Hier wird ein Schrittweiseverfahren vorgestellt, um akute Lungenverletzungen bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit und Lungengewebe durchzuführen. Minimale Invasivität, einfache Handhabung, gute Reproduzierbarkeit und Titration der Schwere der Erkrankung sind Vorteile dieses Ansatzes.
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Methodenartikel
Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Atemwegsverabreichung von Lipopolysaccharid (LPS) ist eine häufige Möglichkeit, Lungenentzündungen und akute Lungenverletzungen (ALI) in Kleintiermodellen zu untersuchen. Es wurden verschiedene Ansätze beschrieben, wie das Einatmen von aerosolisiertem LPS sowie die nasale oder intratracheale Instillation. Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ALI bei Mäusen durch direkte intratracheale LPS-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolader-Flüssigkeit (BAL) und Lungengewebe durchzuführen. Nach intraperitonealer Sedierung wird die Luftröhre exponiert und LPS wird über einen 22 G Venenkatheter verabreicht. Eine robuste und reproduzierbare Entzündungsreaktion mit Leukozyten-Invasion, Upregulation von proinflammatorischen Zytokinen und Störung der Alveolo-Kapillarbarriere wird innerhalb von Stunden bis Tagen induziert, abhängig von der verwendeten LPS-Dosierung. Die Entnahme von Blutproben, BAL-Flüssigkeit und Lungenernte sowie die Verarbeitung für die FACS-Analyse werden im Protokoll ausführlich beschrieben. Obwohl die Verwendung des sterilen LPS nicht geeignet ist, pharmakologische Interventionen bei Infektionskrankheiten zu untersuchen, bietet der beschriebene Ansatz minimale Invasivität, einfache Handhabung und gute Reproduzierbarkeit, um mechanistische immunologische Fragen zu beantworten. Darüber hinaus ermöglichen die Dosistitration sowie die Verwendung alternativer LPS-Präparate oder Mausstämme die Modulation der klinischen Wirkungen, die unterschiedliche Ali-Schweregrade oder einen frühen vs. späten Beginn von Krankheitssymptomen aufweisen können.
Einleitung
Experimentelle Tiermodelle sind in der Grundlegenden Immunforschung unverzichtbar. Die Verabreichung ganzer Bakterien oder mikrobieller Komponenten wurde häufig in Kleintiermodellen verwendet, um lokale oder systemische Entzündungen auszulösen1. Lipopolysaccharid (LPS, oder bakterielles Endotoxin) ist eine Zellwandkomponente und Oberflächenantigen von gramnegativen Bakterien (z. B. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., oder Legionella spp.). Das thermostabile und große Molekül (Molekulargewicht 1-4 x 106 kDa) besteht aus einem Lipidanteil (Lipid A), einem Kernbereich (Oligosaccharid) und einem O-Polysaccharid (oder O-Antigen). Lipid ....
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Protokoll
Dieses Tierprotokoll wurde vom örtlichen Ausschuss für Tierpflege (LANUV, Recklinghausen, Deutschland; Protokoll Nr. 84-02.04.2015) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Nationalen Gesundheitsinstitute für die Verwendung lebender Tiere (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996).
1. ALI-Induktion
- Verwenden Sie erwachsene C57BL/6 Mäuse im Alter von etwa 10-12 Wochen. Beherbergen Sie die Tiere in individuell belüfteten Käfigen mit freiem Zugang zu Wasser und Standard Nagetier Chow. Es ist jedoch möglich, diesen Ansatz bei jüngeren Tieren und mit anderen Mäusestämmen durchzuführen.
- LPS (Escherichia col....
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Ergebnisse
Der beschriebene Ansatz zur Induzieren von ALI bei Mäusen wurde durch die Beurteilung der Zytokinexpression, der Neutrophilen Granulozyteninfiltration und der Alveolo-Kapillarbarrierestörung 24 h und 72 h nach LPS-Instillation validiert. PBS-injizierte Tiere dienten als Kontrolle. Die intratracheale LPS-Verabreichung induzierte eine robuste pulmonale proinflammatorische Reaktion. Die Expression von TNF-A im Lungengewebe wurde signifikant hochreguliert und erreichte eine nachhaltige und mehr als 50-fache Zunahme im Vergle.......
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Diskussion
Minimale Invasivität, einfache Handhabung und gute Reproduzierbarkeit sind die Hauptmerkmale des vorgestellten Ansatzes, ALI in einem kleinen Nagetiermodell zu induzieren. Die Verwendung von LPS anstelle ganzer Bakterien in Tiermodellen hat Vorteile. Es ist eine stabile und reine Verbindung und kann in lyophilisierter Form bis zur Verwendung gespeichert werden. Es ist ein starkes Stimulans für angeborene Immunantworten über den TLR4-Signalweg, und seine biologische Aktivität kann leicht quantifiziert werden, was die Titr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken Jan Kleiner und Susanne Schulz für die technische Unterstützung. Die Autoren würdigen die hervorragende Unterstützung der Durchfluss-Zytometrie-Kernanlage an der medizinischen Fakultät der Universität Bonn. Die Autoren erhielten keine Finanzielle von einer externen Organisation. Ein Teil der im Ergebnisabschnitt angegebenen und in Abbildung 3 dargestellten Daten wurde bereits in einer früheren Veröffentlichung8dargestellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 ml Spritzen | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml Spritzen | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphin hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 Mäuse, weiblich, 10 - 12 Wochen alt | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-Kügelchen (6µ m) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 Gauge 1''BD | , Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 Gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Zellsieb 70 & Mikro; m | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Kollagenase Typ I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Desoxyribonuklease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), steril | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, steril | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS Röhrchen, 5 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Deutschland | 551579 | |
| Fötales Kälberserum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland | 11049-10 | |
| Isofluran | Baxter, Unterschleiß heim, Deutschland | ||
| Ketaminhydrochlorid | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Deutschland | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) aus Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block&Handel;), Klon 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Schere | Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland | 14060-09 | |
| Natriumazid (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Federschere | Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland | 15018-10 | |
| Gewebezange | Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland | 11021-12 | |
| Schläuche | Eppendorf, Hamburg, Deutschland | 30125150 | |
| Venenkatheter, 22 Gauge | B.Braun, Melsungen, Deutschland | 4268091B | |
| Xylazin Hydrochlorid | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Deutschland |
Referenzen
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
