Summary
Presenteras här är en steg-för-steg förfarande för att framkalla akut lung skada hos möss genom direkt intratrakeal lipopolysackarid instillation och att utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolära sköljning vätska, och lung vävnad. Minimal invasivitet, enkel hantering, god reproducerbarhet och titrering av sjukdomens svårighets grad är fördelar med denna metod.
Abstract
Luftvägs administrering av lipopolysackarid (LPs) är ett vanligt sätt att studera pulmonell inflammation och akut lung skada (Ali) i små djur modeller. Olika metoder har beskrivits, såsom inandning av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal instillation. Det presenterade protokollet beskriver ett detaljerat steg-för-steg-förfarande för att inducera Ali hos möss genom direkt intratrakeal LPS instillation och utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolar sköljning (bal) vätska, och lung vävnad. Efter intraperitoneal sedering exponeras luft strupen och LPS administreras via en 22 G ven kateter. En robust och reproducerbar inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären induceras inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering används. Insamling av blod prov, BAL vätska, och lung skörd, samt bearbetning för FACS analys, beskrivs i detalj i protokollet. Även om användningen av sterila LPS inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, erbjuder den beskrivna metoden minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet för att besvara mekanistiska immunologiska frågor. Dessutom, dostitrering samt användning av alternativa LPS preparat eller mus stammar tillåta modulering av de kliniska effekterna, som kan uppvisa olika grader av ALI svårighets grad eller tidigt vs. sen debut av sjukdoms symtomen.
Introduction
Experimentella djur modeller är oumbärliga i grundläggande immun forskning. Administrering av hela bakterier eller mikrobiella komponenter har ofta använts i små djur modeller för att framkalla lokal eller systemisk inflammation1. Lipopolysaccharide (LPS, eller bakteriell endotoxin) är en cell vägg komponent och ytantigen av Gramnegativa bakterier (t. ex. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Termostabila och stora molekylen (molekyl vikt 1-4 x 106 kDa) består av en Lipiddel (lipid a), kärn region (oligosackarid) och en o-polysackarider (eller o-antigen). Lipid A, med sina hydrofoba fett syror kedjor, förankrar molekylen i ett bakterie membran och förmedlar (vid nedbrytning av bakterier) den immunologiska aktiviteten och toxiciteten hos LPS. Efter bindning till LPS bindande protein (LBP), LPS: LBP komplex ligera CD14/TLR4/MD2 receptor komplex ligger på ytan av många cell typer, inducera en stark proinflammatorisk reaktion med NF-κb nukleär translokationen och efterföljande uppreglering av cytokin uttryck2.
Akut lung skada (ALI) definieras som akut hypoxemisk respiratorisk svikt med bilateralt lungödem i avsaknad av hjärt svikt3. Luftvägs administrering av LPS är ett vanligt sätt att inducera pulmonell inflammation och Ali4,5,6,7. Även om det sterila ämnet inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, kan mekanistiska immunologiska frågor besvaras med tillräcklig precision. Instillation av LPS i luft strupen inducerar en robust inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering3, 6,7.
Det presenterade protokollet beskriver en detaljerad steg-för-steg-procedur för att inducera Ali hos möss genom intratrakeal LPS instillation. Modellen har validerats genom att bedöma cytokin uttryck, neutrofila granulocyt invasion, och intra-alveolära albuminläckage som tidigare beskrivits8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta djur protokoll godkändes av den lokala kommittén för djur vård (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokoll nr 84-02.04.2015) och utfördes i enlighet med de nationella hälso instituten rikt linjer för användning av levande djur (NIH-publikation Nr 85-23, reviderad 1996).
1. ALI-induktion
- Använd vuxen C57BL/6 möss i åldrarna ca 10-12 veckor. Hus djuren i individuellt ventilerade burar med fri till gång till vatten och standard gnagare Chow. Det är dock möjligt att utföra denna metod på yngre djur och med andra möss stammar.
- Förvara LPS (Escherichia coli O111: B4) i Ali kvoter i koncentrationer på 5 mg/ml vid-20 ° c. Späd LPS i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration på 2 000 μg/ml vid intratrakeal instillation.
- Väg musen. Injicera Ketamin [120 mg/kg mus kropps vikt (BW)] och xylazin (16 mg/kg kropps vikt) intraperitonealt (nedre en tredjedel av buken, paramedian), och vänta tills uppkomsten av anestesi.
- Kontrol lera djupet av anestesi genom att framkalla en taktil stimulans. Vid otillräcklig anestesi, Upprepa injektionen med Ketamin (30 mg/kg kropps vikt) och xylazin (4 mg/kg kropps vikt).
- Placera musen i liggande ställning på ett temperaturkontrollerat bord för att bibehålla en kropps temperatur på 37 ° c.
- Applicera steril oftalmologiska Smörj medel för att förhindra uttorkning av horn hinnor under anestesi.
- Lyft huvudet och krok incisiver på en horisontell bar placerad ca 5 cm ovanför bordet medan foretws förblir i nära kontakt med bordet. Super-Förläng halsen i en 90 ° vinkel i förhållande till tabellen (figur 1). Håll tungan med pincett för att räta ut halsen för lättare intubation villkor.
- Skär en 22 Gauge (G) ven kateter till en längd av 20 mm. försiktigt in katetern i vertikal riktning längs tungans rot. Placera en kall ljus källa på huden ovanför struphuvudet för att visualisera stämbanden och sikta på luft strupen. Om motståndet i struphuvudet uppstår, dra tillbaka katetern några millimeter innan du flyttar igen.
- För in katetern ca 10 mm i luft strupen. Se till att insättningen inte är för djup eftersom detta kommer att resultera i ensidig instillation av vätska i höger eller vänster huvudsakliga bronchus.
- Injicera LPS (5 μg/g kropps vikt) utspätt i PBS med en pipett [Injicerad volym beror på mus kropps vikt (t. ex. 20 g kropps vikt → Använd 50 μL LPS-lösning)].
Obs: musen kommer vanligt vis svarar med hosta eller kippar till korrekt instillation av vätska i luft strupen. - Anslut en spruta och tillsätt en bolus på 50 mL luft för att säkerställa att fullständig vätske volym fördelas i lungorna. Ta långsamt bort katetern.
- Håll musens överkroppen i upprätt läge i 30 s för att undvika läckage av vätskan från luft strupen.
- I simulerade djur, injicera 50 μL steril PBS intratracheally i stället för LPS.
- Injicera buprenorfinhydroklorid 0,08 mg/kg BW subkutant i den lösa huden över halsen omedelbart efter ALI induktion och varje 12 h därefter, under den första 48 h.
- Upprätthålla en kropps temperatur på 37 ° c tills full medvetenhet är återfått genom att hålla musen på uppvärmningen pad.
- Överför musen till en individuellt ventilerad bur med fri till gång till mat och vatten. Övervaka musen regelbundet. Minskande kropps temperatur och andnings depression indikerar korrekt induktion av ALI.
2. blod provs tagning, bronkoalveolärt lavage, organ skörd
Anmärkning: tidpunkten för avlivning beror på den vetenskapliga fråga som behandlas. Vanligt vis utförs 12-72 h efter LPS instillation3,4,9,10. Allvarlighets grad av ALI kan bestämmas kliniskt genom regelbunden observation av kropps temperatur och symptom på andnings besvär11.
- Inducera anestesi genom att placera musen i en kammare översvämmad med isofluran. Använd 3 Vol% isofluran med ett syre flöde på 1 L/min. Säkerställ djup narkos genom att framkalla en taktil stimulans. I händelse av otillräckligt anestesi djup, öka isofluran upp till 5 vol%.
- Offra musen i djup anestesi av atlanto-occipital dislocation.
- Fäst musen med tejp på ett Operations bord och strax desinficera pälsen över buken med 70% etanol. Öppna bukhålan noggrant i median linjen med sax och pincett. Ta bort delar av tarmen för att få till gång till Vena Cava sämre (IVC) rätt till kotpelaren och bukaorta.
- Lokalisera njurens vener och sätt in en böjd 23 G kanula ansluten till en 1 mL spruta i IVC direkt under sammanflödet av venerna. Aspirera 250 μL blod och överför till ett 1,5 mL-rör fyllt med 20 μL 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning. Skaka försiktigt för att under lätta EDTA blandning och sätta röret på isen.
- För bronkoalveolärt sköljning (bal), Förbered tre 1 ml sprutor med 0,5 ml steril PBS och 0,1 ml luft vardera. Strax desinficera pälsen i halsen med 70% etanol och försiktigt exponera luft strupen med sax och pincett. Mobilisera luft strupen och Linda runt en sutur.
- Utför BAL: punktera luft strupen med hjälp av mikrosaxar och sätt i en 22 G ven kateter med en längd av 20 mm. fixera katetern med suturen och instillera 0,5 mL steril PBS och 0,1 mL luft. Aspirera vätskan efter 60 s. Upprepa proceduren med ytterligare två sprutor och samla hela aspirera i en 15 mL tub på is.
- Öppna försiktigt bröst korgen med sax och pincett för att skörda lungorna. Skär membranet längs den kust marginalen och skär genom revbenen med två laterala snitt. Försiktigt undvika punktuell lungorna. Lyft bröst benet cranially och fixa eller ta bort den.
- Förbered 2 10 mL sprutor med 37 ° c varm PBS (utan kalcium och magnesium). Gör ett litet snitt i den vänstra ventrikeln. Punktera den högra ventrikeln med en 26 G kanula och spola lung cirkulationen med den förvärmda PBS. Var medveten om lungorna vrida blek under förfarandet.
- Ta bort den högra LOB i lungorna och skär den i två halvor. Snap-frys dem i flytande kväve, följt av långtids förvaring vid-80 ° c för ytterligare gen uttryck och protein analys.
- Ta bort hela vänster lunga och homogenisera den i en 48 väl plattan genom att präga vävnaden med saxen och pincett. Inkubera vävnaden i 2 mL digestionsbuffert [RPMI 1640 med 10% fostrets kalv serum (FCS) och 0,1% NaN3, kollagenas i (1 mg/ml) och DNASE II (7 mg/ml)] vid 37 ° c i 60 min. utför ytterligare homogenisering genom noggrann pipettering av lung vävnaden bitar upp och Ner.
3. vävnads beredning för FACS-analys
- Förbered den nya FACS-bufferten (tabell 1): Använd alltid kalcium-och magnesium fria PBS för att reducera katjonberoende cell-till-cell-adhesion och förhindra klumpar. Tillägg med FCS (1%) att skydda cellerna från apoptos, förhindra icke-specifik färgning och förhindra att cellerna fastnar på FACS-rören. Inkludera EDTA (0,5 mM) för att förhindra katjonbaserad cell-till-cell adhesion när man arbetar med klibbiga och anhängare celler som makro Fager. Tillsätt natriumazid (0,1%), eftersom det förhindrar bakteriell kontaminering och fotoblekning av fluorchromes och blockerar anti kropp shedding.
- Överför blod proven (steg 2,4) till 5 mL FACS-rör och blanda försiktigt blodet med 2 mL av den röda blodcellslyssningsbufferten. Sätt rören på isen och avsluta reaktionen efter 2 min genom att tillsätta 2 mL iskall PBS. Centrifugera proverna i 5 min vid 400 x g och Kassera supernatanten. Omsuspendera cellpelleten med 60 μL FACS-buffert och bearbeta för efterföljande FACS-färgning enligt tidigare beskrivna protokoll12.
Anmärkning: tidpunkten för euthanization av musen påverkar leukocyter räknas som en del av den systemiska inflammationen. Därför, det rekommenderas att justera cell numret till 1 x 106 celler/60 μl i detta steg för att uppnå bästa färgning resultat för flödescytometri analys. - Centrifugera BAL vätska (steg 2,6) i 5 min vid 400 x g. Aspirera supernatanten och frys den i flytande kväve, följt av långtids förvaring vid-80 ° c för ytterligare protein analys. Omsuspendera BAL-cellpelleten med 2 mL kall FACS-buffert och överför sedan SUS pensionen till ett 5 mL FACS-rör med ett 100 μm nät filter för att hindra hårstrån.
- Centrifugera provet igen i 5 min vid 400 x g. Omsuspendera pelleten med 60 μL FACS-buffert och bearbeta för efterföljande FACS-färgning enligt tidigare beskrivna protokoll12.
Anmärkning: tidpunkten för euthanization av musen påverkar leukocytantalet i BAL som en del av inflammationen. Därför, det rekommenderas att justera cell numret till 1 x 106 celler/60 μl i detta steg för att uppnå bästa färgning resultat för flödescytometri analys. - Överför den smälta vänstra lung vävnaden (steg 2,10) till ett 5 mL FACS-rör med hjälp av ett 100 μL nät filter för att extrahera klumpar och avsluta rötnings processen genom att tillsätta 2 mL iskall FACS-buffert. Centrifugera provet i 5 min vid 400 x g. Kassera supernatanten och omsuspendera pelleten med 60 μL FACS-buffert och bearbeta för efterföljande FACS-färgning enligt tidigare beskrivna protokoll12.
Anmärkning: tidpunkten för euthanization av musen påverkar leukocytantalet i lung vävnad som en del av inflammationen. Därför rekommenderas det att justera cell numret till 1 x 106 celler/60 μl för att uppnå bästa Färgnings resultat för flödescytometri analys. - För FACS-analys, Inkubera celler med CD16/CD32-antikropp vid 4 ° c i 15 minuter för att blockera icke-specifik bindning av immunglobulin till FC-receptorerna. Tillsätt 20 μL blockeringslösning till 1 x 106 celler i 60 μl i ett 5 ml-rör.
- Under tiden, Förbered en Master mix med FACS buffert och anti kroppar som beskrivs i tabell 2.
- Efter blockering, tvätta inte cellerna. Tillsätt 20 μL av anti kroppens mastermix per prov för att få en slutlig volym på 100 μL. Inkubera proverna i 20 minuter i mörker vid 4 ° c.
- Tvätta varje prov med 1 mL FACS-buffert och Centrifugera i 5 min vid 400 x g. Kassera supernatanten och omsuspendera pelleten med FACS-buffert till lämplig cell koncentration för FACS-mätningar.
Anmärkning: ett cell nummer av 1 x 106 celler/500 μl föreslås för att uppnå bästa immun fenotypning resulterar i FACS analys med detta protokoll. Det rekommenderas dock att anti kropparna titreras individuellt. - Om det behövs, Lägg till levande/död färgning innan ytan färgning med hjälp av specifika kommersiellt tillgängliga kit8.
- Slutligen, tillsätt fasta nummer av kommersiellt tillgängliga fluorkrom-kopplade kalibrerings pärlor (3 x 105 pärlor i 20 ΜL FACS buffert) till varje prov för att bestämma absoluta cell nummer12. Den gating strategi för blod, BAL, och vävnads celler visas i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna metoden för att inducera ALI hos möss validerades genom att bedöma cytokin uttryck, neutrofila granulocyt infiltration, och alveolo-kapillär barriär störningar 24 h och 72 h efter LPS instillation. PBS-injicerade djur fungerade som kontroll. Intratracheal LPS administrering inducerade en robust pulmonell proinflammatorisk respons. Uttryck för TNF-α i lung vävnad var signifikant uppreglerad, uppnådde en ihållande och mer än 50-faldig ökning jämfört med kontroll djuren [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD = 20,6); p < 0,05)] (figur 3a). Leukocytinvasion i vävnad och alveolära rymden är ett kännetecken och karakteristiska för utvecklingen av ALI13. FACS analys visade en signifikant infiltration av neutrofila granulocyter (NG) i lungan interstitium, med absolut cell antal har ökat nästan 9-faldigt jämfört med kontrollerna efter 24 h [65 243 (SD = 15 855) vs 7 358 (SD = 4 794), p < 0,05] ( Figur 3B). Absoluta naturgas antalet minskade något efter 72 h; faktor ökningarna jämfört med kontrollerna förblev dock stabila [48 946 (SD = 5 223) jämfört med 5 510 (SD = 654), p < 0,05]. I överensstämmelse med interstitiell NG-infiltration, MMP-9 uttryck i hela lung vävnad var jämväl signifikant ökade under den totala observations perioden [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (SD = 1,5), 72 h: 10,4 (SD = 2,0), p < 0,05] (figur 3C).
Inte bara ökade i lung vävnaden utan även i BAL vätskan. Fållan ökade jämfört med kontroll djur var mer uttalad än i lung vävnad, med absoluta NG räknas 24 h efter ALI induktion av 52 005 (SD = 21 906) vs 1 829 (SD = 1 724) (p < 0,05) (figur 3D). Efter 72 h ökades NG till 37 254 (SD = 4 478) jämfört med 17,0 (SD = 10,8) (p < 0,05). Lungödem på grund av svår försämring av alveolo-kapillär barriär är patognomonic för utveckling av Ali, med LPS snabbt inducera endotelial apoptos och ökad permeabilitet14,15. Analys av albuminhalten i BAL vätska genom ELISA visade en signifikant förlust av barriär funktion. 24 timmar efter LPS instillation var albumin i BAL vätska 43 ng/mL (SD = 13), jämfört med 20 ng/mL (SD = 9) under kontroll betingelser (p < 0,05) (figur 3E). Efter 72 h, i ALI djur, albuminhalten var 48 ng/mL (SD = 14), jämfört med 29 ng/mL (SD = 9) (p < 0,05).
Figur 1 : Schematiskt diagram över intubationsinställningen. Det bör noteras att musens hals bör vara super-förlängd vid en 90 ° vinkel i förhållande till Operations bordet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : FACS gating strategi för blod, bal, och vävnads celler. Exemplariska dot blotting av FACS analys visas i två-parameter (Dual Color fluorescens) pseudofärger tomter. Gating strategi för de respektive proverna baseras på singelceller. (A) gating träd för blod kroppar: A = döda celler; b = levande celler (enligt levande/död cell färgning; ingen CD45 färgning behövs som i blodet, hög autofluorescence gör cell populationer klart urskiljbara); d = neutrofila granulocyter; e = monocyter (enligt Gr1 och CD115 färgning). (B) gating träd för bronkoalveolära sköljning (bal) vätska: a = döda celler; b = levande celler (enligt levande/död cell färgning); c = CD45+ immun celler; d = neutrofila granulocyter; och e = makro Fager (enligt Ly6G och F4/80 färgning). Cgating-träd för lung vävnad: a = döda celler; b = levande celler (enligt levande/död cell färgning); c = CD45+ immun celler; d = neutrofila granulocyter; och e = makro Fager (enligt Ly6G och F4/80 färgning). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Validering av murina Ali-modellen mot kontroll djur. A) uttryck för TNF-α i lung vävnad från kvinnliga C57BL/6-möss 24 h och 72 h efter intratrakeal LPS-instillation (faldig förändring av uttryck av simulerade djur). (B) FACS analys av absolut antal neutrofila granulocyter i lung vävnad. C) uttryck för MMP-9 i lung vävnad (faldig förändring av uttryck för simulerade djur). D) FACS analys av absolut antal neutrofila granulocyter i bronkoalveolär lavagevätska. Ealbuminhalten i bal vätska [medelvärde ± SD, n = 7, Mann-Whitney U-test, * p < 0,05 (jämfört med PBS-kontroll)]. Denna siffra har modifierats från Ehrentraut et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Materialets namn/utrustning | Volym (mL) |
| Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (PBS), utan kalciumklorid och magnesiumklorid, steril | 1000 |
| Foster kalv serum (FCS) | 1 |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning | 1 |
| Natriumazid (NaN3) | 0,1 |
Tabell 1: sammansättning av FACS-buffert.
| Materialets namn/utrustning | Föreslagen utspädning | Mastermix för 10 prover: tillsätt till 200 μl FACS-buffert (= 20 μl per prov): |
| Anti-CD115 (c-FMS) APC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD11b (M1/70)-FITC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD45 (30-F11)-eF450 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-F4/80 (BM-8)-PE Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6C (HK 1.4) PerCP-cy 5,5 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
Tabell 2: beredning av mastermix för FACS-färgning. Tabellen beskriver förberedelse av huvud blandning för 10 prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet är viktiga inslag i den presenterade metoden för att inducera ALI i en liten gnagare modell. Användning av LPS i stället för hela bakterier i djur modeller har fördelar. Det är en stabil och ren förening och kan lagras i frystorkad form fram till användning. Det är en potent stimulerande för medfödda immun svar via TLR4 vägen, och dess biologiska aktivitet kan lätt kvantifieras, under lätta titrering av sjukdomens svårighets grad med god reproducerbarhet. Dessutom, användningen av LPS har visat sig fungera som säker modell för att framkalla akut bronkit i mänskliga friska frivilliga och därmed tillåter översättning från bänk till säng16. Rittirsch et al. har visat den dos-och tids beroende utvecklingen av den karakteristiska alveolo-kapillärläckage i en murina modell av intratrakeal LPS instillation6. Detta gör att dostitrering för att uppnå vissa önskade effekter, som kan illustrera olika grader av ALI svårighets grad eller tidig jämfört med sen debut av sjukdoms symtomen. Men om distinkta infektiologiska eller farmakologiska frågor ska behandlas (t. ex. antibiotika behandling), är ALI orsakad av steril LPS instillation inte en lämplig modell.
Dessutom, jämfört med intrapulmonary eller intravenös tillförsel av bakterier, störningen av alveolo-kapillär barriären beskrevs som ganska mild3, ifrågasätta lämpligheten av denna modell och om förändrad permeabilitet bör vara undersökas särskilt. Korrekt placering av katetern för att leverera LPS bilateralt i nedre luftvägarna är det kritiska steget i strategin. För att säkerställa korrekt intratrakeal intubation, visualisering och identifiering av struphuvudet under lättas av en extern kall ljus källa. Förändringar i andnings mönster (t. ex. hosta eller kippar) kontrol lera korrekt intratrakeal instillation av vätskan.
Dessutom är valet av mus stam och LPS avgörande för induktion av ALI och generering av reproducerbara resultat i denna modell och beror på den vetenskapliga frågan behandlas. Enligt litteraturen, doseringen administreras för att framkalla en maximal effekt utan ytterligare ökning med eskalerande doser varierar från 10 μg/mus (när LPS från Pseudomonas aeruginosa F-D typ 1 injiceras i kvinnliga Balb/c möss) till 50 μg/mus när injektion av E. coli (serotyp O111: B4) LPS (som också användes i protokollet) till manliga C57BL/6-möss6,9. I allmänhet, BALB/c möss är tänkta att reagera känsligt när utmanas med LPS, medan C57BL/6 möss verkar vara mer resistenta3. Därför rekommenderas initiala dostitreringsexperiment som respekterar individuella villkor. Detta gäller även vid tidpunkten för blod, BAL, och organ provtagning. Allvarlighets graden av ALI kan bestämmas kliniskt genom regelbunden observation av kropps temperatur och andnings besvär. Dessutom, sedan möss delar endast ungefärligt 50% homologi av TLR4-receptorn med människor, är den försiktiga tolkningen av resultaten obligatorisk3.
Alternativ till den häri presenterade tillvägagångs sätt omfattar vägen för endotoxin administration till lungorna. Som beskrivs av Szarka et al., kan LPS också administreras via intranasal instillation9. LiU et al. jämförde direkt intratrakeal deposition med inandning av aerosolized LPS5. Baserat på deras resultat drog de satsen att inhalations vägen inducerar en mer enhetlig typ av ALI. Emellertid, deras experiment utfördes på råttor med en riktad-flöde näsa-endast inandning och kan därför inte nödvändigt vis överföras till den häri presenterade tillvägagångs sätt. Möss utsätts däremot ofta för aerosolized LPS i en kammare10. Kammar storlek, LPS-koncentration och antalet möss som behandlas samtidigt är variabler som begränsar jämförbarheten mellan olika studier och gör en individuell modell etablering rekommendabel. Sista, intravenös eller intraperitoneal administrering av LPS används ofta för att inducera avlägsna Ali17,18. Som data från Szarka et al. föreslå, den intratrakeal instillation verkar vara överlägsen i.v. eller i.p. rutten när specifika pulmonella inflammatoriska effekter behandlas9. Sammanfattnings vis är protokollet en enkel och reproducerbar metod för att inducera steril ALI i möss för att hantera specifika immunologiska problem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jan Kleiner och Susanne Schulz för att ha tillhandahållit teknisk support. Författarna erkänner det utmärkta stöd av flödet cytometri kärnan anläggningen vid den medicinska fakulteten vid Bonns universitet. Författarna erhöll ingen finansiering från någon extern organisation. En del av de uppgifter som lämnats i resultat sektionen och som skildras i figur 3 har redan visats i en tidigare publikation8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
