Summary
Описана упрощенная стандартная операционная процедура профилирования микробиома с использованием метагеномного секвенирования и анализа 16S rRNA с использованием свободно доступных инструментов. Этот протокол поможет исследователям, которые являются новыми для области микробиома, а также тех, кто требует обновления методов для достижения бактериального профилирования с более высоким разрешением.
Abstract
Кишечник человека колонизирован триллионами бактерий, которые поддерживают физиологические функции, такие как метаболизм продуктов питания, сбор энергии и регуляция иммунной системы. Возмущение здорового микробиома кишечника было предложено играть определенную роль в развитии воспалительных заболеваний, в том числе рассеянного склероза (МС). Экологические и генетические факторы могут влиять на состав микробиома; таким образом, выявление микробных сообществ, связанных с фенотипом болезни, стало первым шагом на пути к определению роли микробиома в здоровье и болезнях. Использование 16S rRNA метагеномных секвенирования для профилирования бактериального сообщества помогло в продвижении микробиома исследований. Несмотря на широкое использование, не существует единого протокола для анализа таксономического профилирования на основе 16S rRNA. Другим ограничением является низкое разрешение таксономического назначения из-за технических трудностей, таких как меньшее секвенирование читает, а также использование только вперед (R1) читает в конечном счете из-за низкого качества реверса (R2) читает. Существует необходимость в упрощенном методе с высоким разрешением для характеристики бактериального разнообразия в данном бионезоле. Достижения в области технологии секвенирования с возможностью секвенирования более длинных считываемых с высоким разрешением помогли преодолеть некоторые из этих проблем. Современная технология секвенирования в сочетании с общедоступным метагеномным анализом трубопровода, такого как R-основанный раскол Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) помогла продвинуть микробное профилирование с высоким разрешением, так как DADA2 может назначить последовательность в роду и видов. Описано здесь руководство для выполнения бактериального профилирования с использованием двухступенчатого усиления V3-V4 области гена 16S rRNA, а затем анализ с использованием свободно доступных инструментов анализа (т.е., DADA2, Phyloseq, и METAGENassist). Считается, что этот простой и полный рабочий процесс послужит отличным инструментом для исследователей, заинтересованных в проведении исследований микробиома профилирования.
Introduction
Микробиота относится к коллекции микроорганизмов (бактерий, вирусов, археев, бактериофагов и грибов), живущих в определенной среде, и микробиом относится к коллективному геному резидентных микроорганизмов. Как бактерии являются одним из наиболее распространенных микробов у людей и мышей, это исследование сосредоточено только на бактериальных профилирования. Кишечник человека колонизирован триллионами бактерий и сотнями бактериальных штаммов1. Нормальная микрофлора кишечника играет жизненно важную роль в поддержании здорового состояния у хозяина путем регулирования функций (т.е. поддержания нетронутого кишечного барьера, пищевого метаболизма, энергетического гомеостаза, ингибирования колонизации патогенными организмами, и регуляция иммунных реакций)2,3,4,5. Композиционные возмущения микрофлоры кишечника (китидисковый дисбактериоз) были связаны с рядом заболеваний человека, включая желудочно-кишечные расстройства6,ожирение7,8,инсульт9, рак10, диабет8,11, ревматоидный артрит12, аллергии13, и центральной нервной системы, связанных с заболеваниями, такими как рассеянный склероз (MS)14,15 и болезнь Альцгеймера болезни (Ад)8,16. Поэтому в последние годы растет интерес к инструментам для определения бактериального состава на различных участках тела. Надежный метод должен иметь такие характеристики, как высокая пропускная способность и простота в использовании, способность классифицировать бактериальную микробиоту с высоким разрешением и быть недорогой.
Микробиологические методы, основанные на культуре, недостаточно чувствительны, чтобы выявить и охарактеризовать сложный микрофлору кишечника из-за неспособности нескольких кишечных бактерий расти в культуре. Появление технологии на основе секвенирования, особенно 16S rRNA основе метагеномного секвенирования, преодолелнекоторые некоторые из этих проблем и преобразованы микробиом исследования17. Расширенная технология секвенирования на основе 16S rRNA помогла установить важнейшую роль микрофлоры кишечника в здоровье человека. Проект микробиома человека, инициатива18Национальных институтов здравоохранения и проект MetaHIT (европейская инициатива)19 помогли в создании базовой основы для анализа микробиома. Эти инициативы помогли начать многочисленные исследования для определения роли микрофлоры кишечника в здоровье и болезнях человека.
Ряд групп показали дисбактериоз кишечника у пациентов с воспалительными заболеваниями12,14,15,20,21,22. Несмотря на широкое использование для таксономического профилирования из-за способности к мультиплексу и низким затратам, не существует единых протоколов для таксономического профилирования на основе 16S rRNA. Другим ограничением является низкое разрешение таксономического назначения из-за меньшего секвенирования считывает (150 bp или 250 bp) и использования только вперед секвенирования читать (R1) из-за низкого качества обратного секвенирования читает (R2). Тем не менее, достижения в области технологии секвенирования помогли преодолеть некоторые из этих проблем, таких как способность последовательности больше читает с помощью парного конца читает (например, Illumina MiSeq 2x300bp).
Нынешняя технология секвенирования может секвенировать 600 bp хорошего качества читает, что позволяет слияние R1 и R2 читает. Эти слитые более длинные R1 и R2 считывания позволяют улучшить таксономические назначения, особенно с платформой с открытым доступом R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2). DADA2 использует ампликонпоследовательности вариант (ASV) на основе назначений вместо оперативной таксономической единицы (OTU) назначения на основе 97% сходства используется в ЦИМЕ23. AsV матчи приводят к точной последовательности в базе данных в пределах 1-2 нуклеотидов, что приводит к назначению на уровне рода и видов. Таким образом, сочетание более длинных, качественных парных считываемых и более эффективных таксономических инструментов назначения (таких как DADA2) преобразовало исследования микробиома.
Приведено здесь пошаговым руководством для выполнения бактериального профилирования с использованием двухступенчатого усиления V3-V4 области 16S rRNA и анализа данных с использованием DADA2, Phyloseq, и METAGENassist трубопроводов. Для этого исследования используются человеческие лейкоцитные антигены (HLA) II трансгенных мышей класса, так как некоторые аллели HLA класса II связаны с предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям, таким как MS20,24,25. Однако, важность генов класса HLA II в регулировании состава кишечной микробиоты неизвестна. Предполагается, что молекула HLA класса II будет влиять на кишечное микробное сообщество, выбирая для конкретных бактерий. Основной комплекс гистосовместимости (MHC) класса II нокаут мышей (AE.KO) или мышей, выражающих человеческие молекулы HLA-D-8 (HLA-D'8)24,25,26 были использованы для того, чтобы понять важность HLA класса II молекул в формирование кишечного микробного сообщества. Считается, что этот полный и упрощенный рабочий процесс с R-анализом данных послужит отличным инструментом для исследователей, заинтересованных в проведении исследований микробиома.
Поколение мышей не хватает эндогенных мурин MHC класса II генов (AE.KO) и AE-/-. HLA-D'A1'0103, D'B1'0302 (HLA-D'8) трансгенных мышей с C57BL/6J фон был описан ранее26. Образцы фекальных образцов собираются у мышей обоих полов (8-12 недель). Мыши были ранее выведены и поддерживается в Университете штата Айова животных объекта в рамках NIH и институциональных руководящих принципов. Стратегии контроля загрязнения, такие как отляг мышей внутри ламинарного шкафа потока, изменение перчаток между различными штаммами мышей, и надлежащее содержание мышей являются критическими шагами для профилирования микрофлоры кишечника.
Надлежащее индивидуальное защитное оборудование (PPE) настоятельно рекомендуется в течение всей процедуры. Соответствующие негативные меры контроля должны быть включены при выполнении мер по изоляции ДНК, усилению ПЦР1 и ПЦР2 и последовательности. Рекомендуется использовать стерильные, dNase-free, RNase-free, и pyrogen-free supplies. Назначенный пипеттор для работы микробиома и фильтрованные советы пипетки должны использоваться во всем протоколе. Анализ микробиоты состоит из семи этапов: 1) сбор и обработка фекальных образцов; 2) экстракция ДНК; 3) усиление гена 16S rRNA; 4) конструкция библиотеки ДНК с использованием индексированного ПЦР; 5) очистка и количественная оценка индексируемого ПЦР (библиотека); 6) секвенирование MiSeq; и 7) обработка данных и анализ последовательности. Схематическая диаграмма всех этапов протокола отображается на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Айовы.
1. Фекальные сбор ые образца и обработка
- Стерилизовать разделитель ные ящики (см. Таблицу материалов, Дополнительная рисунок 1) с 70% этанола.
- Предварительно метка микроцентрифуговых труб (по одному на мышь) с идентификатором образца и группой обработки (если это применимо).
- Поместите мышей в стерилизованные ящики делителя и дайте им испражняться нормально до 1 ч.
- Соберите фекальные гранулы в пустой, предварительно помеченной 1,5 мл микроцентрифуговой трубки с помощью стерильных щипочек и закройте трубку надежно. Стерилизовать щипточки после сбора с каждой мыши.
- Поместите микроцентрифугную трубку, содержащую фекальные гранулы, в морозильную камеру -80 градусов до дальнейшей обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коробки разделителя являются выгодными, поскольку они позволяют одновременно йогаетировать образцы фекалий у нескольких мышей (до 12) одновременно.
2. Извлечение ДНК
- Удалите фекальные образцы (мышь или человека) из морозильной камеры и оттаивайте при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется разморозить образцы стула человека на ночь при 4 градусах по Цельсию по мере необходимости для сбора 200 мг или необходимого количества из образцов запасов. - Используйте 200 мг исходных материалов и элитной ДНК до конечного объема в 50 л.
- Включите набор изоляции ДНК пустой, в котором не фекальный образец добавляется, но обрабатывается через все шаги экстракции ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Специфический набор изоляции ДНК (см. Таблица материалов) был использован, так как он содержит специфические реагенты для удаления ингибирующих материалов, таких как биосолисты, непереваренный растительный материал и соединения гема из лизинированных красных кровяных клеток, присутствующих в стуле человека и мыши Образцы. - Поместите трубку из биса в гомогенизатор (см. Таблицу Материалов)и гомогенизуйте образцы на 45 с на RT и скорость 4,5 м/с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бисобить гомогенизатор от любого производителя могут быть использованы. Тем не менее, рекомендуется стандартизировать метод, в частности, скорость и продолжительность гомогенизации, при использовании бис-избиения гомогенизатор от другого поставщика. - Изолировать ДНК из отдельных образцов машки фекальные с помощью бактериального комплекта изоляции ДНК после протокола производителя (см. Таблица материалов) с незначительными изменениями. Количественно выделение изолированной ДНК путем загрузки 1 Зл ДНК на фторметр или на чип электрофорекс высокой чувствительности (см. Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход ДНК может варьироваться от 500-2500 нг, когда начиная с 200 мг фекального образца. - Отрегулируйте концентрацию ДНК до 4-20 нг/л с помощью буфера elution. Реквантифицировать ДНК (как это делается в шаге 2.5), прежде чем приступить к 16S rRNA усиление гена (PCR1), если PcR1 не выполняется в тот же день.
3. 16S rRNA усиление гена (PCR1)
- Настройка 16S rRNA усиление гена (PCR1) в 96 хорошо ПЦР пластины с использованием 25 л объем реакции.
- Используя многоканальную пипетку, добавьте 12,5 л 2-х высокой точности полимеразной ферментной смеси, включая буфер, в дополнение к dNTPs (см. Таблица материалов):40 нг ДНК в до 10,5 л общего объема (настроить общий объем с помощью воды класса ПЦР): 1 Л (каждый) вперед и обратные грунтовки при концентрации 1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности грунтовок таковы:
вперед праймер 5'-TCGTGGCAGCGTCA GATGTGTATAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' обратный грунт No 5'-GTCTCGGGGCCGGGAGGATGTA TaAGAGCACAACTACHVGGGTATTAATC C-3'. Включите сжалкую комплект из шага 2.3 (контроль реагента комплекта) в пластине ПЦР. - Печать пЦР пластины и центрифуги на 1000 х г при 20 градусов по Цельсию в течение 1 мин в столешной плите центрифуги (см. Таблица материалов) и выполнять ПЦР в тепловой цикл, запрограммированный на: 95 кв кв в течение 3 мин; 25 циклов по 1) 95 градусов по Цельсию на 30 с, 2) 55 градусов по Цельсию на 30 с, 3) 72 градуса по Цельсию на 30 с; окончательное расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 5 мин; и удерживайте при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот метод усиления гена 16S rRNA должен работать с различными типами биоспеционаторов, рекомендуется стандартизировать количество циклов усиления при запуске нового проекта. - Подтвердите размер продукта ПЦР1, загрузив 1 зл ДНК на чип электрофореза высокой чувствительности. Кроме того, запустить 5 зЛ 16S rRNA-усиленный продукт на 1,5% агарозный гель, чтобы подтвердить 550 bp продукта PCR1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка усиливаемого продукта 16S rRNA является необязательной и зависит от используемого комплекта/метода изоляции ДНК. При использовании внутреннего метода изоляции ДНК, продукт PCR1 может быть очищен с использованием комплекта очистки ДНК микробиома в рамках протокола производителя (см. Таблица материалов). Используемый здесь комплект изоляции ДНК дает ультрачистую ДНК и не требует очистки продукта ПЦР1.
4. Строительство библиотеки ДНК с использованием индексированных ПЦР (PCR2)
-
Поместите индекс 1 и индекс 2 штрих-кодами в специальную стойку (см. Таблицу Материалов) для 96 библиотек.
- Упорядочить индекс 1 праймер в столбцах 1-12 и индекс 2 грунтовки в строках A-H специальной стойки.
- Добавьте 2,5 зл и l индекса 1 в столбцы 1-12 и индекс 2 грунтовки в строках A-H с помощью многоканальных пипетков. Поместите новую крышку (см. Таблицу Материалов) на Индекс 1 и Индекс 2 усыновителей праймеры и хранить его в морозильной камере -20 градусов.
- Используя многоканальный пипетки, добавьте 12,5 зл и л из 2-х высокой точности полимеразной ферментной смеси, содержащей буфер, в дополнение к dNTPs(см. Таблица материалов); 5 зЛ воды класса ПЦР и 2,5 л 16С rRNA-усиленного продукта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте уникальные индексы к каждому образцу для мультиплексирования более 96 библиотек за один запуск, как описано в Kiernan et al.27. В настоящем протоколе используются адаптеры из коммерческого комплекта (например, Nextera XT Index Kit) в соответствии с инструкцией производителя, предусмотренной методом секвенирования метагеномики 16S (например, Illumina). - Печать и центрифуга индексируемой пЦР пластины на 1000 х г при 20 градусах по Цельсию в течение 1 мин и выполнять ПЦР в тепловой цикл, запрограммированный на: 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин; 8 циклов из 1) 95 градусов по Цельсию на 30 с, 2) 55 градусов по Цельсию на 30 с, 3) 72 градуса по Цельсию на 30 с; и окончательное расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
- Подтвердите размер 630 базового проиндексированного продукта ПЦР, загрузив 1 зл ДНК на чип электрофоразвысокой высокой чувствительности. Кроме того, запустите 5 зЛ индексируемого пЦР-продукта на 1,5% геля агарозы, чтобы подтвердить размер и интенсивность продукта.
5. Очистка индексированных ПЦР (ПЦР2) и количественная оценка
- Бассейн 5 ЗЛ ампликона PCR2 с использованием многоканальных пипетков из каждой скважины в многоканальный лоток резервуара, свободный от обнаруживаемых DNase, RNase, ДНК человека и пирогенных бактерий (см. Таблица Материалов).
- Перенесите объединенный продукт из многоканального лотка резервуара в пустую, предварительно маркированную микроцентрифугную трубку и вихрь мощностью 1,5 мл.
- Очистите продукт PCR2 с помощью стандартного комплекта магнитных бусин(см. Таблица Материалов) в рамках инструкции производителя. Печать и хранить оставшиеся 20 qL ПЦР2 в той же пластине при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования, если это необходимо.
- Приготовьте свежий 80% этанола, добавив 4 мл 100% этанола до 1 мл воды класса ПЦР.
- Уравновесите магнитный шарик к RT и вихрь в течение 30 с, чтобы равномерно разогнать бусины.
- Кратко вихрь и спина вниз объединенных образцов амплекона PCR2.
- Добавьте 80 л магнитных бусин октядрий в предварительно маркированную, стерильную микроцентрифуговую трубку 1,5 мл с 80 злицу объединенных продуктов ПЦР, затем вихрь и ненадолго свернуть, чтобы равномерно переостереть магнитные бусы.
- Инкубировать содержимое на RT, не нарушая трубки в течение 15 минут.
- Поместите трубку с ДНК и магнитными бусинками на магнитной подставке(см. Таблица Материалов) в течение 5 мин.
- Тщательно удалите и отбросьте 150 зл супернатанта.
- Добавьте 200 л свежеприготовленного 80% этанола, не нарушая шарики и инкубировать в течение 30 с.
- Тщательно удалить, и отбросить все супернатант.
- Повторите шаги 5.11-5.12. Удалите оставшийся том с помощью пипетки P10. Разрешить бусины воздуха сухой в течение 15 минут, с индексом ПЦР трубки, оставшиеся на магнитной подставке.
- Снимите с магнитной стойки. Добавьте 33 зЛ буфера элуции (буфер элюции набора ДНК является приемлемым). Vortex хорошо, и выполнить быстрый спин, чтобы удалить все оставшиеся жидкости на стороне. Инкубировать в течение 2 мин и поставить на магнитную трибуну в течение 5 минут.
- Передача 30 злител супернатанта (чистых продуктов ПЦР) в предварительно маркированную микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
- Количественно очищенный бассейн, загрузив 1 зл и 1 л очищенного бассейна на фторметр или чип электрофорез высокой чувствительности, так как это потребуется во время секвенирования. Выполните MiSeq, как описано ниже.
6. Секвенирование MiSeq
- Создайте образец листа, содержащего информацию о штрих-коде для метагеномики рабочего процесса и демультиксирования на инструменте MiSeq(см. Таблица материалов). Загрузите этот образец в программное обеспечение (например, Illumina Experiment Manager).
- Разбавить объединенные библиотеки от шага 5.15 до 4 нм.
- Денатурная объединила библиотеки, объединив 5 qL из 4 нМ библиотечного бассейна с 5 qL свежеприготовленных 0,2 М НаОХ в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки. Вихрь кратко смешать, центрифуга кратко и инкубировать в течение 5 минут на окружающем RT.
- Добавьте 990 л ледяного буфера гибридизации (HB буфер) и пипетку осторожно перемешать. Это даст 20 pM библиотеки.
- Объедините 2 qL из 10 nM библиотеки управления с 3 qL буфера EBT (10 mM Tris-HCl, рН 8.5, с 0.1% Tween 20) для того чтобы дать библиотеку управления 4 nM. Добавьте 5 л свежеприготовленных 0,2 N NaOH и вихрь кратко перемешать. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
-
Добавьте 990 йл ледяной буфер гибридизации (HB буфер) и пипетки осторожно, чтобы смешать. Это даст 20 библиотек управления pM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Денатурированные 20 pM библиотек управления могут храниться при -20 градусах Цельсия до 4 недель. Через 4 недели число кластеров, как правило, уменьшается.- Объедините 210 л библиотеки 20 pM с 40 юл из 20 pM библиотеки управления (окончательная концентрация - 18%), и добавьте 350 qL буфера HB. Загрузите библиотеку в конечной концентрации 7 pM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Детали ввода должны быть скорректированы в процентах от производительности выполнения.
- Объедините 210 л библиотеки 20 pM с 40 юл из 20 pM библиотеки управления (окончательная концентрация - 18%), и добавьте 350 qL буфера HB. Загрузите библиотеку в конечной концентрации 7 pM.
- Инкубировать образцы в течение 2 мин при 96 градусах Цельсия. Положить на лед в течение 5 мин. Загрузите 600 qL конечного бассейна в соответствующую скважину картриджов MiSeq.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 6 выше может быть выполнен на геномном / ДНК основной объект.
7. Обработка данных и анализ последовательности
- Используйте программное обеспечение R (версия 3.5) для обработки и анализа данных DADA2. Для шагов 7.1-7.4, используйте программное обеспечение открытого доступа, как указано в ранее разработанном DADA2 онлайн учебник найти на lt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html.gt.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легко пригодится R-скрипт в качестве дополнительного файла 2,и пользователи должны изменить имя и источник секвенирующих файлов (например, SAMPLENAME-R1'001.fastq и SAMPLENAME-R2'001.fastq). - Визуализируйте качественные профили передних и обратных считываемых с помощью команды plotQualityProfile.
- Обрезка нуклеотидов с переднего и обратного считывает на основе качественного сюжета. Эти параметры определяются параметром truncLen в DADA2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь 280 используется в качестве порога длины, для которого считывается форвард, и 260 используется в качестве порога длины, для которого будет отбрасываться обратный считыванный. - Обработка сырья 16S данных, как fastq файлов по трубопроводу DADA2, как указано в онлайн-учебник (найдено на lt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html такса с базой данных ссылки Сильва23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица варианта последовательности ампликонов образца, генерируемая из конвейера DADA2, включена в качестве дополнительного файла 3. Можно использовать справочную базу данных Greengene или Silva, поскольку с использованием любой из этих баз данных не было обнаружено различий в бактериальной классификации. - Создание пользовательского картографируемого файла, содержащего метаданные (например, генотип, пол, лечение и т.д.) для каждого образца. Пример файла метаданных был включен в качестве дополнительного файла 4.
- Рассчитайте альфа-разнообразие (индекс Шеннона) и бета-разнообразие с помощью анализа основных координат (PCA) на основе разреженных отсчетов OTU с использованием Phyloseq28, как указано в онлайн-учебнике, найденном на сайте zlt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html.gt.
- Выполните следующий анализ в METAGENassist29.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните дифференциальный анализ изобилия, используя рейтинговый тест Уилкоксона на уровне рода. Тепловые карты и дифференциально обильные таксоны выделены с помощью METAGENassist29, общедоступный и веб-анализ трубопровода.- Загрузите таблицу таксономического изобилия (формат CSV) и выберите Образцы в столбце.
- Загрузите файл отображения (формат CSV) и выберите Образцы в строке.
- Выберите Параметры для удаления переменных с более чем 50% нулей и исключения неназначенных и неотображеных считываемых.
- Выберите Параметры для нормализации строк по сумме и нормализует столбцы журнала.
- Сделать вулкан, PCA, или PLSDA участок, нажав то же самое в левой колонке и нажмите Удалить образцы имя, чтобы сделать график.
- Выполните t-тест(если только две группы) или ANOVA (если больше двух групп), чтобы визуализировать особенности (бактерии), которые отличаются между группами. Нажмите Избранные функции, чтобы визуализировать конкретные бактерии, которые отличаются между группами.
- Нажмите Dendrogram или тепловую карту для создания соответствующих участков. Дополнительный анализ, такой как визуализация образцов по группам или t-test/ANOVA-на основе 25 функций, может быть выполнен.
- Нажмите RandomForest, чтобы создать графики, показывающие функции, которые могут быть использованы для классификации. Нажмите на вкладку «Варианс» сверху, чтобы создать графики для верхних объектов, которые отличаются между группами. Нажмите Подробная информация о функциях, чтобы увидеть список бактерий, которые отличаются между группами и нажмите каждой бактерии, чтобы создать графическое резюме того же.
- Нажмите на вкладку Outlier сверху, чтобы визуализировать образцы, которые являются выбросами.
- Наконец, нажмите Скачать и выбрать либо 1) почтовый файл, содержащий все анализ выполняется или 2) желаемые функции для загрузки. Этот файл должен быть сохранен как уникальное имя и должен быть расстегнут перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробных статистических тестов, проведенных во время анализа микробиома, обратитесь к работам Чэнь и др. и Hugerth et al.14,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как MHC класса II молекул (HLA у людей) являются центральными игроками в адаптивной иммунной реакции и показать сильные ассоциации с предрасположенностью к MS24,25,26, было предисегоценно, что HLA класса II молекулы II молекулы повлияет на состав кишечника микробов. Таким образом, мыши, не имеющие гена КЛАССА II MHC (AE.KO) или выражающие человеческий ген HLA-D-8 (HLA-D-8), были использованы, чтобы понять важность молекул класса HLA II в формировании микросообщества кишечника.
Фекальные образцы были взяты из AE.KO (n No 16) и HLA-D-8 (n No 12) трансгенных мышей, бактериальная ДНК была извлечена, и V3-V4 области 16S rRNA ген был усилен. Размер ампликона (550 bp) был подтвержден запуском образцов на 1,5% агарозный гель(рисунок 2A, полосы 1-6). Дальнейшее подтверждение размера ампликона 16S rRNA (550 bp) было выполнено путем загрузки 1 зЛ продукта PcR1 на чип электрофорез высокой чувствительности(рисунок 2B, полосы движения 1-7).
Электроферограмма была создана из 16S rRNA PCR продукт, который показал пиковых регионов с фрагментами размером 550 bp(рисунок 2C). Двойные индексы и адаптеры секвенирования были присоединены с помощью индексированного ПЦР (PCR2), которые присваивали каждому образцу уникальную идентичность и позволяли мультиплексировать многие образцы в одном диапазоне секвенирования MiSeq. Подтверждение индексируемого ПЦР было выполнено агарозным гелем электрофорусом(рисунок 2А, полосы 7-12)и чипом электрофораса высокой чувствительности(рисунок 2B, полосы 8-12), Рисунок 2D. Все образцы из PCR2 были объединены, очищены и загружены на секвенсор следующего поколения, который дал вперед R1 и обратный R2 читает хорошего качества(рисунок 3). Медианные полученные считывания после качественной фильтрации и обрезки составили 88 125 (диапазон 9 597–111 848).
Анализ экологии сообщества был проведен с использованием анализа DADA2 трубопровода и визуализированы с Phyloseq и METAGENassist, чтобы продемонстрировать различия в альфа-разнообразия (Рисунок 4) и бета-разнообразие(рисунок 5), а также различия на уровня хвоидок и видов между группами. Анализ DADA2 создал таблицу изобилия с запятой разделенных значений в формате csv, которая использовалась для дальнейшего анализа вниз по течению с помощью веб-платформы (т.е. Phyloseq и/или METAGENassist). Анализ альфа- и бета-разнообразия проводился на основе определенных пользователями категорий, перечисленных в картографиальном файле.
Шеннон разнообразие анализа показали общее снижение альфа-разнообразия для а.Е.КО мышей по сравнению с HLA-D-8 трансгенных мышей (Рисунок 3). Рукоположение с основным анализом координат показало отчетливое пространственное скопление между мышами AE.KO и трансгенными мышами HLA-D-8(рисунок 5). Таблица изобилия от DADA2 также использовалась для выполнения комплексного метагеномного анализа с использованием программного обеспечения открытого доступа METAGENassist29. Тепловая карта на основе кластеризации бактериального изобилия (уровень рода)(Рисунок 6A) и окно участок для конкретных бактерий, показывающих различия между двумя группами (Рисунок 6B) были созданы с использованием METAGENassist трубопровода.
Анализ тепловой карты показал, что некоторые бактерии, такие как Allobacullum, Desufovibrio и Rikenella были более обильными в трансгенных мышах HLA-D-8. В отличие от этого, биолофила была более обильной у мышей AE.KO(рисунок 6B). Относительное изобилие отдельных бактерий(Bilophila и Rikenella) показано в репрезентативном участке коробки(рисунок 6B). В целом, данные показывают, что мыши AE.KO обладают отчетливым микробным сообществом по сравнению с трансгенными мышами HLA-D-8, с отсутствием специфических бактерий у мышей AE.KO. Данные также свидетельствуют о том, что молекулы класса II MHC играют важную роль в изобилии некоторых бактерий. Таким образом, этот простой и подробный протокол поможет исследователям, которые являются новыми для области микробиома, а также тех, кто нуждается в обновлении методов для достижения более высокого таксономического разрешения.
Рисунок 1: Диаграмма потока секвенирования микрофлоры кишечника. Отображаются все этапы секвенирования микробиома (сбор образцов для анализа данных о микробиоме). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: 16S rRNA усиление гена и анализ контроля качества V3-V4 региона. (A) Представитель агарозный гель электрофорез изображение 16S ампликон (PCR1, размер 550 bp) и индексированный ПЦР (PCR2, размер 630 bp) от мышей AE.KO (полосы 1-3 и 7-9) и HLA-D'8 трансгенных мышей (полосы 4-6 и 10-12). (B) Представитель геля изображение 16S ампликон (PCR1, размер 550 bp) и индексированные ПЦР (PCR2, размер 630 bp) мышей AE.KO (полосы 1-3 и 8-10) и HLA-D-8 трансгенных мышей (полосы 4-7 и 11-12) решена электрофорезом. (C) Представитель электроферограмма 16S ампликон (PCR1) показал пиковый регион, содержащий фрагменты, которые были размером 550 bp. (D) Представитель электроферограмма индексированных ПЦР (PCR2) показал пиковую область, состоящую из фрагментов размера 630 bp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Профиль качества переднего считываемого (R1, top) для двух репрезентативных образцов и соответствующего обратного считываемого (R2, bottom) для одних и тех же образцов. Анализ проводился с помощью конвейера DADA2, в котором x-ось показывает длину чтения (0-300 оснований) и y-axis показывает качество считываемых. Зеленая линия представляет среднюю оценку качества, в то время как оранжевая линия представляет квартилы распределения оценки качества в каждой базовой позиции. Форвард читает (R1) всегда показал лучшее качество, чем обратный читает (R2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Альфа-разнообразие мер (Шеннон разнообразие) а.Е.КО мышей и HLA-D-8 трансгенных мышей. Каждая точка представляет разнообразие (Шеннон разнообразие) в образце из одной мыши. Разнообразие Шеннона было в целом ниже для мышей AE.KO по сравнению с трансгенными мышами HLA-D'8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Рукоположение с частично наименьшим именьшим количеством квадратов на основе анализа измерений. Сюжет показывает четкое разделение между мышами AE.KO и трансгенными мышами HLA-D-8. Каждая точка представляет бактериальный состав в образце, а пунктирные затмения указывают на 80% доверительных интервалов. Участки PLS-DA были созданы с помощью METAGENassist. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Мыши AE.KO, показывающие различные микробные сообщества по сравнению с трансгенными мышами HLA-D-8, с отсутствием специфических бактерий у мышей AE.KO. (A) Тепловая карта в сочетании с агломеративной иерархической кластеризации, показывающей относительное изобилие бактерий (уровень рода). (B) Участок коробки, показывающий нормализованное относительное изобилие двух репрезентативных бактерий(Bilophila и Rikenella) в AE.KO и трансгенных мышах HLA-D-8. Оба сюжета были сгенерированы с помощью METAGENassist. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Представитель изображение ящика разделителя для сбора фекальных образцов от нескольких мышей одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 2: DADA2 R-скрипт для генерации таблицы изобилия из необработанных последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Таблица изобилия представительного рода (формат CSV). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 4: Файл отображения представителей (формат CSV). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный протокол прост, с простыми в последующей шаги для выполнения микробиома профилирования с использованием 16S rRNA метагеномных секвенирования из большого числа биоspecimenнезов, представляющих интерес. Секвенирование следующего поколения преобразовало исследования микробной экологии, особенно в моделях человеческих и доклинических заболеваний31,32. Основным преимуществом данной методики является ее способность успешно анализировать сложные микробные композиции (необязательные и необязательные микробы) в данном биоспецифическом виде на высоком уровне пропускной способности и при низкой стоимости32. Однако несколько факторов (т.е. пакетные эффекты, выбор грунтовок для гена 16S rRNA и анализ последовательности данных) остаются основным препятствием на пути широкого использования этой технологии.
Расширенные 16S rRNA основе MiSeq секвенирования технологий (2x300bp)33 позволяют секвенирования 600 нуклеотидов из 1500 нуклеотидов длиной 16S rRNA ген бактерий, который преодолел ранее ежевые узкие места короткого секвенирования читает. Праймеры, специфичные для другой области rRNA, такие как V1-V2, V3-V5 или V6-V9, могут быть использованы с каждым конкретным регионом праймеров, показывающих некоторую предвзятость для чрезмерного или недостаточного обнаружения конкретной таксы34,35. Некоторые группы предпочитают V1-V2 области21, который показывает повышенную предвзятость для Clostridium, но недостаточное обнаружение для некоторых видов бактероидов. В отличие от этого, другие группы предпочитают V4, V3-V4 и V3-V5 регионов, которые демонстрируют наименее предвзятую классификацию бактериальной таксы15,20,36,37.
Настоящий протокол использует праймеры, специфичные для регионов V3-V4 гена 16S rRNA, так как он охватывает более длинную область 16S rRNA с двумя гиперпеременными регионами (V3 и V4) по сравнению только с V4. Кроме того, V3-V4 специфический ампиикон позволяет слияние как вперед (R1) и обратного (R2) читает, что приводит к лучшему разрешению бактериальной классификации. Хотя v3-V5 область обеспечивает больше читает и охватывает более гиперпеременных регионов (V3, V4 и V5), это сложно объединить R1 и R2 читает из-за нет / мало перекрывающихся регионов между R1 и R2 читает. Таким образом, ряд исследований использовали данные только из R1 читает для бактериальной классификации при выполнении 16S rRNA метагеномное секвенирование с использованием V3-V5 области14.
Правильное хранение и обработка бионезообразуем имеют решающее значение для анализа микробиома для предотвращения деградации бактериальной ДНК или загрязнения окружающей среды38. Долгосрочное хранение биоспециции на РТ или 4 градуса Хк может привести к разрастанию некоторых бактерий или грибков. Образцы могут быть заморожены немедленно или транспортироваться при 4 градусах По Цельсию (в течение 1-3 дней), а затем заморожены. Биоспециция также может храниться непосредственно в консервантах, таких как раствор стабилизации нуклеиновой кислоты (например, РНК-позднее), 95% этанола или коммерческий набор для хранения. Общий консенсус заключается в том, что любой из этих методов хранения не вызывает значительных различий в бактериальных профилей сообщества39,40. Хотя раствор с консервантами позволяет хранить и транспортировать на RT, эти образцы не могут быть использованы для РНК-анализов, метаболитов, или фекальных экспериментов трансплантации. Эти вопросы были подробно обсуждены в другом месте39,40.
Одним из важнейших шагов в этом протоколе является использование бисины на основе метода для механического нарушения грамположительных бактерий и Археи. Более раннее исследование показало, что наибольшее бактериальное разнообразие с использованием бис-избиения основе метода по сравнению с другими методами лиза клетки41. Неполный бактериальный лисис или загрязнение во время извлечения ДНК может ввести предвзятость в данных микробиома кишечника42. Еще один важный момент, чтобы рассмотреть это загрязнение из-за лабораторных реагентов, включенных в комплекты называется китом43,44,45. Образцы с большой биомассой и богатым бактериальным разнообразием, такимкак как почва или фекалии, показывают меньше этих проблем по сравнению с образцами с более низкой биомассой, такой как кожа. Таким образом, контроль извлечения воды должны быть включены с каждой экстракции и обработаны с другими образцами для выявления введения потенциального загрязнения в связи с извлечением ДНК43,44,45.
При анализе микробиома разнообразие в выборке может измеряться альфа-разнообразием, мерой богатства видов, или бета-разнообразием, которое оценивает различия между образцами/группами. Популярные методы измерения разнообразия включают UniFrac (взвешенный и невзвешенный) в сочетании с многовариантными статистическими методами, такими как основной анализ координат (PCoA) или непохожесть Брей-Кертиса. В то время как UniFrac основан на филогенетических расстояниях, анализ диссажетии Брей-Кертис использует бактериальное изобилие для генерации участков. В подробных описаниях о З- и З-разнообразии iare обсуждается в другом месте30,46,47. Ряд статистических методов могут быть использованы для сравнения различий в микробных сообществ между группами14,48. Рекомендуется использовать скорректированные p-значения вместо сырых p-значений для коррекции для нескольких испытаний14.
Существует множество биоинформатики программного обеспечения для анализа целевых данных последовательности независимо49. Предлагаемый протокол использует R-пакеты программного обеспечения с открытым исходным кодом, что позволяет удобно и быстро профилировать бактериальную таксон через R-наосновенные трубопроводы DADA2. Таблица изобилия, генерируемая DADA2, может быть использована для анализа ниже по течению с использованием phyloseq и METAGENassist. Конвейер DADA2 выгоден по сравнению с ЗИИМЕ, поскольку он не требует специальных функций (т.е. установки виртуальных машин или контейнеров Docker), которые требуют относительно больших вычислительных ресурсов и специальных технических знаний. Специально для начинающих к анализу 16S, R является привлекательным, так как это бесплатно и позволяет пользователям воспользоваться доступными онлайн-учебники и анализ скриптов, которые легко выполнить. Важно отметить, что эти инструменты анализа требуют относительно небольших вычислительных ресурсов и могут работать на ПК, Macintosh или на платформе на базе Linux. Кроме того, METAGENassist может использовать таблицы изобилия, генерируемые из трубопроводов DADA2, а также биологические матрицы наблюдения (BIOM) файлы, созданные из цими/МГ-РАСТ для выполнения анализа, таких как PCA, частичные наименее квадраты дискриминантный анализ (PLS-DA), участки вулкана, т-тесты(сравнение двух групп), ANOVA (сравнение трех и более групп), участки тепловой карты, случайный анализ лесов и т.д. METAGENassist был признан очень удобным для пользователей.
Таким образом, этот протокол описывает простой метагеномный конвейер профилирования 16S rRNA с подробным руководством по сбору образцов, извлечению ДНК, метагеномной подготовке библиотеки, секвенированию на Illumina MiSeq и удобному анализу данных с использованием свободно доступные платформы (напротив, DADA2, phyloseq и METAGENassist). Хотя 16S rRNA метагеномных основе таксономического профилирования является надежным для характеристики бактерий, присутствующих в частности, биоspecimenнисты, дробовик метагеномное секвенирование может быть лучшим подходом для детального анализа метаболических путей и деформации конкретных бактериальная идентификация.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
А. М. получил роялти от клиники Майо (оплачивается Evelo Biosciences) в качестве одного из изобретателей технологии, утверждая, что использование Prevotella histicola для лечения аутоиммунных заболеваний.
Acknowledgments
Авторы признают финансирование из NIAID / NIH (1R01AI137075-01), Карвер Целевой Медицинской исследовательской инициативы Грант, и Университет Штата Айовы экологического здоровья научно-исследовательский центр, NIEHS / NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al.
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
