Summary
这里描述的是使用16S rRNA基因组测序和利用免费工具进行分析的微生物群分析的简化标准操作程序。该协议将帮助那些对微生物群领域较新的研究人员，以及那些需要更新方法以更高分辨率实现细菌分析的研究人员。
Abstract
人类肠道被数以万亿计的细菌殖民，这些细菌支持食物代谢、能量收集以及免疫系统调节等生理功能。健康肠道微生物群的扰动被建议在炎症性疾病（包括多发性硬化症（MS）的发展中发挥作用。环境和遗传因素会影响微生物群的组成;因此，识别与疾病表型有关的微生物群落已成为确定微生物群在健康和疾病中的作用的第一步。使用16S rRNA基因组测序来分析细菌群落有助于推进微生物群研究。尽管其用途广泛，但基于16S rRNA的分类分析没有统一的协议。另一个限制是，由于技术困难（如较小的排序读取），分类分配分辨率较低，以及由于反向 （R2） 读取质量低，在最终分析中使用仅转发 （R1） 读取。需要一种具有高分辨率的简化方法来描述给定生物标本中的细菌多样性。测序技术的进步，能够以高分辨率对较长的读取进行测序，这有助于克服其中一些挑战。目前的测序技术与公开提供的基因组分析管道相结合，如基于R的分因性安培隆去诺算法-2（DADA2）有助于推进高分辨率的微生物分析，因为DADA2可以在属中分配序列和物种水平。此处介绍的指南是使用 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域的两步扩增执行细菌分析的指南，然后使用免费提供的分析工具（即 DADA2、Phyloseq 和 METAGENassist）进行分析。相信这个简单而完整的工作流程将成为有兴趣进行微生物群落分析研究的研究人员的极佳工具。
Introduction
微生物群是指生活在特定环境中的微生物（细菌、病毒、古生物、噬菌体和真菌）的集合，微生物群是指常驻微生物的集体基因组。由于细菌是人类和小鼠中最丰富的微生物之一，本研究只侧重于细菌分析。人类肠道被数以万亿计的细菌和数以百计的细菌菌株1殖民。正常的肠道微生物群通过调节功能（即维持完整的肠道屏障、食物代谢、能量平衡、抑制致病微生物的殖民化，以及调节免疫反应）2，3，4，5。肠道微生物群的成分扰动与多种人类疾病有关，包括胃肠道疾病6、肥胖7、8、中风9、癌症10、糖尿病8，11，类风湿性关节炎12，过敏13，和中枢神经系统相关疾病，如多发性硬化症（MS）14，15和阿尔茨海默氏症疾病（AD）8，16 。因此，近年来，人们越来越关注识别不同身体部位细菌成分的工具。可靠方法应具有高通量、易用、具有高分辨率细菌微生物群分类、成本低等特点。
基于培养的微生物技术不够敏感，无法识别和描述复杂的肠道微生物群，因为几种肠道细菌未能在培养中生长。基于测序的技术的出现，特别是基于16S rRNA的基因组测序，克服了其中一些挑战，改变了微生物群学研究17。先进的基于16S rRNA的测序技术有助于建立肠道微生物群在人类健康中的关键作用。国家卫生研究院的"人类微生物群落项目"和"MetaHIT项目"（欧洲倡议）19都有助于建立微生物群落分析的基本框架。这些举措有助于启动多项研究，以确定肠道微生物群在人类健康和疾病中的作用。
一些小组在炎症性疾病12、14、15、20、21、22的患者中表现出肠道消化不良。尽管由于多路复用和低成本，广泛用于分类分析，但对于基于 16S rRNA 的分类分析，没有统一的协议。另一个限制是分类分配分辨率低，因为测序读取（150 bp 或 250 bp）较小，并且由于低质量反向排序读取 （R2） 而只使用正向排序读取 （R1）。然而，测序技术的进步帮助克服了其中一些挑战，例如使用成对端读取（例如，Illumina MiSeq 2x300bp）对较长的读取进行排序的能力。
目前的测序技术可以测序600bp高质量的读取，这允许合并R1和R2读取。这些合并的较长的 R1 和 R2 读取允许更好的分类分配，特别是使用基于开放访问的 R 的分因安培放大器算法 -2 （DADA2） 平台。DADA2利用基于放大子序列变量（ASV）的赋值，而不是基于QIIME23所利用的97%的相似性的操作分类单元（OTU）分配。ASV 匹配导致数据库中在 1⁄2 核苷酸内的精确序列匹配，从而导致属和物种级别的分配。因此，更长、高质量的成对端读取和更好的分类分配工具（如DADA2）的组合改变了微生物学研究。
此处提供了使用 16S rRNA V3_V4 区域的两步扩增和使用 DADA2、Phyloseq 和 METAGENassist 管道进行数据分析的分步指南。在这项研究中，使用人类白细胞抗原（HLA）II类转基因小鼠，因为某些HLAII类等位基因与MS20、24、25等自身免疫性疾病的易感性有关。然而，HLA II类基因在调节肠道微生物群的组成方面的重要性尚不清楚。据推测，HLA II 类分子会通过选择特定细菌来影响肠道微生物群落。主要组织相容性复合物 （MHC） II 类敲除小鼠 （AE.KO） 或表达人类 HLA-DQ8 分子 （HLA-DQ8） 的小鼠24、25、26用于了解 HLA II 类分子在塑造肠道微生物群落。据信，这种基于R数据分析的完整和简化的工作流程将成为有兴趣进行微生物学分析研究的研究人员的极佳工具。
缺乏内源性小鼠MHCII类基因（AE.KO）和AE-/-的小鼠的生成。HLA-DQA1_0103，DQB1_0302（HLA-DQ8）转基因小鼠具有C57BL/6J背景，前面已经描述了26。从两性小鼠（8-12周龄）收集粪便样本。根据NIH和机构指南，小鼠以前在爱荷华大学动物设施中繁殖和维护。污染控制策略，如在层流柜内让小鼠退异，在不同菌株之间更换手套，以及适当维护小鼠，是分析肠道微生物群的关键步骤。
在整个过程中，强烈建议使用适当的个人防护设备 （PPE）。执行DNA分离、PCR1和PCR2扩增以及测序步骤时，应包括适当的阴性对照。建议使用无菌、无DNase、无RNase和无热原的用品。在整个协议中，应使用用于微生物工程的指定移液器和过滤移液器吸头。微生物群分析包括七个步骤：1）粪便样品的收集和处理;2）提取DNA;3） 16S rRNA基因扩增;4） 使用索引PCR构建DNA库;5） 索引 PCR（库）的清理和量化;6） MiSeq测序;7）数据处理和序列分析。图1显示了所有协议步骤的示意图。
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Protocol
该协议得到了爱荷华大学动物护理和使用委员会的批准。
1. 粪便样品收集和处理
- 用70%乙醇对分压箱进行消毒（见材料表，补充图1）。
- 预标记微离心管（每只鼠标一个），带有样品ID和处理组（如适用）。
- 将小鼠放入消毒分压箱中，让它们正常排便长达 1 小时。
- 使用无菌钳将粪便颗粒收集到一个预先标记为 1.5 mL 的空式微离心管中，然后牢固地关闭管。从每只鼠标收集后，对钳子进行消毒。
- 将含有粪便颗粒的微离心管放入-80°C冷冻室，直至进一步加工。
注：分频箱是有利的，因为它们允许同时从多个小鼠（最多12个）收集粪便样本。
2. 提取DNA
- 从冷冻箱中取出粪便样本（小鼠或人），并在室温 （RT） 下解冻。
注：建议根据需要在4°C内解冻人粪样本，从库存样品中收集200毫克或所需量。 - 使用200毫克的起始材料和脱脂DNA到50μL的最终体积。
- 包括DNA分离试剂盒空白，其中没有添加粪便样本，但通过所有DNA提取步骤进行处理。
注：使用了特定的DNA分离试剂盒（见材料表），因为它含有特定的试剂，用于去除人体和小鼠粪便中存在的抑制物质，如生物固体、未消化的植物物质和血红细胞中的血红细胞。样品。 - 将珠管放入同质器中（参见材料表），在RT下将样品均匀化45s，速度为4.5 m/s。
注：任何制造商都可以使用打珠的均质器。但是，当使用来自其他供应商的珠击均质器时，建议标准化该方法，特别是同质化的速度和持续时间。 - 根据制造商的协议（参见材料表），使用细菌DNA分离试剂盒从单个小鼠粪便样本中分离DNA，并稍作修改。通过在荧光计或高灵敏度电泳芯片上加载 1 μL 的 DNA 来量化分离的 DNA（参见材料表）。
注：当从200毫克的粪便样本开始时，DNA的预期产量范围为500~2，500 ng。 - 使用洗脱缓冲液将DNA浓度调整到4~20纳克/μL。如果在同一天未执行PCR1，则重新量化DNA（如步骤2.5中所做的那样），然后再进行16S rRNA基因扩增（PCR1）。
3. 16S rRNA基因扩增（PCR1）
- 使用25μL反应体积在96孔PCR板中设置16S rRNA基因扩增（PCR1）。
- 使用多通道移液器，添加 12.5 μL 的 2x 高保真聚合酶酶混合物，包括缓冲液，此外还有 dNTP（参见材料表）：40ng 的 DNA，总体积高达 10.5 μL（使用 PCR 级水调节总体积）：1 μL（每个）向前和反向引力在1μM浓度。
注：引注的顺序如下：
前进引物 = 5' - TCGTGGGGAGGATGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGATATATATATATATATAtAtAtAtAtAtAtC C-3''-GTCTCGGGGGGGAGGAGGAGGAGGAGGATATATATATATACTAATATATC C-3'。在 PCR 板中包括步骤 2.3（试剂盒控制）中的试剂盒空白。 - 在台式板离心机（参见材料表）中，在20°C下以1000 x g密封PCR板和离心机1分钟，并在热循环器中执行PCR，编程为：95°C3分钟;25 周期 1） 95 °C 30 s，2） 55 °C 30 s，3） 72 °C 30 s;在72°C下最后延长5分钟;并保持在4°C。
注：虽然这种16S rRNA基因扩增方法应该适用于不同类型的生物标本，但建议在开始新项目时标准化扩增周期的数量。 - 通过在高灵敏度电泳芯片上加载 1 μL DNA 来确认 PCR1 产品的大小。或者，在1.5%的甘蔗凝胶上运行5μL的16S rRNA扩增产物，以确认PCR1产物的550 bp。
注：16S rRNA扩增产物的清理是可选的，取决于所使用的DNA分离试剂盒/方法。如果使用内部DNA分离方法，PCR1产品可以使用微生物群DNA纯化试剂盒根据制造商的协议进行清洁（见材料表）。此处使用的 DNA 分离试剂盒可产生超纯 DNA，无需对 PCR1 产品进行清理。
4. 使用索引PCR（PCR2）构建DNA库
-
将索引 1 和索引 2 条形码底漆放在 96 个库的特殊机架中（参见材料表）。
- 在特殊机架的 A+H 行中排列索引 1 引物列 1 和索引 2 引物。
- 使用多通道移液器在列 1_12 中添加 2.5 μL 索引 1 和 A+H 行中的索引 2 引色。将新盖（见材料表）放在指数1和指数2采用引物上，并将其存放在-20°C的冰柜中。
- 使用多通道移液器，添加含有缓冲液的12.5 μL高保真聚合酶混合物，以及dNTP（见材料表）;5 μL PCR 级水和 2.5 μL 的 16S rRNA 扩增产物。
注：为每个样本添加唯一索引，以便在一次运行中多路复用超过 96 个库，如基尔南等人27中所述。本协议使用商业套件（例如 Nextera XT 索引套件）中的适配器，根据制造商在 16S 基因组学测序方法（例如 Illumina）中提供的说明。 - 在 20°C 下在 1，000 x g下密封和离心，在热循环器中执行 PCR 1 分钟，并在 95°C 下执行 PCR 3 分钟;8 个周期 1） 95 °C 30 s，2） 55 °C 30 s，3） 72 °C 30 s;并在 72°C 下进行最终扩展 5 分钟。
- 通过在高灵敏度电泳芯片上加载 1 μL DNA，确认索引 PCR 产品的 630 基尺寸。或者，在1.5%的甘蔗凝胶上运行5μL的指数PCR产品，以确认产品的大小和强度。
5. 索引PCR（PCR2）的清理和定量
- 池 5 μL PCR2 放大剂使用多通道移液器从每个井到一个多通道储液罐托盘，没有可检测的DNase，RNase，人类DNA和热源细菌（见材料表）。
- 将池料产品从多通道储液罐托盘转移到一个空的、预标记的 1.5 mL 微离心管和涡流中进行混合。
- 根据制造商的说明，使用标准磁珠套件（参见材料表）净化 PCR2 产品。密封剩余的 20 μL PCR2，并储存在同一板上，温度为 -80°C，以便根据需要进一步使用。
- 在1mLPCR级水中加入4 mL 100%乙醇，制备新鲜80%乙醇。
- 将磁珠与RT和涡旋平衡30s，以均匀地分散磁珠。
- 简要涡旋和旋转池PCR2放大素样品。
- 将 80 μL 的磁珠加入预标记的无菌 1.5 mL 微离心管中，加入 80 μL 的集中 PCR 产品，然后旋涡并短暂旋转，以均匀地重新悬浮磁珠。
- 在 RT 孵育内容物，而不干扰管 15 分钟。
- 将带有DNA和磁珠的管子放在磁性支架上（见材料表）上5分钟。
- 小心地取出并丢弃150 μL的上清液。
- 加入200 μL新鲜制备的80%乙醇，不干扰珠子，孵育30s。
- 小心地取出并丢弃所有上清液。
- 重复步骤 5.11~5.12。使用 P10 移液器卸下剩余卷。让磁珠风干15分钟，指数PCR管留在磁性支架上。
- 从磁性支架上拆下。加入33μL洗脱缓冲液（DNA试剂盒的洗脱缓冲液是可以接受的）。涡旋良好，并执行快速旋转，以去除侧面的任何剩余液体。孵育2分钟，放在磁性支架上5分钟。
- 将30 μL的上清液（清洁PCR产品）转移到预标记的1.5 mL微离心管。
- 通过在荧光计或高灵敏度电泳芯片上加载 1 μL 的纯化池来量化纯化池，因为测序期间需要这样做。执行如下详细操作的 MiSeq。
6. MiSeq测序
- 在 MiSeq 仪器上创建包含样本特定条形码信息的样本表，用于基因组学工作流程和去复用（参见材料表）。将此示例表上载到软件（例如，Illumina 实验管理器）。
- 从步骤 5.15 稀释池库到 4 nM。
- 在 1.5 mL 微离心管中将 4 nM 库池的 5 μL 与 5 μL 新鲜制备的 0.2 M NaOH 结合，使池体变性。涡旋短暂混合，在环境RT下短暂离心并孵育5分钟。
- 加入990 μL的冷冷杂交缓冲液（HB缓冲液），轻轻混合移液器。这将生成 20 pM 库。
- 将 10 nM 控制库的 2 μL 与 3 μL 的 EBT 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8.5，带 0.1% 补间 20）结合，生成 4 nM 控制库。加入5 μL新鲜准备的0.2 N NaOH和涡旋短暂混合。在 RT 孵育 5 分钟。
-
加入990 μL冷冷杂交缓冲液（HB缓冲液），轻轻混合移液器。这将生成 20 个 pM 控制库。
注： 变性 20 pM 控制库可在 -20°C 下存储长达 4 周。4 周后，聚类数字趋于减少。- 将 20 pM 库的 210 μL 与 20 pM 控制库的 40 μL（最终浓度 = ±18%），并添加 350 μL 的 HB 缓冲液。以 7 pM 的最终浓度加载库。
注：输入详细信息应根据运行性能进行调整。
- 将 20 pM 库的 210 μL 与 20 pM 控制库的 40 μL（最终浓度 = ±18%），并添加 350 μL 的 HB 缓冲液。以 7 pM 的最终浓度加载库。
- 在96°C下孵育样品2分钟。将最终池的 600 μL 装入 MiSeq 墨盒的适当孔中，在冰上放置 5 分钟。
注：上述第 6 节可在基因组/DNA 核心设施进行。
7. 数据处理和序列分析
- 使用 R 软件（3.5 版）进行 DADA2 数据处理和分析。对于步骤 7.1_7.4，请使用以前开发的 DADA2 在线教程中概述的开放访问软件，如
注：一个随时可用的R脚本已附加为补充文件2，用户必须更改排序文件的名称和来源（例如，SAMPLENAME_R1_001.fastq 和 SAMPLENAME_R2_001.fastq）。 - 使用绘图质量配置文件命令可视化正向和反向读取的质量配置文件。
- 根据质量图修剪正向和反向读取的核苷酸。这些参数由 DADA2 中的 truncLen 参数指定。
注：此处，280 用作将丢弃转发读取的长度阈值，260 用作将丢弃反向读取的长度阈值。 - 处理原始的 16S 数据作为 dadA2 管道的快速文件，如在线教程中概述（见
注： 从DADA2管道生成的样本放大子序列变异表作为补充文件3包括在内。可以使用 Greengene 或 Silva 参考数据库，因为使用其中任一数据库均未发现细菌分类的差异。 - 生成用户定义的映射文件，其中包含每个样本的元数据（即基因型、性别、治疗等）。示例元数据文件已包含在补充文件 4中。
- 使用在在线教程中概述的 Phyloseq28使用稀有的 OTU 计数计算 alpha 多样性（Shannon index）和 beta 多样性（PCA），见
- 在 METAGENassist29 中执行以下分析。
注：使用Wilcoxon等级和在属级执行差分丰度分析。热图和差异丰富的分类使用METAGENassist29突出显示，这是一个公开和基于网络的分析管道。- 上传分类丰度表（CSV格式），并在列中选择"样本"。
- 上传映射文件（CSV格式）并选择一行中的"示例"。
- 选择选项以删除零超过 50% 的变量，并排除未分配和未映射的读取。
- 选择选项以按总和对行进行规范化，并记录规范化列。
- 单击左侧列中的"相同"，然后单击"删除样本名称"以制作图形，从而绘制火山、PCA或PLSDA绘图。
- 执行t-test（如果只有两组）或 ANOVA（如果大于两个组），以可视化不同组之间的特征（细菌）。单击"选定功能"以可视化不同组之间的特定细菌。
- 单击"密度图"或"热力"图以创建相应的绘图。可以执行其他分析，例如按组进行示例可视化或基于 t-test/ANOVA 的前 25 个要素。
- 单击"随机森林"以创建显示可用于分类的要素的图形。单击顶部的"方差"选项卡，为不同/组之间的顶级要素创建图形。单击"功能详细信息"可查看不同组的不同细菌列表，然后单击每个细菌以创建相同的图形摘要。
- 单击顶部的"异常值"选项卡可可视化异常值的样本。
- 最后，单击"下载"并选择 1） 包含执行的所有分析的 zip 文件或 2） 要下载所需的功能。此文件应保存为唯一名称，在使用前需要解压缩。
注：有关在微生物群分析期间进行的详细统计测试，请参阅陈等人和哈戈尔特等人的作品，第14、30、30。
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Representative Results
由于MHCII类分子（HLA在人类）是自适应免疫反应的中心参与者，并表现出与MS24，25，26的倾向性强关联， 它被假设HLA II类分子会影响肠道微生物成分。因此，缺乏MHC II类基因（AE.KO）或表达人类HLA-DQ8基因（HLA-DQ8）的小鼠被用来理解HLA II类分子在塑造肠道微生物群落中的重要性。
从AE.KO（n = 16）和HLA-DQ8（n= 12）转基因小鼠中采集粪便样本，提取细菌DNA，并扩增16S rRNA基因的V3-V4区域。通过在1.5%的甘蔗凝胶上运行样品（图2A，通道1+6），证实了放大子大小（550 bp）。 通过在高灵敏度电泳芯片上加载 PCR1 产物的 1 μL（图 2B，通道 1+7），进一步确认 16S rRNA 放大子大小 （550 bp）。
电图由16S rRNA PCR产物生成，显示峰值区域，碎片大小为+550 bp（图2C）。使用索引 PCR （PCR2） 附加了双索引和排序适配器，该 PCR 为每个样本分配了唯一的标识，并允许在单个 MiSeq 测序运行中多路复用多个样本。通过阿加玫瑰凝胶电泳（图2A，通道7~12）和高灵敏度电泳芯片（图2B，通道8~12），图2D，对指数化PCR进行确认。来自 PCR2 的所有样本都经过集中、纯化并加载到下一代定序器上，该序列生成了具有良好质量的正向 R1 和反向 R2 读取（图 3）。质量过滤和修剪后获得的读数中位数为 88，125（范围为 9，597–111，848）。
使用DADA2分析管道进行社区生态分析，并使用Phyloseq和METAGENassist进行可视化，以显示阿尔法多样性（图4）和β多样性（图5）的差异，以及各组之间的属和物种水平。DADA2 分析以 csv 格式生成了一个带逗号分隔值的丰度表，该表用于使用基于 Web 的平台（即 Phyloseq 和/或 METAGENassist）进行进一步的下游分析。Alpha 和 beta 分集分析基于映射文件中列出的用户定义的类别执行。
香农多样性分析表明，与HLA-DQ8转基因小鼠相比，AE.KO小鼠的阿尔法多样性总体较低（图3）。与主坐标分析的配合显示AE.KO小鼠和HLA-DQ8转基因小鼠之间具有独特的空间聚类（图5）。DADA2的丰度表也用于使用开放访问软件METAGENassist29进行全面的基因组分析。利用METAGENassist管道生成了基于热图的细菌丰度聚类（属级）（图6A）和特定细菌的框图，显示两组之间的差异（图6B）。
热图分析表明，HLA-DQ8转基因小鼠中某些细菌，如阿隆布库勒姆、德福维布里奥和里肯纳拉更为丰富。相比之下，AE.KO小鼠中嗜血杆菌更为丰富（图6B）。单个细菌的相对丰度（比嗜血杆菌和里肯纳）显示在具有代表性的框图中（图6B）。总体而言，数据表明AE.KO小鼠与HLA-DQ8转基因小鼠相比具有明显的微生物群落，AE.KO小鼠中无特定细菌。数据还表明，MHC II类分子在某些细菌的丰度中起着重要作用。总之，这个简单而详细的协议将帮助那些对微生物群领域较新的研究人员以及那些需要更新实现更高分类分辨率方法的研究人员。
图1：肠道微生物群落测序流程图。显示微生物群测序的所有步骤（样品采集到微生物群数据分析）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：V3~V4区域16SrRNA基因扩增及质量控制分析。（A） 代表琼脂胶电泳图像的16S放大基翁（PCR1，大小550 bp）和指数PCR（PCR2，大小 = 630 bp）从AE.KO小鼠（通道1+3和7+9）和HLA-DQ8转基因小鼠（通道4+6和10+12）。（B） AE.KO 小鼠（通道 1⁄3 和 8+10）和 HLA-DQ8 转基因小鼠（通道 4⁄7 和 11-12）的代表性凝胶图像（PCR1，大小 = 550 bp）和指数PCR（PCR2，大小 = 630 bp）和HLA-DQ8转基因小鼠（通道4×7和11+12）通过电泳解决。（C） 16S amp.amp;pon （PCR1） 的代表性电刻图显示，峰值区域包含大小为 ±550 bp 的片段 （D） 索引 PCR （PCR2） 的代表性电刻图显示由大小为 * 的片段组成的峰值区域 。630 bp.请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：两个代表性样本的正向读取（R1，顶部）的质量配置文件和相同样本的相应反向读取（R2，底部）。分析使用 DADA2 管道执行，其中 x 轴显示读取长度（0+300 基），y 轴显示读取质量。绿线表示中值质量分数，橙色线表示每个基本位置的质量分数分布的四分位数。转发读取 （R1） 始终显示比反向读取 （R2） 更好的质量。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：AE.KO小鼠和HLA-DQ8转基因小鼠的阿尔法多样性测量（山农多样性）。每个点表示单个鼠标样本中的 α 多样性（山农多样性）。与HLA-DQ8转基因小鼠相比，AE.KO小鼠的香农多样性总体较低。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：使用部分最小二乘的尺寸分析图进行协调。图显示了AE.KO小鼠和HLA-DQ8转基因小鼠之间的明显分离。每个点表示样本中的细菌组成，虚线日食表示 80% 的置信区间。PLS-DA 图是使用 METAGENassist 生成的。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：AE.KO小鼠与HLA-DQ8转基因小鼠相比表现出明显的微生物群落，AE.KO小鼠无特定细菌。（A） 热图与聚集分层聚类相结合，显示细菌的相对丰度（属级）。（B） 盒图显示AE.KO和HLA-DQ8转基因小鼠中两种代表性细菌（比嗜虫和里肯纳）的标准化相对丰度。这两个图都是使用METAGENassist生成的。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1：分压箱的代表图片，用于一次从多个小鼠收集粪便样本。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件2：用于从原始序列生成丰度表的 DADA2 R 脚本。请点击此处下载此文件。
补充文件3：代表性属丰度表（CSV 格式）。请点击此处下载此文件。
补充文件4：代表性映射文件（CSV 格式）。请点击此处下载此文件。
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Discussion
所述方案很简单，具有易于遵循的步骤，使用来自大量感兴趣的生物标本的 16S rRNA 基因组测序执行微生物群分析。下一代测序已经改变了微生物生态学研究，特别是在人类和临床前疾病模型31，32。该技术的主要优点是能够成功地分析复杂微生物组合物（可培养和非可培养微生物）在给定的生物标本在高通量水平和低成本32。然而，几个因素（即批量效应、16S rRNA基因的引源选择和序列数据分析）仍然是广泛使用该技术的主要障碍。
基于16S rRNA的MiSeq测序技术（2x300bp）33允许从1500个核苷酸长16S rRNA基因中测序600个核苷酸，从而克服了早期短测序读取的瓶颈。特定于不同区域的 rRNA 的引体，如 V1_V2、V3_V5 或 V6_V9，可与每个区域特定的引体一起使用，这些引体表示对特定分类34、35的过度或不足检测具有某种偏差。一些组更喜欢V1+V2区域21，这表明对梭菌的偏置增加，但对某些细菌类物种的检测不足。相反，其他组更喜欢 V4、V3+V4 和 V3+V5 区域，它们显示了细菌分类的最小偏差分类15、20、36、37 。
本协议使用16S rRNA基因的V3-V4区域特异性引物，因为它覆盖了16S rRNA的较长区域，具有两个超可变区域（V3和V4），而仅V4就具有。此外，V3_V4 特异性放大剂允许合并正向 （R1） 和反向 （R2） 读取，从而更好地解析细菌分类。尽管 V3_V5 区域提供更长的读取时间，并覆盖更多的超变量区域（V3、V4 和 V5），但由于 R1 和 R2 读取之间没有/很少重叠区域，因此合并 R1 和 R2 读取具有挑战性。因此，许多研究只使用来自R1读取的数据进行细菌分类时，执行16S rRNA基因组测序使用V3+V5区域14。
适当的生物标本储存和处理对于微生物群落分析，以防止细菌DNA的降解或环境污染至关重要38。长期储存在RT或4°C的生物标本会导致某些细菌或真菌的过度生长。样品可以立即冷冻或在4°C（1~3天）下运输，然后冷冻。生物标本也可以直接储存在防腐剂中，如核酸稳定溶液（例如，RNA-晚）、95%乙醇或商业存储试剂盒。普遍的共识是，这些存储方法中的任何一种不会导致细菌群落谱39，40的显著差异。虽然含有防腐剂的溶液允许在RT进行储存和运输，但这些样品不能用于基于RNA的检测、代谢物分析或粪便移植实验。这些问题已在其他地方详细讨论。
该协议的关键步骤之一是使用基于珠击的方法对革兰氏阳性细菌和Archaea进行机械破坏。早先的研究表明，与其他细胞莱沙41方法相比，使用基于珠击的方法的细菌多样性最高。DNA提取过程中不完全的细菌莱沙或污染会引入肠道微生物群数据42的偏差。另一个需要考虑的重要一点是污染由于实验室试剂包括在试剂盒称为基托姆43，44，45。与生物量较低的样品（如皮肤）相比，具有大生物量和丰富细菌多样性（如土壤或粪便）的样本较少。因此，每次提取时都应包括一种取水控制，并与其他样品一起处理，以确定由于DNA提取43、44、45而引入的潜在污染。
在微生物群分析中，样本内的多样性可以通过α多样性（衡量物种的丰富性）或贝塔多样性来衡量，后者估计样本/组之间的差异。测量 α 多样性的常用方法包括 UniFrac（加权和非加权）以及多变量统计技术，如主坐标分析 （PCoA） 或 Brey-Curtis 差异。UniFrac基于植物遗传距离，而布雷-柯蒂斯差异分析利用细菌丰度来生成地块。关于β-和β-多样性的深入描述，在其他地方讨论30，46，47。可以利用一些统计方法比较14、48组微生物群落的差异。建议使用调整后的 p 值而不是原始 p 值来更正多个测试14。
有各种生物信息学软件独立分析目标测序数据49。建议的协议使用基于 R 的开源软件包，允许通过基于 R 的 DADA2 管道对细菌分类进行用户友好和快速分析。从DADA2生成的丰度表可用于使用物理和METAGENa.进行下游分析。DADA2 管道优于 QIIME，因为它不需要特殊功能（即安装虚拟机或 Docker 容器），需要相对较大的计算资源和特殊的技术专业知识。尤其对于 16S 分析的初学者来说，R 很有吸引力，因为它是免费的，并且允许用户利用易于执行的可访问的在线教程和分析脚本。重要的是，这些分析工具需要相对较少的计算资源，并且可以在 PC、Macintosh 或基于 Linux 的平台上运行。此外，METAGENassist 可以使用从 DADA2 管道生成的丰度表以及 QIIME/MG-RAST 生成的生物观测矩阵 （BIOM） 文件来执行 PCA、部分最小二乘异位分析 （PLS-DA） 等分析，火山图、t-测试（比较两个组）、ANOVA（比较三个或更多组）、热图图图、随机森林分析等。METAGENassist被发现是非常用户友好的。
总之，该协议描述了一个简单的16S rRNA基因组分析管道，并详细介绍了样品收集、DNA提取、基因组库制备、Illumina MiSeq测序以及用户友好的数据分析，可自由使用可用的平台（即 DADA2、物理和 METAGENassist）。虽然基于16S rRNA的基因组分类分析对于特定生物标本中存在的细菌的表征是可靠的，但猎枪基因组测序可能是详细代谢途径分析和应变特异性的更好方法细菌鉴定。
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Disclosures
A. M. 作为声称使用Prevotella 异体治疗自身免疫性疾病的技术的发明者之一，从梅奥诊所（由 Evelo 生物科学公司支付）获得版税。
Acknowledgments
作者感谢NIAID/NIH（1R01AI137075-01）、卡弗信托医学研究计划赠款和爱荷华大学环境卫生科学研究中心NIEHS/NIH（P30 ES005605）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
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