADA2 précédemment développé trouvé à l'article https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html.gt;.
REMARQUE: Un script R facilement utilisable a été joint en tant que Fichier Supplémentaire 2, et les utilisateurs doivent changer le nom et la source des fichiers de séquençage (par exemple, SAMPLENAME-R1-001.fastq et SAMPLENAME-R2-001.fastq). - Visualisez les profils de qualité de l'avant et de l'inverse à l'aide de la commande plotQualityProfile.
- Couper les nucléotides de l'avant et l'envers se lit en fonction de l'intrigue de qualité. Ces paramètres sont spécifiés par le paramètre truncLen dans DADA2.
REMARQUE: En l'espèce, 280 est utilisé comme seuil de longueur pour lequel les lectures avant seraient écartées, et 260 est utilisé comme seuil de longueur pour lequel les lectures inversées seraient écartées. - Traiter les données brutes 16S comme des fichiers fastq par le pipeline DADA2 comme décrit dans le tutoriel en ligne (trouvé à lt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html -html) pour fusionner R1 et R2 lectures et former des variantes de séquence d'amplicon (ASVs), qui sont ensuite utilisés pour assigner taxa avec la base de données de référence Silva23.
REMARQUE : Un tableau de variante de séquence d'amplicon d'échantillon généré à partir du pipeline DADA2 est inclus dans le fichier supplémentaire 3. Une base de données de référence Greengene ou Silva peut être utilisée, car aucune différence dans la classification bactérienne n'a été trouvée à l'aide de l'une ou l'autre de ces bases de données. - Générer un fichier de cartographie défini par l'utilisateur qui contient les métadonnées (c.-à-d. génotype, sexe, traitement, etc.) pour chaque échantillon. Un exemple de fichier de métadonnées a été inclus dans le fichier supplémentaire 4.
- Calculer la diversité alpha (indice Shannon) et la diversité bêta en utilisant l'analyse des coordonnées principales (PCA) en fonction des comptes oTU raréfiés en utilisant Phyloseq28 comme décrit dans le tutoriel en ligne, trouvé à lt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html.gt;.
- Effectuez l'analyse suivante dans METAGENassist29.
REMARQUE : Effectuez l'analyse de l'abondance différentielle à l'aide du test de la somme de grade Wilcoxon au niveau du genre. Les cartes thermiques et les taxons d'abondance différentielle sont mis en évidence à l'aide de METAGENassist29, un pipeline d'analyse accessible au public et basé sur le Web.- Téléchargez le tableau d'abondance taxonomique (format CSV) et sélectionnez Échantillons dans la colonne.
- Téléchargez le fichier de cartographie (format CSV) et sélectionnez Échantillons d'affilée.
- Sélectionnez Options pour supprimer les variables avec plus de 50% de zéros, et exclure les lectures non affectées et non cartographiées.
- Sélectionnez Options pour normaliser les lignes par somme et enregistrer les colonnes.
- Faites une parcelle de terrain Volcano, PCA ou PLSDA en cliquant sur la même chose dans la colonne de gauche et cliquez sur Supprimer le nom des échantillons pour faire le graphique.
- Effectuez un test t-(si seulement deux groupes) ou ANOVA (si plus de deux groupes) pour visualiser les caractéristiques (bactéries) qui diffèrent entre les groupes. Cliquez sur les fonctionnalités sélectionnées pour visualiser des bactéries spécifiques qui diffèrent d'un groupe à l'autre.
- Cliquez sur Dendrogram ou Heat map pour créer des parcelles respectives. Des analyses supplémentaires, telles que la visualisation d'échantillons par groupes ou les 25 principales fonctionnalités basées sur t-test/ANOVA, peuvent être effectuées.
- Cliquez sur RandomForest pour créer des graphiques montrant les fonctionnalités qui peuvent être utilisées pour la classification. Cliquez sur l'onglet Variance en haut pour créer des graphiques pour les fonctionnalités supérieures qui diffèrent entre/entre les groupes. Cliquez sur Détails de fonctionnalités pour voir une liste de bactéries qui diffèrent d'un groupe à l'autre et cliquez sur chaque bactérie pour créer un résumé graphique de la même.
- Cliquez sur l'onglet Outlier sur le dessus pour visualiser les échantillons qui sont aberrants.
- Enfin, cliquez sur Télécharger et sélectionner soit 1) un fichier zip contenant toutes les analyses effectuées ou 2) les fonctionnalités souhaitées à télécharger. Ce fichier doit être enregistré comme un nom unique et devra être décompressé avant utilisation.
REMARQUE: Pour des tests statistiques détaillés effectués au cours de l'analyse du microbiome, se référer aux travaux de Chen et coll. et Hugerth et al.14,30.
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Representative Results
Comme les molécules de classe II du MHC (HLA chez l'homme) sont des acteurs centraux de la réponse immunitaire adaptative et montrent de fortes associations avec une prédisposition à la SP24,25,26, on a émis l'hypothèse que la molécule de classe II HLA influencerait la composition microbienne intestinale. Par conséquent, des souris dépourvues du gène de classe II de MHC (AE.KO) ou exprimant le gène humain HLA-DQ8 (HLA-DQ8) ont été utilisées pour comprendre l'importance des molécules de classe II de HLA dans la formation de la communauté microbienne intestinale.
Des échantillons fécaux ont été prélevés sur des souris transgéniques AE.KO (n - 16) et HLA-DQ8 (n - 12), de l'ADN bactérien a été extrait et la région V3-V4 du gène 16S rRNA a été amplifiée. La taille de l'amplicon (550 pb) a été confirmée par l'exécution des échantillons sur un gel agarose de 1,5 %(figure 2A, voies 1à6). Une confirmation supplémentaire de la taille de l'amplicon de rRNA 16S (550 pb) a été effectuée en chargeant 1 L du produit PCR1 sur une puce d'électrophorèse à haute sensibilité (Figure 2B, voies 1à7).
Un électrophétoygramme a été généré à partir du produit PCR 16S rRNA, qui a montré des régions de pointe avec des fragments de taille de 550 bp (Figure 2C). Des indices doubles et des adaptateurs de séquençage ont été fixés à l'aide de PCR indexé (PCR2) qui a attribué une identité unique à chaque échantillon et a permis le multiplexage de nombreux échantillons dans une seule course de séquençage MiSeq. La confirmation de l'électrophorèse indexée du rPC a été effectuée par électrophorèse de gel d'agarose(figure 2A, voies 7-12) et une puce d'électrophorèse à haute sensibilité (figure 2B, voies 8-12), Figure 2D]. Tous les échantillons de PCR2 ont été mis en commun, purifiés et chargés sur un séquenceur de nouvelle génération qui a donné vers l'avant R1 et inverse R2 lectures de bonne qualité (Figure 3). La médiane obtenue lit après le filtrage de qualité et le rognage étaient 88.125 (gamme de 9.597-111.848).
L'analyse de l'écologie communautaire a été effectuée à l'aide du pipeline d'analyse DADA2 et visualisée avec Phyloseq et METAGENassist pour démontrer les différences dans la diversité alpha (figure 4) et la diversité bêta (figure 5), ainsi que les différences à la genres et niveaux d'espèces entre les groupes. L'analyse DADA2 a généré un tableau d'abondance avec des valeurs séparées par virgule en format csv, qui a été utilisé pour une analyse plus en aval à l'aide d'une plate-forme Web (c.-à-d. Phyloseq et/ou METAGENassist). Les analyses de diversité alpha et bêta ont été effectuées en fonction des catégories définies par l'utilisateur énumérées dans un fichier de cartographie.
L'analyse de diversité de Shannon a indiqué une diversité alpha inférieure globale pour des souris d'AE.KO comparées aux souris transgéniques de HLA-DQ8 (figure 3). L'ordination avec l'analyse principale des coordonnées a montré un regroupement spatial distinct entre les souris AE.KO et les souris transgéniques HLA-DQ8 (Figure 5). Un tableau d'abondance de DADA2 a également été utilisé pour effectuer une analyse métagénomique complète à l'aide du logiciel en libre accès METAGENassist29. Le regroupement de l'abondance bactérienne (niveau de genre) basé sur la carte thermique(figure 6A)et une parcelle de boîte pour des bactéries spécifiques montrant les différences entre deux groupes (figure 6B) ont été générés à l'aide d'un pipeline METAGENassist.
L'analyse de la carte thermique a montré que certaines bactéries comme Allobacullum, Desufovibrio et Rikenella étaient plus abondantes chez les souris transgéniques HLA-DQ8. En revanche, Biolophila était plus abondant chez les souris AE.KO (Figure 6B). Les abondances relatives de bactéries individuelles (Bilophila et Rikenella) sont indiquées dans une parcelle de boîte représentative (figure 6B). Au total, les données démontrent que les souris AE.KO possèdent une communauté microbienne distincte par rapport à celle des souris transgéniques HLA-DQ8, avec une absence de bactéries spécifiques chez les souris AE.KO. Les données suggèrent également que les molécules de classe II du MHC jouent un rôle important dans l'abondance de certaines bactéries. En résumé, ce protocole simple et détaillé aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre une résolution taxonomique plus élevée.
Figure 1 : Diagramme de flux du séquençage du microbiome intestinal. Toutes les étapes du séquençage du microbiome (collecte d'échantillons à l'analyse des données sur le microbiome) sont affichées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Amplification du gène rRNA 16S et analyse du contrôle de la qualité de la région V3-V4. (A) Image d'électrophorèse de gel d'agarose représentative de l'amplicon 16S (PCR1, taille 550 bp) et pcR indexé (PCR2, taille '630 bp) des souris DE.KO (voies 1-3 et 7-9) et des souris transgéniques HLA-DQ8 (voies 4-6 et 10-12). (B) Image de gel représentatif de l'amplicon 16S (PCR1, taille de 550 pb) et de PCR indexé (PCR2, taille de 630 pb) de souris AE.KO (voies 1-3 et 8-10) et de souris transgéniques HLA-DQ8 (voies 4-7 et 11-12) résolues par électrophorèse. (C) L'électrophétoygramme représentatif de l'amplicon 16S (PCR1) a montré une région de pointe contenant des fragments de taille de 550 pb. (D) L'électrophétogramme représentatif de PCR indexé (PCR2) a montré une région de pointe comprenant des fragments de taille . 630 bp. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Profil de qualité des lectures avant (R1, en haut) pour deux échantillons représentatifs et lectures inverses correspondantes (R2, en bas) pour les mêmes échantillons. L'analyse a été effectuée à l'aide d'un pipeline DADA2, dans lequel l'axe x montre la longueur de lecture (0-300 bases) et l'axe y montre la qualité des lectures. La ligne verte représente le score médian de qualité, tandis que la ligne orange représente les quartiles de la distribution de score de qualité à chaque position de base. Les lectures avant (R1) ont toujours montré une meilleure qualité que les lectures inversées (R2). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Mesures de la diversité alpha (diversité De Shannon) des souris AE.KO et des souris transgéniques HLA-DQ8. Chaque point représente la diversité de la diversité de La diversité de Shannon dans un échantillon d'une seule souris. La diversité de Shannon était globalement plus faible pour des souris aE.KO comparées aux souris transgéniques de HLA-DQ8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Ordination avec parcelle partielle d'analyse de dimension la moins carrée. L'intrigue montre une séparation claire entre les souris AE.KO et les souris transgéniques HLA-DQ8. Chaque point représente la composition bactérienne dans un échantillon, et les éclipses pointillées indiquent des intervalles de confiance de 80%. Les parcelles PLS-DA ont été générées à l'aide de METAGENassist. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Souris d'AE.KO montrant la communauté microbienne distincte comparée aux souris transgéniques de HLA-DQ8, avec une absence de bactéries spécifiques dans les souris d'AE.KO. (A) Carte thermique combinée à un amas hiérarchique agglomérant montrant l'abondance relative des bactéries (niveau de genre). (B) Parcelle de boîte montrant une abondance relative normalisée de deux bactéries représentatives (Bilophila et Rikenella) chez les souris transgéniques AE.KO et HLA-DQ8. Les deux parcelles ont été générées à l'aide de METAGENassist. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1: Image représentative de la boîte de diviseur pour la collecte d'échantillons fécaux de plusieurs souris à la fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dossier supplémentaire 2: DADA2 R-script pour générer table d'abondance à partir de séquences brutes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 3: Tableau représentatif d'abondance de genre (format CSV). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 4: Fichier de cartographie représentatif (format CSV). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole décrit est simple, avec des étapes faciles à suivre pour effectuer le profilage de microbiome utilisant le séquençage métagénomique de rRNA 16S à partir d'un grand nombre de biospécimens d'intérêt. Le séquençage de nouvelle génération a transformé les études sur l'écologie microbienne, en particulier dans les modèles de maladies humaines et précliniques31,32. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à analyser avec succès des compositions microbiennes complexes (microbes culturables et non-culturables) dans un biospécimen donné à un niveau de débit élevé et à un faible coût32. Cependant, plusieurs facteurs (c.-à-d. les effets de lot, la sélection des amorces pour le gène 16S rRNA, et l'analyse de données de séquence) demeurent un obstacle majeur dans l'utilisation répandue de cette technologie.
Les technologies avancées de séquençage MiSeq à base de rRNA 16S (2x300bp)33 permettent le séquençage de 600 nucléotides sur les 1 500 gènes 16S de l'ARN 16S de 16S, qui ont surmonté le goulot d'étranglement antérieur des lectures de séquençage court. Les amorces spécifiques pour une autre région de rRNA telles que V1-V2, V3-V5, ou V6-V9 peuvent être utilisées avec chaque amorce spécifique à la région montrant un certain biais pour la sur- ou la sous-détection de taxons particuliers34,35. Certains groupes préfèrent la région V1-V221, qui montre un biais accru pour Clostridium, mais sous-détection pour certaines espèces de Bacteroidetes. En revanche, d'autres groupes préfèrent les régions V4, V3-V4 et V3-V5, qui démontrent la classification la moins biaisée des taxons bactériens15,20,36,37.
Le protocole actuel utilise des amorces spécifiques pour les régions V3-V4 du gène 16S rRNA, car il couvre la région plus longue de 16S rRNA avec deux régions hypervariables (V3 et V4) par rapport à V4 seul. En outre, l'amplicon spécifique V3-V4 permet la fusion des lectures vers l'avant (R1) et inverse (R2), conduisant à une meilleure résolution de la classification bactérienne. Bien que la région V3-V5 offre des lectures plus longues et couvre des régions plus hypervariables (V3, V4 et V5), il est difficile de fusionner les lectures R1 et R2 en raison de l'absence de / peu de régions qui se chevauchent entre R1 et R2 lectures. Par conséquent, un certain nombre d'études ont utilisé des données provenant uniquement des lectures R1 pour la classification bactérienne lors de l'exécution du séquençage métagénomique 16S rRNA en utilisant la région V3-V514.
Un stockage et une manipulation appropriés des biospécimens sont essentiels à l'analyse du microbiome afin d'éviter la dégradation de l'ADN bactérien ou la contamination de l'environnement38. Le stockage à long terme des biospécimens à RT ou à 4 oC peut entraîner une prolifération de certaines bactéries ou champignons. Les échantillons peuvent être congelés immédiatement ou transportés à 4 oC (pendant 1 à 3 jours), puis congelés. Les biospécimens peuvent également être stockés directement dans des agents de conservation tels que la solution de stabilisation de l'acide nucléique (p. ex., ARN-later), 95 % d'éthanol ou une trousse de stockage commercial. Le consensus général est que l'une ou l'autre de ces méthodes de stockage ne cause pas de différences significatives dans les profils des communautés bactériennes39,40. Bien qu'une solution avec des agents de conservation permet le stockage et le transport à RT, ces échantillons ne peuvent pas être utilisés pour des essais à base d'ARN, des analyses de métabolites, ou des expériences de transplantation fécale. Ces questions ont été discutées en détail ailleurs39,40.
L'une des étapes critiques de ce protocole est l'utilisation d'une méthode à base de perles pour la perturbation mécanique des bactéries gram-positives et archées. Une étude antérieure a montré la plus grande diversité bactérienne utilisant la méthode à base de perles par rapport à d'autres méthodes de lyse cellulaire41. Une lyse bactérienne incomplète ou une contamination lors de l'extraction de l'ADN peut introduire un biais dans les données sur le microbiome intestinal42. Un autre point important à considérer est la contamination due aux réactifs de laboratoire inclus dans les kits appelés le kitome43,44,45. Les échantillons avec une grande biomasse et une riche diversité bactérienne comme le sol ou les excréments montrent moins de ces problèmes que les échantillons à faible biomasse comme la peau. Par conséquent, un contrôle de l'extraction de l'eau devrait être inclus à chaque extraction et traité avec d'autres échantillons afin d'identifier l'introduction d'une contamination potentielle due à l'extraction d'ADN43,44,45.
Dans l'analyse du microbiome, la diversité au sein d'un échantillon peut être mesurée par la diversité alpha, une mesure de la richesse des espèces, ou la diversité bêta, qui estime les différences entre les échantillons/ groupes. Les méthodes les plus populaires pour mesurer la diversité comprennent UniFrac (pondérée et non pondérée) couplée à des techniques statistiques multivariées telles que l'analyse des coordonnées principales (PCoA) ou la dissemblance de Brey-Curtis. Alors qu'UniFrac est basé sur les distances phylogénétiques, l'analyse de la dissemblance Brey-Curtis utilise l'abondance bactérienne pour générer des parcelles. Des descriptions détaillées au sujet de l'iare de la diversité et de la diversité ont discuté ailleurs30,46,47. Un certain nombre de méthodes statistiques peuvent être utilisées pour comparer les différences dans les communautés microbiennes entre les groupes14,48. Il est conseillé d'utiliser des p-values ajustées au lieu de p-values brutes pour corriger pour les tests multiples14.
Il existe une variété de logiciels de bioinformatique pour analyser les données de séquençage ciblée indépendamment49. Le protocole proposé utilise des progiciels libres basés sur R, ce qui permet un profilage rapide et convivial des taxons bactériens par le biais de pipelines DADA2 basés sur R. Le tableau d'abondance généré par DADA2 peut être utilisé pour l'analyse en aval à l'aide de phyloseq et METAGENassist. Le pipeline DADA2 est avantageux par rapport à QIIME parce qu'il ne nécessite pas de caractéristiques spéciales (c.-à-d. l'installation de machines virtuelles ou de conteneurs Docker), qui nécessitent des ressources informatiques relativement importantes et une expertise technique spéciale. Surtout pour les débutants à l'analyse 16S, R est attrayant, car il est gratuit et permet aux utilisateurs de profiter de tutoriels en ligne accessibles et des scripts d'analyse qui sont faciles à exécuter. Il est important de noter que ces outils d'analyse nécessitent des ressources de calcul relativement faibles et peuvent être exécutés sur un PC, Un Macintosh ou une plate-forme Linux. En outre, METAGENassist peut utiliser des tableaux d'abondance générés par les pipelines DADA2 ainsi que des fichiers de matrice d'observation biologique (BIOM) générés par QIIME/MG-RAST pour effectuer des analyses telles que PCA, analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLS-DA), parcelles volcaniques, t-tests(comparant deux groupes), ANOVA (comparant trois groupes ou plus), parcelles de cartes thermiques, analyse forestière aléatoire, etc. METAGENassist a été trouvé très convivial.
En résumé, ce protocole décrit un simple pipeline de profilage métagénomique 16S, avec un guide détaillé sur la collecte d'échantillons, l'extraction d'ADN, la préparation de la bibliothèque métagénomique, le séquençage sur Illumina MiSeq, et l'analyse des données conviviale utilisant librement plates-formes disponibles (c.-à-d. DADA2, phyloseq et METAGENassist). Bien que le profilage taxonomique métagénomique 16S est fiable pour la caractérisation des bactéries présentes en particulier les biospécimens, le séquençage métagénomique de fusil de chasse peut être une meilleure approche pour l'analyse métabolique détaillée de voie et la souche-spécifique l'identification bactérienne.
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Disclosures
A. M. a reçu des redevances de la Mayo Clinic (payée par Evelo Biosciences) comme l'un des inventeurs d'une technologie revendiquant l'utilisation de Prevotella histicola pour le traitement des maladies auto-immunes.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le financement du NIAID/NIH (1R01AI137075-01), de la Carver Trust Medical Research Initiative Grant et du Centre de recherche en sciences de la santé environnementale de l'Université de l'Iowa, nieHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
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