Summary
Hier wird ein Schrittweiseverfahren vorgestellt, um akute Lungenverletzungen bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit und Lungengewebe durchzuführen. Minimale Invasivität, einfache Handhabung, gute Reproduzierbarkeit und Titration der Schwere der Erkrankung sind Vorteile dieses Ansatzes.
Abstract
Die Atemwegsverabreichung von Lipopolysaccharid (LPS) ist eine häufige Möglichkeit, Lungenentzündungen und akute Lungenverletzungen (ALI) in Kleintiermodellen zu untersuchen. Es wurden verschiedene Ansätze beschrieben, wie das Einatmen von aerosolisiertem LPS sowie die nasale oder intratracheale Instillation. Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ALI bei Mäusen durch direkte intratracheale LPS-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolader-Flüssigkeit (BAL) und Lungengewebe durchzuführen. Nach intraperitonealer Sedierung wird die Luftröhre exponiert und LPS wird über einen 22 G Venenkatheter verabreicht. Eine robuste und reproduzierbare Entzündungsreaktion mit Leukozyten-Invasion, Upregulation von proinflammatorischen Zytokinen und Störung der Alveolo-Kapillarbarriere wird innerhalb von Stunden bis Tagen induziert, abhängig von der verwendeten LPS-Dosierung. Die Entnahme von Blutproben, BAL-Flüssigkeit und Lungenernte sowie die Verarbeitung für die FACS-Analyse werden im Protokoll ausführlich beschrieben. Obwohl die Verwendung des sterilen LPS nicht geeignet ist, pharmakologische Interventionen bei Infektionskrankheiten zu untersuchen, bietet der beschriebene Ansatz minimale Invasivität, einfache Handhabung und gute Reproduzierbarkeit, um mechanistische immunologische Fragen zu beantworten. Darüber hinaus ermöglichen die Dosistitration sowie die Verwendung alternativer LPS-Präparate oder Mausstämme die Modulation der klinischen Wirkungen, die unterschiedliche Ali-Schweregrade oder einen frühen vs. späten Beginn von Krankheitssymptomen aufweisen können.
Introduction
Experimentelle Tiermodelle sind in der Grundlegenden Immunforschung unverzichtbar. Die Verabreichung ganzer Bakterien oder mikrobieller Komponenten wurde häufig in Kleintiermodellen verwendet, um lokale oder systemische Entzündungen auszulösen1. Lipopolysaccharid (LPS, oder bakterielles Endotoxin) ist eine Zellwandkomponente und Oberflächenantigen von gramnegativen Bakterien (z. B. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., oder Legionella spp.). Das thermostabile und große Molekül (Molekulargewicht 1-4 x 106 kDa) besteht aus einem Lipidanteil (Lipid A), einem Kernbereich (Oligosaccharid) und einem O-Polysaccharid (oder O-Antigen). Lipid A mit seinen hydrophoben Fettsäureketten verankert das Molekül in einer bakteriellen Membran und vermittelt (nach Abbau von Bakterien) die immunologische Aktivität und Toxizität von LPS. Nach Bindung an das LPS-Bindungsprotein (LBP) ligaieren LPS:LBP-Komplexe den CD14/TLR4/MD2-Rezeptorkomplex, der sich auf der Oberfläche vieler Zelltypen befindet, was eine starke proinflammatorische Reaktion bei NF-B-Kerntranslokation und anschließender Upregulation zytokinexpression2.
Akute Lungenverletzung (ALI) ist definiert als akute hypoxemische Ateminsuffizienz mit bilateralem Lungenödem ohne Herzinsuffizienz3. Atemwegsverwaltung von LPS ist ein üblicher Weg, um Lungenentzündung und ALI4,5,6,7zu induzieren. Obwohl die sterile Substanz nicht geeignet ist, pharmakologische Interventionen bei Infektionskrankheiten zu untersuchen, können mechanistische immunologische Fragen mit ausreichender Genauigkeit beantwortet werden. Die Instillation von LPS in die Luftröhre induziert eine robuste Entzündungsreaktion mit Leukozyten-Invasion, Upregulation von proinflammatorischen Zytokinen und Störung der Alveolo-Kapillarbarriere innerhalb von Stunden bis Tagen, abhängig von der LPS-Dosierung3, 6,7.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ALI bei Mäusen durch intratracheale LPS-Instillation zu induzieren. Das Modell wurde durch die Bewertung der Zytokinexpression, der neutrophilen Granulozyteninvasion und der intraalveolaren Albumin-Leckage wie zuvor beschrieben8validiert.
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Protocol
Dieses Tierprotokoll wurde vom örtlichen Ausschuss für Tierpflege (LANUV, Recklinghausen, Deutschland; Protokoll Nr. 84-02.04.2015) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Nationalen Gesundheitsinstitute für die Verwendung lebender Tiere (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996).
1. ALI-Induktion
- Verwenden Sie erwachsene C57BL/6 Mäuse im Alter von etwa 10-12 Wochen. Beherbergen Sie die Tiere in individuell belüfteten Käfigen mit freiem Zugang zu Wasser und Standard Nagetier Chow. Es ist jedoch möglich, diesen Ansatz bei jüngeren Tieren und mit anderen Mäusestämmen durchzuführen.
- LPS (Escherichia coli O111:B4) in Aliquots in Konzentrationen von 5 mg/ml bei -20 °C lagern. Bei intratrachealer Instillation LPS in steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) auf eine Endkonzentration von 2.000 g/ml verdünnen.
- Wiegen Sie die Maus. Injizieren Sie Ketamin [120 mg/kg Mauskörpergewicht (BW)] und Xylazin (16 mg/kg BW) intraperitoneal (unteres Drittel des Bauches, Paramedian), und warten Sie bis zum Beginn der Anästhesie.
- Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie einen taktilen Stimulus induzieren. Bei unzureichender Anästhesie die Injektion mit Ketamin (30 mg/kg BW) und Xylazin (4 mg/kg BW) wiederholen.
- Stellen Sie die Maus in eine anfällige Position auf einen temperaturgeregelten Tisch, um eine Körpertemperatur von 37 °C zu halten.
- Tragen Sie steriles ophthalmologisches Schmiermittel auf, um die Austrocknung von Hornhäuten unter Anästhesie zu verhindern.
- Heben Sie den Kopf und Haken Schneidezähne auf einem horizontalen Balken etwa 5 cm über dem Tisch positioniert, während die Vorpaws in engem Kontakt mit dem Tisch bleiben. Super-Extend den Hals in einem 90° Winkel relativ zum Tisch (Abbildung 1). Halten Sie die Zunge mit Zange, um die Kehle für einfachere Intubationsbedingungen zu begradigen.
- Schneiden Sie einen Venenkatheter mit 22 Gauge (G) auf eine Länge von 20 mm. Legen Sie den Katheter vorsichtig in vertikaler Richtung entlang der Zungenwurzel ein. Legen Sie eine Kaltlichtquelle auf die Haut über dem Kehlkopf, um die Stimmbänder zu visualisieren und auf die Luftröhre zu zielen. Wenn Widerstand des Kehlkopfes auftritt, ziehen Sie den Katheter ein paar Millimeter zurück, bevor Sie wieder vorrücken.
- Stecken Sie den Katheter ca. 10 mm in die Luftröhre. Stellen Sie sicher, dass die Einfügung nicht zu tief ist, da dies zu einer einseitigen Instillation von Flüssigkeit in den rechten oder linken Hauptbronchus führt.
- Injektion lpS (5 g/g BW) in PBS mit einer Pipette verdünnt [injiziertes Volumen hängt vom Körpergewicht der Maus ab (z. B. 20 g Körpergewicht bei Verwendung von 50 l LPS-Lösung)].
HINWEIS: Die Maus reagiert in der Regel mit Husten oder Vergasen auf die richtige Instillation von Flüssigkeit in die Luftröhre. - Schließen Sie eine Spritze an und fügen Sie einen Bolus von 50 ml Luft hinzu, um sicherzustellen, dass das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Lunge verteilt ist. Entfernen Sie den Katheter langsam.
- Halten Sie den Oberkörper der Maus 30 s lang in aufrechter Position, um ein Auslaufen der Flüssigkeit aus der Luftröhre zu vermeiden.
- Bei scheinbetriebenen Tieren 50 l steriles PBS intratracheal anstelle von LPS injizieren.
- Buprenorphinhydrochlorid 0,08 mg/kg BW subkutan über den Hals unmittelbar nach DER ALI-Induktion und danach alle 12 h, während der ersten 48 h, in die lose Haut in jizieren.
- Halten Sie eine Körpertemperatur von 37 °C, bis das volle Bewusstsein wiedererlangt wird, indem Sie die Maus auf dem Wärmepad halten.
- Übertragen Sie die Maus in einen individuell belüfteten Käfig mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Überwachen Sie die Maus regelmäßig. Abnehmende Körpertemperatur und Atemdepression deutet auf eine ordnungsgemäße Induktion von ALI hin.
2. Blutentnahme, Bronchoalveolar-Lavage, Organentnahme
HINWEIS: Der Zeitpunkt der Einschläfernbildung hängt von der angesprochenen wissenschaftlichen Frage ab. Normalerweise wird es 12-72 h nach LPS-Instillation3,4,9,10durchgeführt. Schweregrad von ALI kann klinisch durch regelmäßige Beobachtung der Körpertemperatur und Atemnot Symptome bestimmt werden11.
- Induzieren Sie anästhesie, indem Sie die Maus in eine mit Isofluran überflutete Kammer legen. Verwenden Sie 3 Vol% Isofluran mit einem Sauerstoffstrom von 1 l/min. Stellen Sie eine tiefe Narkose sicher, indem Sie einen taktilen Stimulus induzieren. Bei unzureichender Tiefe der Anästhesie, Erhöhung Isofluran bis zu 5 Vol%.
- Opfern Sie die Maus in tiefer Anästhesie durch atlanto-okzipitale Dislokation.
- Befestigen Sie die Maus mit Klebeband auf einem Operationstisch und desinfizieren Sie das Fell kurz mit 70% Ethanol über dem Bauch. Öffnen Sie die Bauchhöhle vorsichtig in der Medianlinie mit Schere und Pinzette. Entfernen Sie Teile des Darms, um Zugang zur Vena cava inferior (IVC) direkt zur Wirbelsäule und der Bauchaorta zu erhalten.
- Suchen Sie die Nierenvenen und legen Sie eine gebogene 23 G Kanüle, die mit einer 1 ml Spritze verbunden ist, in das IVC direkt unterhalb des Zusammenflusses der Venen ein. Aspirieren Sie 250 l Blut und übertragen Sie es in ein 1,5 ml-Rohr, das mit einer Lösung mit 20 °L 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gefüllt ist. Schütteln Sie sanft, um das EDTA-Mischen zu erleichtern und legen Sie die Röhre auf Eis.
- Für Bronchoalveolar-Lavage (BAL) drei 1 ml Spritzen mit jeweils 0,5 ml sterilem PBS und 0,1 ml Luft vorbereiten. Kurz das Fell des Halses mit 70% Ethanol desinfizieren und die Luftröhre vorsichtig mit Schere und Pinzette aussetzen. Mobilisieren Sie die Luftröhre und wickeln Sie um eine Naht.
- Führen Sie DIE Luftröhre durch: Punktieren Sie die Luftröhre mit einer Mikroschere und legen Sie einen 22 G Venenkatheter auf eine Länge von 20 mm ein. Befestigen Sie den Katheter mit der Naht und instillieren Sie 0,5 ml steriles PBS und 0,1 ml Luft. Die Flüssigkeit nach 60 s ansaugen. Wiederholen Sie den Vorgang mit den zusätzlichen zwei Spritzen und sammeln Sie das gesamte Aspirat in einem 15 ml Schlauch auf Eis.
- Öffnen Sie den Thorax vorsichtig mit Schere und Pinzette, um die Lunge zu ernten. Schneiden Sie die Membran entlang der Kostenrand und schneiden Sie durch die Rippen mit zwei seitlichen Schnitten. Vermeiden Sie vorsichtig, die Lunge zu punktieren. Heben Sie das Brustbein kranich an und fixieren oder entfernen Sie es.
- Bereiten Sie zwei 10 ml Spritzen mit 37 °C warmem PBS (ohne Kalzium und Magnesium) vor. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Ventrikel. Punktieren Sie den rechten Ventrikel mit einer 26 G Kanüle und spülen Sie die Lungenzirkulation mit dem vorgewärmten PBS. Beachten Sie, dass die Lunge während des Eingriffs blass wird.
- Entfernen Sie den rechten Lappen der Lunge und schneiden Sie ihn in zwei Hälften. Snap-Freeze sie in flüssigem Stickstoff, gefolgt von Langzeitlagerung bei -80 °C für weitere Genexpression und Proteinanalyse.
- Entfernen Sie die gesamte linke Lunge und homogenisieren Sie sie in einer 48-Well-Platte, indem Sie das Gewebe mit Schere und Pinzette zerlegen. Inkubieren Sie das Gewebe in 2 ml Verdauungspuffer [RPMI 1640 mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS) und 0,1% NaN3, Kollagenase I (1 mg/ml) und DNase II (7 mg/ml)] bei 37 °C für 60 min. Führen Sie eine weitere Homogenisierung durch sorgfältige Pipettierung der Lungengewebestücke bis und daunen.
3. Gewebevorbereitung für die FACS-Analyse
- Vorbereiten Sie frischen FACS-Puffer (Tabelle 1): verwenden Sie immer kalzium- und magnesiumfreie PBS, um kationabhängige Zell-zu-Zell-Haftung zu reduzieren und Verklumpen zu verhindern. Ergänzung mit FCS (1%) um Zellen vor Apoptose zu schützen, unspezifische Färbungen zu verhindern und zu verhindern, dass Zellen an den FACS-Röhren kleben. Schließen Sie EDTA (0,5 mM) ein, um kationbasierte Zell-zu-Zell-Adhäsion bei der Arbeit mit klebrigen und anhaftenden Zellen wie Makrophagen zu verhindern. Fügen Sie Natriumazid (0,1 %) hinzu, da es bakterielle Kontamination und Photobleichung von Fluorchromen verhindert und Antikörperabwurf blockiert.
- Übertragen Sie die Blutproben (Schritt 2.4) in 5 ml FACS-Röhrchen und mischen Sie das Blut vorsichtig mit 2 ml roter Blutzelllysepuffer. Legen Sie die Rohre auf Eis und beenden Sie die Reaktion nach 2 min durch Zugabe von 2 ml eiskaltem PBS. Zentrifugieren Sie die Proben für 5 min bei 400 x g und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet mit 60 L FACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen12wieder aus.
HINWEIS: Timing der Euthanaverisierung der Maus beeinflusst Leukozytenzahl als Teil der systemischen Entzündung. Daher wird empfohlen, die Zellzahl in diesem Schritt auf 1 x 106 Zellen/60 l einzustellen, um die besten Färbeergebnisse für die Durchflusszytometrieanalyse zu erzielen. - Zentrifuge BAL-Flüssigkeit (Schritt 2.6) für 5 min bei 400 x g. Den Überstand ansaugen und in flüssigem Stickstoff einfrieren, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei -80 °C für weitere Proteinanalysen. Bal-Zellpellet mit 2 ml kaltem FACS-Puffer resuspendieren und die Suspension dann mit einem 100-m-Netzfilter in ein 5 ml FACS-Rohr übertragen, um die Haare zurückzuhalten.
- Wiederum zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 400 x g. Setzen Sie das Pellet mit 60 L FACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen12aus.
HINWEIS: Timing der Euthanaverisierung der Maus beeinflusst Leukozytenzahl in BAL als Teil der Entzündung. Daher wird empfohlen, die Zellzahl in diesem Schritt auf 1 x 106 Zellen/60 l einzustellen, um die besten Färbeergebnisse für die Durchflusszytometrieanalyse zu erzielen. - Übertragen Sie das verdaute linke Lungengewebe (Schritt 2.10) in ein 5 ml FACS-Rohr mit einem 100-L-Netzfilter, um Klumpen zu extrahieren und den Verdauungsprozess zu beenden, indem 2 ml eiskalter FACS-Puffer hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 400 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 60 L FACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen12wieder ab.
HINWEIS: Timing der Euthanaverisierung der Maus beeinflusst Die Leukozytenzahl im Lungengewebe als Teil der Entzündung. Daher wird empfohlen, die Zellzahl auf 1 x 106 Zellen/60 -L anzupassen, um die besten Färbeergebnisse für die Durchflusszytometrieanalyse zu erzielen. - Für die FACS-Analyse inkubieren Zellen mit CD16/CD32-Antikörper bei 4 °C für 15 min, um die unspezifische Bindung von Immunglobulin an die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Fügen Sie 1 x 10 6 Zellen in 60 l in einem 5 ml-Rohr zu 1x 106 Zellen hinzu.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Master-Mix mit FACS-Puffer und Antikörpern vor, wie in Tabelle 2beschrieben.
- Waschen Sie die Zellen nach dem Blockieren nicht. Fügen Sie 20 l Antikörper-Master-Mix pro Probe hinzu, um ein Endvolumen von 100 l zu erhalten. Inkubieren Sie die Proben für 20 min im Dunkeln bei 4 °C.
- Waschen Sie jede Probe mit 1 ml FACS Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 400 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit FACS-Puffer auf die entsprechende Zellkonzentration für FACS-Messungen aus.
HINWEIS: Es wird eine Zellzahl von 1 x 106 Zellen/500 l vorgeschlagen, um die besten Immun-Phänotypisierungsergebnisse in der FACS-Analyse mit diesem Protokoll zu erzielen. Es wird jedoch empfohlen, Antikörper einzeln zu titrieren. - Falls erforderlich, fügen Sie Live/Dead Färbung vor der Oberflächenfärbung mit spezifischen handelsüblichen Kits8hinzu.
- Fügen Sie schließlich feste Anzahl von kommerziell erhältlichen fluorchromgekoppelten Kalibrierperlen (3 x 105 Perlen in 20 L FACS-Puffer) zu jeder Probe hinzu, um absolute Zellzahlen12zu bestimmen. Die Gating-Strategie für Blut-, BAL- und Gewebezellen ist in Abbildung 2dargestellt.
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Representative Results
Der beschriebene Ansatz zur Induzieren von ALI bei Mäusen wurde durch die Beurteilung der Zytokinexpression, der Neutrophilen Granulozyteninfiltration und der Alveolo-Kapillarbarrierestörung 24 h und 72 h nach LPS-Instillation validiert. PBS-injizierte Tiere dienten als Kontrolle. Die intratracheale LPS-Verabreichung induzierte eine robuste pulmonale proinflammatorische Reaktion. Die Expression von TNF-A im Lungengewebe wurde signifikant hochreguliert und erreichte eine nachhaltige und mehr als 50-fache Zunahme im Vergleich zu den Kontrolltieren [RQ (TNF-A/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD = 20,6); p < 0,05)] (Abbildung 3A). Leukozyten-Invasion in Gewebe und Alveolarraum ist ein Markenzeichen und charakteristisch für die Entwicklung von ALI13. Die FACS-Analyse ergab eine signifikante Infiltration von neutrophilen Granulozyten (NG) in das Lungeninterstitium, wobei die absolute Zellzahl im Vergleich zu den Kontrollen nach 24 h fast um das 9-fache gestiegen ist [65.243 (SD = 15.855) vs. 7.358 (SD = 4.794), p < 0,05] ( Abbildung 3B). Absolute NG-Zahl leicht nach 72 h gesunken; Die Faktorzuwächse im Vergleich zu den Kontrollen blieben jedoch stabil [48.946 (SD = 5.223) vs. 5.510 (SD = 654), p < 0,05]. In Übereinstimmung mit der interstitiellen NG-Infiltration wurde die MMP-9-Expression im gesamten Lungengewebe ebenfalls über den gesamten Beobachtungszeitraum signifikant erhöht [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (SD = 1,5); 72 h: 10,4 (SD = 2,0); p < 0,05] (Abbildung 3C).
NG wurden nicht nur im Lungengewebe, sondern auch in der BAL-Flüssigkeit erhöht. Der Faltenanstieg im Vergleich zu Kontrolltieren war ausgeprägter als im Lungengewebe, wobei absolute NG-Werte 24 h nach ALI-Induktion von 52.005 (SD = 21.906) vs. 1.829 (SD = 1.724) (p < 0,05) (Abbildung3D) betrugen. Nach 72 h wurde die NG auf 37.254 (SD = 4.478) gegenüber 17,0 (SD = 10,8) (p < 0,05) erhöht. Lungenödeme aufgrund einer schweren Beeinträchtigung der Alveolo-Kapillarbarriere ist pathognomononisch für die Entwicklung von ALI, mit LPS schnell induzieren endotheliale Apoptose und erhöhte Permeabilität14,15. Die Analyse des Albumingehalts in BAL-Flüssigkeit durch ELISA ergab einen signifikanten Verlust der Barrierefunktion. 24 h nach LPS-Instillation, Albumin in BAL-Flüssigkeit war 43 ng/mL (SD = 13), verglichen mit 20 ng/mL (SD = 9) unter Kontrollbedingungen (p < 0.05) (Abbildung 3E). Nach 72 h betrug der Albumingehalt bei ALI-Tieren 48 ng/mL (SD = 14), verglichen mit 29 ng/ml (SD = 9) (p < 0,05).
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Intubationseinstellung. Es ist zu beachten, dass der Hals der Maus in einem 90°-Winkel relativ zum Operationstisch super-verlängert werden sollte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : FACS-Gating-Strategie für Blut-, BAL- und Gewebezellen. Beispielhafte Punktflecken der FACS-Analyse werden in Pseudofarbdiagrammen mit zwei Parametern (Dual Color Fluoreszenz) dargestellt. Die Gating-Strategie für die jeweiligen Proben basiert auf einzelnen Zellen. (A) Gating-Baum für Blutzellen: a = abgestorbene Zellen; b = lebende Zellen (nach Leben/toten Zellfärbung; keine CD45-Färbung notwendig, da im Blut eine hohe Autofluoreszenz die Zellpopulationen deutlich unterscheidbar macht); d = neutrophile Granulozyten; e = Monozyten (nach Gr1 und CD115 Färbung). (B) Gating-Baum für bronchoalveolare Spülung (BAL) Flüssigkeit: a = abgestorbene Zellen; b = lebende Zellen (nach Leben/toter Zellfärbung); c = CD45+ Immunzellen; d = neutrophile Granulozyten; und e = Makrophagen (nach Ly6G- und F4/80-Färbung). (C) Gatingbaum für Lungengewebe: a = abgestorbene Zellen; b = lebende Zellen (nach Leben/toter Zellfärbung); c = CD45+ Immunzellen; d = neutrophile Granulozyten; und e = Makrophagen (nach Ly6G- und F4/80-Färbung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Validierung des murinen ALI-Modells gegen Kontrolltiere. (A) Expression von TNF-A im Lungengewebe von weiblichen C57BL/6-Mäusen 24 h und 72 h nach intratrachealer LPS-Instillation (Faltenänderung der Expression von Scheintieren). (B) FACS-Analyse der absoluten neutrophilen Granulozytenzahl im Lungengewebe. (C) Expression von MMP-9 im Lungengewebe (Faltenwechsel der Expression von Scheintieren). (D) FACS-Analyse der absoluten neutrophilen Granulozytenzahl in bronchoalveolarer Spülflüssigkeit. (E) Albumingehalt in BAL-Flüssigkeit [Mittelwert sD, n = 7, Mann-Whitney U-Test, *p < 0,05 (vs. PBS-Steuerung)]. Diese Zahl wurde von Ehrentraut et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name des Materials/Ausrüstung | Volumen (mL) |
| Dulbecco-Phosphatgepufferte Saline (PBS), ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, steril | 1000 |
| Fetales Kalbsserum (FCS) | 1 |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung | 1 |
| Natriumazid (NaN3) | 0,1 |
Tabelle 1: Zusammensetzung des FACS-Puffers.
| Name des Materials/Ausrüstung | Vorgeschlagene Verdünnung | Mastermix für 10 Proben: zu 200 l FACS-Puffer hinzufügen (= 20 l pro Probe): |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 l/100 l | 5 l |
Tabelle 2: Vorbereitung der Mastermischung für FACS-Färbung. Die Tabelle beschreibt die Master-Mix-Vorbereitung für 10 Proben.
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Discussion
Minimale Invasivität, einfache Handhabung und gute Reproduzierbarkeit sind die Hauptmerkmale des vorgestellten Ansatzes, ALI in einem kleinen Nagetiermodell zu induzieren. Die Verwendung von LPS anstelle ganzer Bakterien in Tiermodellen hat Vorteile. Es ist eine stabile und reine Verbindung und kann in lyophilisierter Form bis zur Verwendung gespeichert werden. Es ist ein starkes Stimulans für angeborene Immunantworten über den TLR4-Signalweg, und seine biologische Aktivität kann leicht quantifiziert werden, was die Titration der Krankheitsschwere mit guter Reproduzierbarkeit erleichtert. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Verwendung von LPS als sicheres Modell dient, um akute Bronchitis bei gesunden Probanden beim Menschen zu induzieren und somit die Übersetzung von der Bank ins Bett16zu ermöglichen. Rittirsch et al. haben die dosis- und zeitabhängigen Entwicklungen der charakteristischen Alveolo-Kapillarleckage in einem murinen Modell der intratrachealen LPS-Instillation6nachgewiesen. Dies ermöglicht Dosistitration bestimmte gewünschte Effekte zu erreichen, die verschiedene Grade der ALI Schwere oder frühen vs. späten Beginn der Krankheit Symptome zeigen können. Wenn jedoch unterschiedliche infektiologische oder pharmakologische Probleme angegangen werden sollen (z. B. Antibiotikatherapie), ist ALI, das durch sterile LPS-Instillation induziert wird, kein geeignetes Modell.
Darüber hinaus wurde die Störung der Alveolo-Kapillarbarriere im Vergleich zur intrapulmonären oder intravenösen Verabreichung von Bakterien als eher mild beschrieben 3 ,wobeidie Eignung dieses Modells in Frage gestellt wurde und ob eine veränderte Durchlässigkeit insbesondere untersucht. Die korrekte Platzierung des Katheters, um das LPS bilateral in die unteren Atemwege zu liefern, ist der entscheidende Schritt des Ansatzes. Um eine ordnungsgemäße intratracheale Intubation zu gewährleisten, wird die Visualisierung und Identifizierung des Kehlkopfes durch eine externe Kaltlichtquelle erleichtert. Veränderungen des Atemmusters (z. B. Husten oder Vergasen) bestätigen die korrekte intratracheale Instillation der Flüssigkeit.
Darüber hinaus ist die Wahl von Mausstamm und LPS entscheidend für die Induktion von ALI und die Generierung reproduzierbarer Ergebnisse in diesem Modell und hängt von der angesprochenen wissenschaftlichen Frage ab. Der Literatur zufolge reicht die Dosierung, die verabreicht wird, um eine maximale Wirkung ohne weitere Erhöhung mit eskalierenden Dosierungen zu erzielen, von 10 g/Maus (wenn LPS von Pseudomonas aeruginosa F-D Typ 1 in weibliche BALB/c-Mäuse injiziert wird) bis 50 g/Maus, wenn Injektion von E. coli (Serotyp O111:B4) LPS (das auch im Protokoll verwendet wurde) in männliche C57BL/6 Mäuse6,9. Im Allgemeinen sollen BALB/c-Mäuse empfindlich reagieren, wenn sie mit LPS herausgefordert werden, während C57BL/6-Mäuse resistenter zu sein scheinen3. Daher werden Anfängliche Dosistitrationsexperimente unter Berücksichtigung individueller Bedingungen empfohlen. Dies gilt auch für das Timing von Blut, BAL, und Organ-Sampling. Die Schwere von ALI kann klinisch durch regelmäßige Beobachtung der Körpertemperatur und Atemnotsymptome bestimmt werden. Da Mäuse nur etwa 50% Homologie des TLR4-Rezeptors mit dem Menschen teilen, ist eine sorgfältige Interpretation der Ergebnisse obligatorisch3.
Alternativen zum hier vorgestellten Ansatz sind der Weg der Endotoxin-Verabreichung in die Lunge. Wie von Szarka et al. beschrieben, kann LPS auch über intranasale Instillation9verabreicht werden. Liu et al. verglichen die direkte intratracheale Ablagerung mit der Inhalation von aerosolisiertem LPS5. Basierend auf ihren Erkenntnissen kamen sie zu dem Schluss, dass der Inhalationsweg eine einheitlichere Art von ALI induziert. Ihre Experimente wurden jedoch an Ratten mit einer nur gesteuerten Naseninhalation durchgeführt und können daher nicht notwendigerweise auf den hier vorgestellten Ansatz übertragen werden. Im Gegensatz dazu sind Mäuse oft aerosolisiertem LPS in einer Kammer10ausgesetzt. Kammergröße, LPS-Konzentration und die Anzahl der gleichzeitig behandelten Mäuse sind Variablen, die die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien einschränken und eine individuelle Modelleinrichtung empfehlenswert machen. Zuletzt wird die intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung von LPS häufig verwendet, um entfernte ALI17,18zu induzieren. Wie die Daten von Szarka et al. nahelegen, scheint die intratracheale Instillation dem i.v. oder i.p. Weg überlegen zu sein, wenn spezifische pulmonale entzündliche Wirkungen angesprochen werden9. Zusammenfassend stellt das Protokoll einen einfachen und reproduzierbaren Ansatz dar, um steriles ALI bei Mäusen zu induzieren, um spezifische immunologische Probleme anzugehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Jan Kleiner und Susanne Schulz für die technische Unterstützung. Die Autoren würdigen die hervorragende Unterstützung der Durchfluss-Zytometrie-Kernanlage an der medizinischen Fakultät der Universität Bonn. Die Autoren erhielten keine Finanzielle von einer externen Organisation. Ein Teil der im Ergebnisabschnitt angegebenen und in Abbildung 3 dargestellten Daten wurde bereits in einer früheren Veröffentlichung8dargestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
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