Summary
הציג כאן הוא צעד אחר צעד הליך כדי לגרום לפציעה ריאה חריפה בעכברים על ידי ישירה intratracheal ליפוסכאלפסיד ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמכתשי נוזל ששטיפה, ורקמות ריאות. מיניציה מינימלית, טיפול פשוט, תוכנות טובה, ו טיטור של חומרת המחלה הם יתרונות של גישה זו.
Abstract
מינהל דרכי הנשימה של ליפופוליסכד (LPS) היא דרך נפוצה לחקר דלקת ריאות ופגיעה בריאות חריפה (ALI) במודלים של בעלי חיים קטנים. היבטים שונים תוארו, כגון האינהלציה של aerosolized LPS, כמו גם אפי או intrracheal הסטילציה. הפרוטוקול המוצג מתאר נוהל צעד אחר צעד מפורט כדי לגרום לעלי בעכברים על ידי ישיר intratracheal לחות ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמישיים ששטיפה (BAL) נוזל, ורקמות ריאות. לאחר הרגעה הצפק פנימי, קנה הנשימה נחשף ו-LPS מנוהל באמצעות צנתר הווריד 22 G. תגובה דלקתית חזקה ומיועלת עם הפלישה הלוקוטית, upregulation של ציטוקינים proinflammatory, ושיבוש של מחסום מכתשי-נימים מושרה בתוך שעות לימים, בהתאם למינון LPS בשימוש. איסוף דגימות דם, נוזל בל וקצירת ריאות, כמו גם עיבוד לניתוח FACS, מתוארים בפרוטרוט בפרוטוקול. למרות שהשימוש ב-LPS סטרילי אינו מתאים לחקר התערבויות פרמקולוגית במחלות זיהומיות, הגישה המתוארת מציעה החלטיות מינימלית, טיפול פשוט, ומענה טוב למענה על שאלות אימונולוגיות מכניסטיות. יתר על כן, מינון המינון, כמו גם שימוש אלטרנטיבי LPS ההכנות או זנים העכבר לאפשר אפנון של ההשפעות הקליניות, אשר יכול להציג דרגות שונות של החומרה ALI או מוקדם לעומת התפרצות מאוחרת של תסמיני המחלה.
Introduction
מודלים ניסיוניים לבעלי חיים הינם חיוניים במחקרים חיסוניים בסיסיים. מינהל של חיידקים שלמים או מרכיבים מיקרוביאלית נעשה שימוש תכוף במודלים בעלי חיים קטנים כדי לגרום לדלקת מקומית או מערכתית1. ליפופוליסכריד (LPS, או אנדוטוקסין חיידקי) הוא רכיב קיר תא ואנטיגן פני השטח של חיידקים גראם שליליים (למשל, בריקובאכניים, פסאודומונס spp.). המולקולה התרמויציבה והגדולה (משקל מולקולרי 1-4 x 106 kda) מורכב moiety השומנים (ליפיד a), אזור הליבה (oligosaccharide), ו-o רב סוכר (או אנטיגן o). ליפיד A, עם שרשראות חומצות שומן הידרופובי שלה, עוגנים את המולקולה לתוך קרום חיידקי ו סכסוכי (על השפלה של חיידקים) את הפעילות החיסונית רעילות של lps. בעקבות הכריכה לחלבון איגוד lps (LBP), lps: LBP מתחמי פסיקים CD14/TLR4/MD2 מורכבות הקולטן ממוקם על המשטח של סוגי תאים רבים, גרימת תגובה חזקה proinflammatory עם טרנסלוקציה גרעינית NF-κB והבאים upregulation ביטוי של ציטוקין2.
פגיעה חריפה בריאות (עלי) מוגדרת ככשל נשימתי חריף באמצעות בצקת בריאות דו-צדדית בהיעדר אי ספיקת לב3. מינהל דרכי הנשימה של lps היא דרך נפוצה כדי לגרום לדלקת ריאתי עלי4,5,6,7. למרות שהחומר הסטרילי אינו מתאים לחקר התערבויות פרמקולוגית במחלות זיהומיות, ניתן לענות על שאלות אימונולוגיות מכניסטיות בדיוק מספיק. הסטיזילציה של LPS לתוך קנה הנשימה גורמת תגובה דלקתית חזקה עם הפלישה לוקיציט, upregulation של ציטוקינים proinflammatory, ושיבוש של מחסום מכתשי-נימי בתוך שעות לימים, בהתאם למינון LPS3, 6,7.
הפרוטוקול המוצג מתאר נוהל צעד אחר צעד מפורט כדי לגרום לעלי בעכברים על ידי intratracheal לדבר. המודל אומת על ידי הערכת ביטוי ציטוקין, הפלישה נויטרופילים, ו מכתשיים הדליפה בתוך מכתשי כמתואר בעבר8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול בעלי חיים זה אושר על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים (LANUV, רקלינגהאוזן, גרמניה; פרוטוקול 84-02.04.2015) ובוצע בהתאם הנחיות המכון הלאומי לבריאות לשימוש בעלי חיים חיים (הפרסום NIH No 85-23, תוקן 1996).
1. עלי השראה
- השתמש במבוגר C57BL/6 עכברים בגילאים של כ 10-12 שבועות. הבית בעלי החיים בכלובים מאוורר באופן אינדיבידואלי עם גישה חופשית למים ואוכל מכרסם רגיל. עם זאת, ניתן לבצע גישה זו על בעלי חיים צעירים יותר עם זנים עכברים אחרים.
- חנות LPS (EsO111 coli החיידק: B4) ב ali, בריכוזים של 5 מ"ג/mL ב-20 ° c. לגבי האינקטלציה, לדלל LPS בתמיסת מלח סטרילית באגירה (PBS) לריכוז הסופי של 2,000 μg/mL.
- . שוקלים את העכבר הכנס קטמין [120 mg/ק ג משקל גוף העכבר (BW) ו xylazine (16 מ"ג/ק"ג BW) intraperitoneally (נמוך יותר משליש הבטן, פאראדין), ולחכות עד תחילת ההרדמה.
- בדוק את עומק ההרדמה על ידי גרימת גירוי מישוש. במקרה של הרדמה מספקת, לחזור על הזריקה עם קטמין (30 מ"ג/ק"ג BW) ו xylazine (4 מ"ג/ק"ג BW).
- מניחים את העכבר בתנוחה מועדת על שולחן טמפרטורה מבוקרת כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 ° c.
- . כדי למנוע התייבשות של קרניות בהרדמה
- הרם את הראש והקרס חותכות על פס אופקי הממוקם כ-5 ס מ מעל השולחן, בעוד שכפות הרגליים נשארות במגע צמוד עם השולחן. הארך את הצוואר בזווית 90 מעלות יחסית לטבלה (איור 1). להחזיק את הלשון עם מלקחיים כדי ליישר את הגרון לתנאי צנרור קל.
- לגזור a 22 מד (ז) קטטר ורידי לאורך של 20 מ"מ. בעדינות להכניס את הצנתר בכיוון האנכי לאורך שורש הלשון. מניחים מקור אור קר על העור מעל הגרון כדי לעזור להמחיש את מיתרי הקול ולכוון את קנה הנשימה. אם התנגדות של הגרון מתרחשת, למשוך את הקטטר כמה מילימטרים לפני להתקדם שוב.
- הכנס את הקטטר כ 10 מ"מ לתוך קנה הנשימה. ודא כי הכניסה אינה עמוקה מדי כמו זה יגרום הצטברות חד צדדית של נוזל לתוך ימין או שמאל ברונזה הראשי.
- הכנס LPS (5 μg/g BW) מדולל ב-PBS באמצעות פיפטה [אמצעי אחסון מוזרק תלוי במשקל גוף העכבר (למשל, 20 גר' משקל ← להשתמש 50 μL של פתרון LPS)].
הערה: העכבר יגיב בדרך כלל עם שיעול או מתנשף בחוסר הסדר המתאים של נוזל לתוך קנה הנשימה. - לחבר מזרק ולהוסיף בולוס של 50 מ"ל אוויר כדי להבטיח כי נפח נוזלי מלא מופץ בריאות. . הסירו לאט את הצנתר
- לשמור על הגוף העליון של העכבר בתנוחה זקופה עבור 30 כדי למנוע דליפה של הנוזל מקנה הנשימה.
- בבעלי חיים בעלי הפעלה מזויפת, הכנס 50 μL של הערוץ האחר במקום LPS.
- הכנס בופרנורפין הידרוכלוריד 0.08 מ"ג/ק"ג תת-עורי לתוך העור רופף על הצוואר מיד לאחר האינדוקציה עלי ואת כל 12 h לאחר מכן, במהלך הראשון 48 h.
- לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 ° צ' עד מודעות מלאה מגיעה על ידי שמירה על העכבר על משטח ההתחממות.
- העבר את העכבר לכלוב מאוורר בנפרד עם גישה חופשית למזון ולמים. נטר את העכבר בקביעות. הפחתת טמפרטורת הגוף ודיכאון הנשימה מעיד על השראה מתאימה של עלי.
2. דגימת דם, ששטיפה ברונדושיים, קצירת איברים
הערה: עיתוי המתת החסד תלוי בסוגיה המדעית הנדונה. בדרך כלל, זה מבוצע 12-72 h לאחר ה, לאחר ה,3,4,9,10. חומרת עלי ניתן לקבוע קלינית על ידי התבוננות סדירה של טמפרטורת הגוף ואת הסימפטומים מצוקה הנשימה11.
- לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר בחדר מוצף באיזוofלאנה. השתמש ב-3 שימוש בזרימת חמצן של 1 L/min. להבטיח הרדמה עמוקה על ידי גרימת גירוי מישוש. במקרה של עומק מספיק של הרדמה, להגדיל את isofלאנה עד 5 vol%.
- להקריב את העכבר בהרדמה מעמיקה. ע י פריקת העורף לאטלנטיס
- תקן את העכבר עם קלטת על טבלת פעולה ובקרוב לחטא את הפרווה על הבטן עם 70% אתנול. פתח את חלל הבטן בזהירות בקו החציוני עם מספריים ומלקחיים. להסיר חלקים של המעי כדי להשיג גישה אל הנחות הבנה קאווה (IVC) הזכות לעמוד השדרה ואת אבי העורקים הבטני.
- לאתר את הוורידים כליה ולהוסיף כפוף 23 G צינורית מחובר מזרק 1 מ ל לתוך ה-ivc ישירות מתחת למפגש של הוורידים. מאספירין 250 μl של דם והעברה לתוך שפופרת 1.5 mL מלא 20 μl של 0.5 M ethylenediamiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii\ טלטל בעדינות כדי להקל על הערבוב של EDTA ולשים את השפופרת על הקרח.
- עבור ששטיפה ברונמאשיים (BAL), להכין שלושה מזרקים mL 1 מ מ עם 0.5 mL של PBS סטרילי ו 0.1 mL של אוויר כל אחד. זמן קצר לחטא את הפרווה של הגרון עם 70% אתנול ולחשוף בזהירות את קנה הנשימה עם מספריים ומלקחיים. להניע את קנה הנשימה. ולעטוף תפר
- לבצע BAL: נקב את קנה הנשימה באמצעות מיקרו מספריים ולהוסיף 22 קטטר ורידי ורידים לחתוך לאורך של 20 מ"מ. תקן את הקטטר עם תפר ו-in, 0.5 mL של PBS סטרילי ו 0.1 mL של אוויר. . מרוב הנוזל לאחר 60 ס חזור על ההליך עם שני מזרקים נוספים ולאסוף את כל הנוזלים בצינור 15 מ ל על הקרח.
- פתחו בזהירות את החזה עם מספריים ומלקחיים כדי לקצור את הריאות. חותכים את הסרעפת לאורך השוליים הקוסטל וחותכים את הצלעות עם שני חתכים לרוחב. הימנע בזהירות מלשאת את הריאות. הרם את עצם החזה בגולגולת. ותקן או הסר אותו
- הכינו מזרקים 2 10 mL עם 37 מעלות צלזיוס חם PBS (ללא סידן ומגנזיום). לעשות חתך קטן לתוך החדר השמאלי. לנקב את החדר הימני עם משחק 26 G צינורית ולשטוף את זרימת הריאות עם PBS הקדם. להיות מודעים לריאות להפוך חיוור במהלך ההליך.
- להסיר את האונה הימנית של הריאות ולחתוך אותו בשני חצאים. הצמד-הקפאת אותם בחנקן נוזלי, ואחריו אחסון לטווח ארוך ב-80 ° c עבור ביטוי גנטי נוסף ניתוח חלבונים.
- להסיר את הריאה השמאלית כולה ואת המגון את זה ב 48 צלחת היטב על ידי מיניב את הרקמה עם מספריים ו tweezer. מודדת את הרקמה 2 מ ל של מאגר העיכול [RPMI 1640 with 10% סרום עגל עוברי (fcs) ו 0.1% נאן3, כולגאז I (1 מ"ג/ml), ו dnase II (7 מ"ג/mL)] ב 37 ° צ' עבור 60 min. לבצע הומוגון נוספת על ידי ליטוף זהיר של חתיכות רקמת ה למטה.
3. הכנת רקמות לניתוחי FACS
- הכן מאגר FACS טרי (טבלה 1): השתמש תמיד ב-PBS ללא סידן ומגנזיום כדי להפחית את הדבקה של תא לתא-לתא התלוי בקטיון ולמנוע הסתעפות. תוספת עם FCS (1%) כדי להגן על התאים ואפופטוזיס, למנוע כתמים לא ספציפיים, ולמנוע תאים לדבוק צינורות FACS. כלול EDTA (0.5 mM) כדי למנוע הדבקה מבוססי-הקטיון תא לתא כאשר עובדים עם תאים נדבקים וחסיד כמו מקרופאגים. הוסף נתרן אזיד (0.1%), כפי שהוא מונע זיהום חיידקי והלבנת של fluorochromes וחוסם נוגדן שפיכת.
- להעביר את דגימות הדם (צעד 2.4) לתוך 5 מנורות FACS ולערבב בעדינות את הדם עם 2 מ ל של מאגר פירוק הדם של תא דם אדום. לשים את הצינורות על הקרח ולסיים את התגובה לאחר 2 דקות על ידי הוספת 2 מ ל של הקרח קר PBS. צנטריפוגה את הדגימות עבור 5 דקות ב 400 x g ולהיפטר supernatant. להשעות מחדש את הגלולה תא עם 60 μL של מאגר FACS והתהליך עבור כתמים של FACS לאחר מכן על פי פרוטוקולים שתוארו בעבר12.
הערה: עיתוי של המתת חסד של השפעות העכבר לספירה כחלק מדלקת מערכתית. לכן, מומלץ להתאים את מספר התא ל 1 x 106 תאים/60 μl בשלב זה כדי להשיג את התוצאות מכתים הטוב ביותר עבור הניתוח cy, try הזרימה. - צנטריפוגה נוזל BAL (שלב 2.6) עבור 5 דקות ב 400 x g. לאחר מכן, הקפאת הסופרנטאנט והקפא אותו בחנקן נוזלי, ואחריו אחסון לטווח ארוך ב-80 ° c לניתוח חלבון נוסף. השהה מחדש בל התאים עם 2 מ ל של מאגר facs קר, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה לתוך 5 ml facs צינור באמצעות מסנן רשת מ100 יקרומטר לרסן שערות.
- שוב, צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 400 x g. השהה מחדש את הגלולה עם 60 μL של מאגר FACS ותהליך עבור כתמים של FACS לאחר מכן בהתאם לפרוטוקולים שתוארו בעבר12.
הערה: עיתוי של המתת חסד של השפעות העכבר לספור בתוך בל כחלק מדלקת. לכן, מומלץ להתאים את מספר התא ל 1 x 106 תאים/60 μl בשלב זה כדי להשיג את התוצאות מכתים הטוב ביותר עבור הניתוח cy, try הזרימה. - העבר את רקמת הריאה השמאלית מתעכל (שלב 2.10) לתוך צינור של 5 mL FACS באמצעות מסנן שינוי מגוון 100 μL כדי לחלץ גושים ולסיים את תהליך העיכול על ידי הוספת 2 מ ל של מאגר FACS קר קרח. צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 400 x g. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 60 μL של מאגר FACS והתהליך עבור כתמים הבאים של FACS בהתאם לפרוטוקולים שתוארו בעבר12.
הערה: העיתוי של המתת החסד של השפעות העכבר ספירת לוקיציט ברקמת הריאה כחלק מדלקת. לכן, מומלץ להתאים את מספר התא ל-1 x 106 תאים/60 μl כדי להשיג את התוצאות מכתים הטוב ביותר עבור ניתוח cy, הזרמת ציטונסה. - עבור ניתוח FACS, התאים המענבית עם CD16/CD32 נוגדן ב 4 ° צ' עבור 15 דקות כדי לחסום את הכריכה הלא ספציפית של האימונוגלובולין לקולטנים Fc. הוסף 20 μL של פתרון חסימת 1 x 106 תאים ב 60 μl בתוך צינור 5 מ ל.
- בינתיים, להכין תערובת הורים עם מאגר FACS ונוגדנים כפי שמתואר בטבלה 2.
- לאחר חסימת, לא לשטוף את התאים. הוסף 20 μL של שילוב מאסטר נוגדן לדוגמה כדי לקבל את הנפח הסופי של 100 μL. מארג הדגימות עבור 20 דקות בחשיכה ב-4 ° c.
- לשטוף כל מדגם עם 1 מ ל של מאגר FACS ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה עם מאגר ה-FACS לריכוז התא המתאים עבור מדידות ה-FACS.
הערה: מספר תא של 1 x 106 תאים/500 μl הוא הציע להשיג את התוצאות הטובות ביותר של הפנוטיפים החיסונית בניתוח facs עם פרוטוקול זה. עם זאת, מומלץ לחייב את הנוגדנים בנפרד. - במקרה הצורך, הוסיפו כתמים חיים/מתים לפני הצביעת המשטח באמצעות ערכות מסחריות זמינות מסוימות8.
- לבסוף, להוסיף מספרים קבוע של מסחרית fluorochrome בשילוב חרוזי כיול (3 x 105 חרוזים ב 20 μl של מאגר facs) לכל מדגם כדי לקבוע מספרי תאים מוחלטים12. באיור 2מוצגת אסטרטגיית היציאה לדם, בל ותאי הרקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגישה המתוארת כדי לגרום ALI בעכברים היה מאומת על ידי הערכת ביטוי cy, הסתננות נויטרופילים, ומחסום מכתשי-נימים הפרעה 24 h ו 72 h לאחר LPS הפרעות. בעלי חיים מוזרקים. שימשו כשליטה ממשלת intratracheal LPS הנגרמת תגובה יציבה הריאות הריאתי. ביטוי של TNF-α ברקמת הריאה היה upregulated באופן משמעותי, הגעה מתמשכת ויותר 50-קיפול להגדיל בהשוואה לבעלי חיים בקרה [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53.7 (SD = 11.6); 72 h: 55.0 (SD = 20.6); p < 0.05)] הפלישה הלוקוציט לתוך רקמה ומכתשיים היא סימן ההיכר ומאפיין לפיתוח עלי13. ניתוח FACS חשף חדירה משמעותית של נויטרופילים גרנולוציטים (NG) לתוך interstitium הריאה, עם ספירת תאים מוחלטים לאחר גדל כמעט 9-קיפול לעומת שולטת לאחר 24 h [65,243 (SD = 15,855) vs. 7,358 (SD = 4,794), p < 0.05] ( איור 3ב). מוחלט NG ספירה ירד מעט לאחר 72 h; עם זאת, הפקטור גדל לעומת הפקדים נשאר יציב [48,946 (SD = 5,223) לעומת 5,510 (SD = 654), p < 0.05]. בקנה אחד עם הסתננות NG ביניים, MMP-9 ביטוי רקמת הריאה כולה היה גם גדל באופן משמעותי על פני תקופת התצפית הכוללת [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7.4 (SD = 1.5); 72 h: 10.4 (SD = 2.0); p < 0.05] (איור 3ג).
NG לא הוגדלה רק ברקמת הריאה אלא גם בנוזל BAL. להגדיל את הקיפול לעומת חיות בקרה היה בולט יותר מאשר ברקמת הריאה, עם מוחלטים NG ספירות 24 h לאחר האינדוקציה ALI של 52,005 (SD = 21,906) vs. 1,829 (SD = 1,724) (p < 0.05) (איור 3ד). לאחר 72 h, NG הוגדלה כדי 37,254 (SD = 4,478) vs. 17.0 (SD = 10.8) (p < 0.05). בצקת ריאות עקב פגיעה קשה במכשול מכתשי-נימי היא פתולוגית לפיתוח עלי, כאשר lps ממריץ במהירות את האפופטוזיס של האנדותל ומגדיל את היכולת לחלחל14,15. ניתוח של תוכן אלבומין בנוזל בל על ידי אליסה חשף אובדן משמעותי של תפקוד המכשול. 24 שעות אחרי LPS לאחר המניפולציה, אלבומין בנוזל BAL היה 43 ng/mL (SD = 13), לעומת 20 ng/mL (SD = 9) תחת תנאי שליטה (p < 0.05) (איור 3E). לאחר 72 h, בעלי חיים ALI, תוכן אלבומין היה 48 ng/mL (SD = 14), לעומת 29 ng/mL (SD = 9) (p < 0.05).
איור 1 : דיאגרמה סכמטית של הגדרת הצנרור. יצוין כי הצוואר של העכבר צריך להיות סופר מורחב בזווית 90 ° יחסית לשולחן הפעולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הקמת Facs מהווה אסטרטגיה לתאי דם, בל ורקמות. בלוטים של נקודות מופת של ניתוח FACS מוצגים בחלקות צבעוניות מדומות לשני פרמטרים (פלואורסצנטית בצבע כפול). האסטרטגיה המתאימה לדגימות מבוססת על תאים בודדים. (א) לעבור לתאי הדם: a = תאים מתים; b = תאים חיים (על פי כתמים לחיות/תא מתים; אין CD45 מכתים הכרחי כמו בדם, גבוהה באופן אוטומטי הופך את אוכלוסיות התאים להבדיל בבירור); ד = נויטרופילים גרנולוציטים; e = מונוציטים (על פי Gr1 ו CD115 כתמים). (ב) מיועד לעץ לאחר ששטיפה ברונבשיים (BAL) נוזל: a = תאים מתים; b = תאים חיים (על פי צביעת תא חי/מת); c = CD45+ תאים חיסוניים; ד = נויטרופילים גרנולוציטים; ו-e = מקרופאגים (לפי Ly6G ו-F4/80 כתמים). (ג) לעבור לרקמת ריאה: a = תאים מתים; b = תאים חיים (על פי צביעת תא חי/מת); c = CD45+ תאים חיסוניים; ד = נויטרופילים גרנולוציטים; ו-e = מקרופאגים (לפי Ly6G ו-F4/80 כתמים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : ואלידציה של מודל מוריין עלי נגד בעלי חיים. (א) ביטוי של tnf-α ברקמת הריאה של הנקבה C57BL/6 עכברים 24 h ו 72 h בעקבות intratracheal לאחר הכול (שינוי מתקפל של ביטוי של בעלי חיים מופעלים). (ב) מנתח של מניופיל לספירת גרנולוציט המוחלטת ברקמת הריאה. (ג) ביטוי של mmp-9 ברקמת הריאה (שינוי מתקפל של ביטוי של בעלי חיים מופעלים). (ד) facs ניתוח של נויטרופילים מוחלטים בספירת גרנולוציט של ששטיפה ברונבשיים. (ה) התוכן אלבומין בנוזל BAL [פירושו ± SD, n = 7, מאן-ויטני U מבחן, * p < 0.05 (לעומת השליטה PBS)]. דמות זו השתנתה מ הארהאוט et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם חומר/ציוד | אמצעי אחסון (mL) |
| מלוחים באגירה מפוספז (PBS), ללא סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד, סטרילי | 1000 |
| סרום עגל עוברי (FCS) | 1 |
| תמיסת חומץ (EDTA) תמיסה | 1 |
| נתרן עזידה (NaN3) | 0.1 |
טבלה 1: הרכב של מאגר FACS.
| שם חומר/ציוד | הצעה לדילול | מאסטר לערבב עבור 10 דגימות: להוסיף למאגר 200 μl (= 20 μl לכל מדגם): |
| CD115 (c-fms) APC | 0.5 μL/100 μL | 5 מיקרומטר |
| אנטי CD11b (M1/70)-FITC | 0.5 μL/100 μL | 5 מיקרומטר |
| Anti-CD45 (30-F11)-eF450 | 0.5 μL/100 μL | 5 מיקרומטר |
| אנטי-F4/80 (BM-8)-PE Cy7 | 0.5 μL/100 μL | 5 מיקרומטר |
| אנטי Gr1 (RB6-8C5) | 0.5 μL/100 μL | 5 מיקרומטר |
| Anti-Ly6C (HK 1.4) PerCP-Cy 5.5 | 0.5 μL/100 μL | 5 מיקרומטר |
| אנטי Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0.5 μL/100 μL | 5 מיקרומטר |
טבלה 2: הכנת תערובת בסיס עבור כתמים של FACS. הטבלה מתארת הכנה לערבוב הורים עבור 10 דגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פולשני מינימלי, טיפול פשוט, ומהווה מאפיינים טובים הם תכונות מפתח של הגישה המוצגת כדי לגרום ALI במודל מכרסם קטן. השימוש LPS במקום חיידקים שלמים במודלים לבעלי חיים יש יתרונות. זהו תרכובת יציבה וטהורה, וניתן לאחסנם בצורה ליאופטוחה עד לשימוש. זהו ממריץ חזק עבור תגובות החיסונית מולדים באמצעות מסלול TLR4, הפעילות הביולוגית שלה עשוי בקלות להיות כמותית, הקלה טיטור של חומרת המחלה עם השגות טוב. יתר על כן, השימוש LPS הוכח לשמש מודל בטוח כדי לגרום ברונכיטיס חריפה במתנדבים בריאים אנושיים ובכך מאפשר תרגום מספסל למיטה16. ריטטיטש ואח ' הוכיחו את ההתפתחויות במינון ובזמן התלויים בדליפה האופיינית של מכתשי-קפילר במודל מורלא של האייפס האינסטילציה6. זה מאפשר טיטור מינון כדי להשיג השפעות רצויות מסוימות, אשר יכול להמחיש דרגות שונות של החומרה של עלי או מוקדם לעומת התפרצות מאוחרת של תסמיני המחלה. עם זאת, אם בעיות הנגועים ברורים או תרופתי הם להיות ממוען (למשל, טיפול אנטיביוטי), עלי הנגרמת על ידי האיסטילציה סטרילית LPS אינו מודל מתאים.
יתר על כן, לעומת משלוח של חיידקים או ורידית של החיידק, השיבוש של מחסום מכתשי-נימי היה להיות מתון למדי3, שאלות על התאמתו של מודל זה והאם חדירות משתנה צריך להיות נחקרו במיוחד. המיקום הנכון של הקטטר כדי לספק את LPS בקיעים לתוך מערכת הנשימה התחתונה הוא הצעד הקריטי של הגישה. כדי להבטיח את האפשרות לצנרור בלתי מתאים, הדמיה וזיהוי של הגרון הוא הקלה על ידי מקור אור קר חיצוני. שינויים בתבנית הנשימה (למשל, שיעול או מתנשף) מאמתים את הזרימה הנכונה של הנוזל.
יתר על כן, הבחירה של זן העכבר LPS הם חיוניים האינדוקציה של עלי והדור של תוצאות העקורים במודל זה ותלוי בנושא המדעי התייחס. על פי הספרות, המינון מנוהל כדי לעורר השפעה מקסימלית עם עלייה נוספת עם טווחי המינון הסלמה מ 10 μg/העכבר (כאשר LPS מתוך הפסאודומונס aeruginosa F-D סוג 1 מוזרק הנקבה balb/c עכברים) כדי 50 μg/עכבר כאשר הזרקת E. coli (מO111 סוג: B4) lps (ששימש גם בפרוטוקול) לזכר C57BL/6 עכברים6,9. באופן כללי, עכברים BALB/c אמורים להגיב ברגישות כאשר מאותגרים עם LPS, בעוד C57BL/6 עכברים נראה עמידים יותר3. כך, המינון הראשוני טיטור ניסויים כיבוד תנאים בודדים מומלצים. זה חל גם על עיתוי של דם, בל, ודיגום איברים. חומרת עלי ניתן לקבוע קלינית על ידי התבוננות סדירה של טמפרטורת הגוף וסימפטומים מצוקה נשימתית. יתר על כן, מאז עכברים לשתף רק כ 50% הומולוגיה של קולטן TLR4 עם בני אדם, פרשנות זהירה של התוצאות הוא הכרחי3.
חלופות לגישה זו מהוות את תוואי מינהל האנדוטוקסין לריאות. כפי שמתואר על ידי Szarka ואח ', LPS יכול גם להיות מנוהל באמצעות intranasal הסטילציה9. ליו ואח ' השווה את התצהיר הישיר של intratracheal עם האינהלציה של aerosolized LPS5. בהתבסס על הממצאים שלהם, הם הגיעו למסקנה שתוואי השאיפה מעורר סוג ממדים יותר של עלי. עם זאת, הניסויים שלהם בוצעו בחולדות באמצעות שאיפת האף בלבד בזרימה, ולכן לא בהכרח להעביר לכאן את הגישה המוצגת. לעומת זאת, עכברים חשופים לעיתים קרובות ל-LPS aerosolized בתא10. הגודל הקאמרי, הריכוז LPS, ומספר העכברים שטופלו בו זמנית הם משתנים המגבילים את יכולת המשווה בין מחקרים שונים ומrecommendable להקמת מודל בודד. אחרון, מינהל ורידי והצפק של lps משמש לעתים קרובות כדי לגרום מרחוק עלי17,18. כמו הנתונים של Szarka ואח ' להציע, האינסטיציה intratracheal נראה מעולה על העירוי או כאשר דרך כאשר אפקטים דלקתיים בריאות ספציפיים מטופלות9. לסיכום, הפרוטוקול מייצג גישה פשוטה ומגובשת כדי לגרום ALI סטרילי בעכברים כדי לטפל בבעיות אימונולוגיים ספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות ליאן קליינר וסוזן שולץ על מתן תמיכה טכנית. המחברים מכירים בתמיכה המצוינת של מתקן הליבה של הזרם cy, בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת בון. המחברים לא קיבלו מימון מארגון חיצוני כלשהו. חלק מהנתונים שניתנו במקטע התוצאות ומתוארים באיור 3 כבר הוצגו בפרסום קודם8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
