Summary
Præsenteret her er en trin-for-trin procedure til at fremkalde akut lungeskade i mus ved direkte intratrakeal lipopolysaccharid instillation og til at udføre FACS analyse af blodprøver, bronchoalveolær skylning væske, og lungevæv. Minimal invasivitet, enkel håndtering, god reproducerbarhed, og titrering af sygdommens sværhedsgrad er fordele ved denne tilgang.
Abstract
Luftvejs administration af lipopolysaccharid (LPS) er en almindelig måde at studere lungebetændelse og akut lungeskade (ALI) i små dyremodeller. Forskellige tilgange er blevet beskrevet, såsom indånding af aerosoliserede LPS samt nasal eller intratrakeale instillation. Den præsenterede protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin procedure til at inducere Ali i mus ved direkte intratrakeal LPS instillation og udføre FACS analyse af blodprøver, bronchoalveolær skylning (bal) væske, og lungevævet. Efter intraperitoneal sedation er luftrøret eksponeret, og LPS administreres via et 22 G venøs kateter. En robust og reproducerbar inflammatorisk reaktion med leukocyt invasion, upregulering af proinflammatoriske cytokiner, og afbrydelse af alveolo-kapillar barrieren induceres inden for timer til dage, afhængigt af den anvendte LPS dosering. Indsamling af blodprøver, BAL-væske, og lunge høst, samt behandling af FACS analyse, er beskrevet i detaljer i protokollen. Selv om brugen af den sterile LPS ikke er egnet til at studere farmakologiske interventioner i smitsomme sygdomme, den beskrevne tilgang tilbyder minimal invasivitet, enkel håndtering, og god reproducerbarhed til at besvare mekanistiske immunologiske spørgsmål. Desuden giver dosistitrering samt brug af alternative LPS præparater eller muse stammer mulighed for graduering af de kliniske virkninger, som kan udvise forskellige grader af ALI sværhedsgrad eller tidligt vs. forsinket indtræden af sygdomssymptomer.
Introduction
Eksperimentelle dyremodeller er uundværlige i grundlæggende immun forskning. Administration af hele bakterier eller mikrobielle komponenter er ofte blevet brugt i små dyremodeller til at inducere lokal eller systemisk inflammation1. Lipopolysaccharid (LPS eller bakteriel endotoksin) er en cellevægkomponent og et overflade antigen af gramnegative bakterier (f. eks. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. eller legionella spp.). Det termo stabile og store molekyle (molekylvægt 1-4 x 106 kDa) består af en lipid-del (lipid a), kerneregion (oligosaccharid) og et o-polysaccharid (eller o-antigen). Lipid A, med dens hydrofobe fedtsyre kæder, forankrer molekylet i en bakteriel membran og medierer (ved nedbrydning af bakterier) den immunologiske aktivitet og toksicitet af LPS. Efter binding til LPS binding protein (LBP), LPS: LBP komplekser fast CD14/TLR4/MD2 receptor kompleks placeret på overfladen af mange celletyper, inducerer en stærk proinflammatorisk reaktion med NF-κb nukleare translokation og efterfølgende Opregulering af cytokinekspression2.
Akut lungeskade (ALI) er defineret som akut hypoksimisk respirationssvigt med bilateralt lungeødem i fravær af hjerteinsufficiens3. Luftvejs administration af LPS er en almindelig måde at fremkalde pulmonal inflammation og Ali4,5,6,7. Selv om det sterile stof ikke er egnet til at studere farmakologiske interventioner i smitsomme sygdomme, kan mekanistiske immunologiske spørgsmål besvares med tilstrækkelig præcision. Instillation af LPS i luftrøret inducerer en robust inflammatorisk reaktion med leukocyt invasion, upregulering af proinflammatoriske cytokiner, og afbrydelse af alveolo-kapillar barrieren inden for timer til dage, afhængigt af LPS dosering3, 6,7.
Den præsenterede protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin procedure til at inducere Ali i mus ved intratrakeal LPS instillation. Modellen er blevet valideret ved at vurdere cytokin-ekspression, neutrofile granulocyt-invasion og intra-alveolær albumin lækage som tidligere beskrevet8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne dyre protokol blev godkendt af den lokale Komité for dyrepasning (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokol nr. 84-02.04.2015) og blev udført i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed retningslinjer for brug af levende dyr (NIH offentliggørelse Nr. 85-23, revideret 1996).
1. ALI induktion
- Brug voksne C57BL/6-mus i en alder af ca. 10-12 uger. Hus dyrene i individuelt ventilerede bure med fri adgang til vand og standard gnaver Chow. Men det er muligt at udføre denne tilgang på yngre dyr og med andre mus stammer.
- Opbevar LPS (Escherichia coli O111: B4) i aliquoter i koncentrationer på 5 mg/mL ved-20 °C. For intratrakeon instillation fortyndes LPS i sterilt phosphatbufferet saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 2.000 μg/mL.
- Veje musen. Injicer ketamin [120 mg/kg musens legemsvægt (BW)] og xylazin (16 mg/kg LEGEMSvægt) intraperitonealt (lavere en tredjedel af maven, paramedian), og vent indtil begyndelsen af anæstesi.
- Kontroller dybden af anæstesi ved at inducere en taktile stimulus. I tilfælde af utilstrækkelig anæstesi gentages injektionen med ketamin (30 mg/kg BW) og xylazin (4 mg/kg LEGEMSVÆGT).
- Anbring musen i en udsat position på et temperaturkontrolleret bord for at opretholde en legemstemperatur på 37 °C.
- Påfør steril oftalmisk smøremiddel for at forhindre udtørring af hornhinder under anæstesi.
- Løft hovedet og krog fortænder på en vandret bjælke placeret ca. 5 cm over bordet, mens falankser forbliver i tæt kontakt med bordet. Super-Forlæng halsen i en 90 ° vinkel i forhold til bordet (figur 1). Hold tungen med pincet for at rette halsen for lettere intubation betingelser.
- Skær et 22 gauge (G) venøs kateter til en længde på 20 mm. Sæt forsigtigt kateteret i lodret retning langs tungen roden. Anbring en kold lyskilde på huden over strubehovedet for at hjælpe med at visualisere stemmebåndene og sigte efter luftrøret. Hvis strubehovedet-modstanden opstår, trækkes kateteret et par millimeter tilbage, før det fremrykkende igen.
- Sæt katetret ca. 10 mm ind i luftrøret. Sørg for, at indsættelsen ikke er for dyb, da dette vil resultere i ensidig instillation af væske i højre eller venstre hoved bronchus.
- Injicer LPS (5 μg/g LEGEMSvægt) fortyndet i PBS ved hjælp af en pipette [injiceret volumen afhænger af musens legemsvægt (f. eks. 20 g legemsvægt → brug 50 μL LPS opløsning)].
Bemærk: musen vil typisk reagere med hoste eller gasning til korrekt instillation af væske ind i luftrøret. - Tilslut en sprøjte og tilsæt en bolt på 50 mL luft for at sikre, at komplet væskevolumen fordeles i lungerne. Fjern kateteret langsomt.
- Hold musens overkrop i oprejst position i 30 s for at undgå lækage af væsken fra luftrøret.
- I fingerede dyr indsprøjtes 50 μL steril PBS intratracheally i stedet for LPS.
- Injicer buprenorphinhydrochlorid 0,08 mg/kg LEGEMSVÆGT subkutant i den løse hud over halsen umiddelbart efter ALI induktion og hver 12 h derefter, i løbet af de første 48 h.
- Opretholde en kropstemperatur på 37 °C, indtil fuld bevidsthed er genvundet ved at holde musen på opvarmning pad.
- Overfør musen til et individuelt ventileret bur med fri adgang til mad og vand. Overvåg musen regelmæssigt. Faldende kropstemperatur og respirationsdepression indikerer korrekt induktion af ALI.
2. blodprøvetagning, bronkoalveolær skylning, organhøst
Bemærk: timingen af euthanization afhænger af det videnskabelige spørgsmål, der behandles. Normalt, det udføres 12-72 h efter LPS instillation3,4,9,10. Sværhedsgraden af ALI kan bestemmes klinisk ved regelmæssig observation af kropstemperatur og åndedrætsbesvær symptomer11.
- Inducere anæstesi ved at placere musen i et kammer oversvømmet med isofluran. Brug 3 vol% isofluran med en oxygen strøm på 1 L/min. Sørg for dyb narkose ved at inducere en taktile stimulus. I tilfælde af utilstrækkelig dybde af anæstesi, øge isofluran op til 5 vol%.
- Ofrer musen i dyb anæstesi af atlanto-occipital dislocation.
- Fastgør musen med tape på et operationsbord og kort desinficere pels over maven med 70% ethanol. Åbn bughulen forsigtigt i median linjen med saks og pincet. Fjern dele af tarmen for at opnå adgang til Vena cava ringere (IVC) ret til rygsøjlen og abdominal aorta.
- Find nyre vener og Indsæt en bøjet 23 G atraumatiske forbundet til en 1 ml sprøjte ind i IVC direkte under sammenløbet af vener. Aspirer 250 μL blod og Overfør til et 1,5 mL rør fyldt med 20 μL 0,5 M ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) opløsning. Ryst forsigtigt for at lette EDTA-blandingen og sætte røret på is.
- Ved bronkoalveolær skyller (BAL) forberedes tre 1 mL injektionssprøjter med 0,5 mL steril PBS og 0,1 mL luft hver. Hurtigt desinficere pelsen af halsen med 70% ethanol og forsigtigt udsætte luftrør med saks og pincet. Mobilisere luftrøret og wrap omkring en sutur.
- Udfør BAL: punktering af luftrøret ved hjælp af en mikro-saks, og Indsæt et 22 G venøs kateter skåret i en længde på 20 mm. Fastgør kateteret med sutur og instillat 0,5 mL steril PBS og 0,1 mL luft. Sug væsken efter 60 s. Gentag proceduren med de to ekstra sprøjter, og saml hele aspiren i et 15 mL rør på is.
- Åbn forsigtigt brystkassen med saks og pincet for at høste lungerne. Skær mellemgulvet langs costalmargenen og skær gennem ribbenene med to laterale snit. Undgå forsigtigt at punktere lungerne. Løft brystbenet cranialt, og fastgør eller fjern det.
- Tilbered 2 10 mL injektionssprøjter med 37 °C varm PBS (uden calcium og magnesium). Lav en lille indsnit ind i venstre ventrikel. Punktering højre ventrikel med en 26 G atraumatiske og skyl den pulmonale cirkulation med den forvarmede PBS. Vær opmærksom på, at lungerne vender bleg under proceduren.
- Fjern den højre lap af lungerne og skær den i to halvdele. Snap-fryse dem i flydende kvælstof, efterfulgt af langtidsopbevaring ved-80 °C for yderligere genekspression og proteinanalyse.
- Fjern hele venstre lunge og homogenisere det i en 48 brønd plade ved hakning vævet med Scissor og TWEEZER. Vævet inkuieres i 2 ml fordøjelses buffer [rpmi 1640 med 10% føtale kalveserum (FCS) og 0,1% Nan3, kollagenase i (1 mg/ml) og DNase II (7 mg/ml)] ved 37 °c i 60 min. Udfør yderligere homogenisering ved omhyggelig Pipettering af lungevævs delene op og Ned.
3. vævs forberedelse til FACS-analyse
- Forbered frisk FACS buffer (tabel 1): Brug altid calcium-og magnesium-fri PBS til at reducere kation-afhængig celle-til-celle vedhæftning og forhindre klumpning. Supplement med FCS (1%) for at beskytte celler mod apoptose, forhindre ikke-specifik farvning og forhindre, at cellerne klæber til FACS-rørene. Medtag EDTA (0,5 mM) for at forhindre kation-baseret celle-til-celle vedhæftning, når du arbejder med klæbrig og vedklædende celler som makrofager. Tilsæt natrium Azid (0,1%), da det forebygger bakteriel kontaminering og foto blegning af fluorchromer og blokerer antistof afgivelse.
- Blodprøverne (trin 2,4) overføres til 5 mL FACS-rør, og blodet blandes forsigtigt med 2 mL røde blodlegemer lysis-buffer. Sæt rørene på is og Afslut reaktionen efter 2 minutter ved at tilsætte 2 mL iskold PBS. Prøverne centrifugeres i 5 minutter ved 400 x g , og supernatanten kasseres. Celle pillen resuspenderes med 60 μL FACS-buffer og proces for efterfølgende FACS farvning i henhold til tidligere beskrevne protokoller12.
Bemærk: timingen af euthanization af musen påvirker leukocyt tælle som en del af den systemiske inflammation. Derfor anbefales det at justere celletallet til 1 x 106 celler/60 μl i dette trin for at opnå de bedste farvnings resultater for flow cytometri analyse. - Centrifuge BAL-væske (trin 2,6) i 5 min ved 400 x g. Supernatanten aspirerer og fastfryses i flydende nitrogen efterfulgt af langtidsopbevaring ved-80 °C for yderligere proteinanalyse. Tilbage stop BAL-celle pellet med 2 mL kold FACS-buffer, og overfør derefter suspensionen til et 5 mL FACS-rør ved hjælp af et 100 μm mesh-filter for at begrænse hårene.
- Igen centrifugeres prøven i 5 min ved 400 x g. Opslæn pellet med 60 μL FACS buffer og proces for efterfølgende FACS farvning i henhold til tidligere beskrevne protokoller12.
Bemærk: timingen af euthanization af musen påvirker leukocyt tæller i BAL som en del af inflammation. Derfor anbefales det at justere celletallet til 1 x 106 celler/60 μl i dette trin for at opnå de bedste farvnings resultater for flow cytometri analyse. - Overfør det fordøjet venstre lungevæv (trin 2,10) til et 5 mL FACS-rør med et 100 μL mesh-filter for at udtrække klumper og afslutte fordøjelsesprocessen ved at tilsætte 2 mL iskold FACS-buffer. Prøven centrifugeres i 5 minutter ved 400 x g. Supernatanten kasseres, og pellet resuspenderes med 60 μL FACS-buffer og proces for efterfølgende FACS farvning i henhold til tidligere beskrevne protokoller12.
Bemærk: timingen af euthanization af musen påvirker leukocyt tælle i lungevæv som en del af inflammation. Derfor anbefales det at justere celletallet til 1 x 106 celler/60 μl for at opnå de bedste farvnings resultater for flow cytometri analyse. - For FACS-analyse, inkube celler med CD16/CD32-antistof ved 4 °C i 15 min for at blokere ikke-specifik binding af immunglobulin til FC-receptorer. Der tilsættes 20 μL blokerende opløsning til 1 x 106 celler i 60 μl i et 5 ml rør.
- I mellemtiden skal der tilberedes en masterblanding med FACS-buffer og antistoffer som beskrevet i tabel 2.
- Efter blokering må cellerne ikke vaskes. Der tilsættes 20 μL antistof mastermix pr. prøve for at opnå et endeligt volumen på 100 μL. Inkubeter prøverne i 20 min i mørke ved 4 °C.
- Hver prøve vaskes med 1 mL FACS-buffer, og der centrifugeres i 5 minutter ved 400 x g. Supernatanten kasseres, og pellet resuspenderes med FACS-buffer til den relevante celle koncentration til FACS-målinger.
Bemærk: et celle nummer på 1 x 106 celler/500 μl foreslås for at opnå de bedste immun fænotyping resultater i FACS analyse med denne protokol. Det anbefales dog, at antistoffer titreres individuelt. - Hvis det er nødvendigt, tilsættes levende/døde farvning før overfladen farvning ved hjælp af specifikke kommercielt tilgængelige kits8.
- Endelig tilsættes et fast antal kommercielt tilgængelige fluorokrom-koblede kalibrerings perler (3 x 105 perler i 20 ΜL FACS buffer) til hver prøve for at bestemme absolutte cellenumre12. Den gating strategi for blod, BAL, og vævs celler er vist i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne tilgang til at inducere ALI i mus blev valideret ved at vurdere cytokinekspression, neutrofile granulocyt infiltration og alveolo-kapillar barriere forstyrrelse 24 h og 72 h efter LPS instillation. PBS-injicerede dyr tjente som kontrol. Intratracheal LPS administration inducerede en robust pulmonal proinflammatorisk respons. Ekspression af TNF-α i lungevæv var signifikant upreguleret og nåede en vedvarende og mere end 50 gange større sammenlignet med kontroldyr [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD = 20,6); p < 0,05)] (figur 3a). Leukocyt invasion i væv og alveolært rum er et kendetegn og karakteristisk for udviklingen af ALI13. FACS-analysen afslørede en signifikant infiltration af neutrofile granulocytter (NG) i lunge interstitiel, hvor absolutte celletal var steget næsten 9 gange sammenlignet med kontrollerne efter 24 timer [65.243 (SD = 15.855) vs. 7.358 (SD = 4.794), p < 0,05] ( Figur 3B). Det absolutte NG-tal faldt svagt efter 72 h; faktor stigningerne i forhold til kontrollerne forblev dog stabile [48.946 (SD = 5.223) vs. 5.510 (SD = 654), p < 0,05]. I overensstemmelse med interstitiel NG-infiltration var MMP-9-ekspression i hele lungevæv ligeledes signifikant forøget i den samlede observationsperiode [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (SD = 1,5); 72 h: 10,4 (SD = 2,0); p < 0,05] (figur 3C).
NG blev ikke kun forøget i lungevæv, men også i BAL-væsken. Den fold stigning sammenlignet med kontroldyrene var mere udtalt end i lungevæv, med absolut NG tæller 24 h efter ALI induktion af 52.005 (SD = 21.906) vs. 1.829 (SD = 1.724) (p < 0,05) (figur 3D). Efter 72 h blev NG forhøjet til 37.254 (SD = 4.478) vs. 17,0 (SD = 10,8) (p < 0,05). Lungeødem på grund af svær svækkelse af alveolo-kapillar barrieren er pathognomonisk for udviklingen af Ali, med LPS hurtigt inducerende endotel apoptose og øget permeabilitet14,15. Analyse af albumin indhold i BAL-væske af ELISA afslørede et betydeligt tab af barriere funktion. 24 timer efter LPS-instillation var albumin i BAL-væske 43 ng/mL (SD = 13) sammenlignet med 20 ng/mL (SD = 9) under kontrolbetingelser (p < 0,05) (figur 3E). Efter 72 h, i ALI-dyr, var albumin indholdet 48 ng/mL (SD = 14) sammenlignet med 29 ng/mL (SD = 9) (p < 0,05).
Figur 1 : Skematisk diagram af intubation-indstillingen. Det skal bemærkes, at musens hals skal være super-forlænget ved en 90 ° vinkel i forhold til operationsbordet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : FACS gating strategi for blod, bal, og vævs celler. Eksemplariske dot klatter af FACS analyse er vist i to-parameter (dobbelt farve fluorescens) pseudo farve plots. Gating strategi for de respektive prøver er baseret på enkeltceller. (A) gating træet for blodlegemer: A = døde celler; b = levende celler (i henhold til levende/døde celle farvning; ingen CD45 farvning nødvendig som i blodet, høj autofluorescens gør cellepopulationer klart skelnes); d = neutrofile granulocytter; e = monocytter (i henhold til Gr1 og CD115 farvning). (B) gating træ til bronchoalveolær SKYLLER (bal) væske: a = døde celler; b = levende celler (i henhold til levende/døde celle farvning); c = CD45+ immunceller; d = neutrofile granulocytter; og e = makrofager (i henhold til Ly6G og F4/80 farvning). C) gating-træ til lungevæv: a = døde celler; b = levende celler (i henhold til levende/døde celle farvning); c = CD45+ immunceller; d = neutrofile granulocytter; og e = makrofager (i henhold til Ly6G og F4/80 farvning). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Validering af murine Ali model mod kontroldyr. (A) ekspression af TNF-α i lungevæv af kvindelige C57BL/6 mus 24 h og 72 h efter intratrakes instillation (fold skift af ekspression af fingerede dyr). (B) FACS analyse af absolut neutrofile granulocyttal i lungevæv. C) ekspression af MMP-9 i lungevæv (fold skift af ekspression af fingerede dyr). (D) FACS analyse af absolut neutrofile granulocyttal i bronchoalveolær skylning væske. E) albumin indhold i bal-væske [gennemsnit ± SD, n = 7, Mann-Whitney U-test, * p < 0,05 (vs. PBS-kontrol)]. Dette tal er blevet ændret fra Ehrentraut et al.8. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn på materiale/udstyr | Volumen (mL) |
| Dulbeccos fosfat bufferet saltvand (PBS) uden calciumchlorid og magnesiumchlorid, steril | 1000 af |
| Føtal kalveserum (FCS) | 1 |
| Ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) opløsning | 1 |
| Natriumazid (NaN3) | 0,1 af |
Tabel 1: sammensætning af FACS-bufferen.
| Navn på materiale/udstyr | Foreslået fortynding | Mastermix til 10 prøver: Tilsæt til 200 μl FACS buffer (= 20 μl pr. prøve): |
| Anti-CD115 (c-FMS) APC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD11b (M1/70)-FITC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD45 (30-F11)-eF450 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-F4/80 (BM-8)-PE Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6C (HK 1.4) PerCP-CY 5.5 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
Tabel 2: klargøring af Master Mix til FACS farvning. Tabellen beskriver forberedelse af Master Mix til 10 prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimal invasivitet, enkel håndtering, og god reproducerbarhed er centrale elementer i den præsenterede tilgang til at inducere ALI i en lille gnaver model. Brugen af LPS i stedet for hele bakterier i dyremodeller har fordele. Det er en stabil og ren sammensatte og kan opbevares i lyofiliseret form indtil brug. Det er en potent stimulerende for medfødte immunrespons via TLR4 pathway, og dens biologiske aktivitet kan let kvantificeres, lette titrering af sygdommens sværhedsgrad med god reproducerbarhed. Desuden, brugen af LPS har vist sig at fungere som sikker model til at fremkalde akut bronkitis i human raske frivillige og dermed tillader oversættelse fra bænk til seng16. Rittirsch et al. har påvist den dosis-og tidsafhængige udvikling af den karakteristiske alveolo-kapillar lækage i en murine model af intratrakeal LPS instillation6. Dette giver mulighed for dosistitrering for at opnå visse ønskede virkninger, som kan illustrere forskellige grader af ALI sværhedsgrad eller tidligt vs. sent udbrud af sygdomssymptomer. Men hvis der skal gribes ind over for forskellige smitsomme eller farmakologiske problemer (f. eks. antibiotikabehandling), er ALI induceret af steril LPS instillation ikke en egnet model.
Sammenlignet med intrapulmonal eller intravenøs levering af bakterier blev forstyrrelsen af alveolo-kapillar barrieren desuden beskrevet som værende ret mild3, idet man satte spørgsmålstegn ved egnetheden af denne model, og om ændret permeabilitet skulle undersøgt nærmere. Korrekt placering af kateteret til at levere LPS bilateralt i de nedre luftveje er det kritiske trin i tilgangen. For at sikre, at intubationen er korrekt, lettes visualisering og identifikation af strubehovedet ved en ekstern kold lyskilde. Ændringer i åndedræts mønstret (f. eks. hoste eller gasning) bekræfter den korrekte intratrakeinstillation af væsken.
Desuden er valget af mus stamme og LPS er afgørende for induktion af ALI og generation af reproducerbare resultater i denne model og afhænger af det videnskabelige spørgsmål rettet. Ifølge litteratur, dosering administreret til at fremkalde en maksimal effekt uden yderligere stigning med eskalerende doser spænder fra 10 μg/mus (når LPS fra Pseudomonas aeruginosa F-D type 1 injiceres i kvindelige Balb/c mus) til 50 μg/mus, når injektion af E. coli (serotype O111: B4) LPS (som også blev anvendt i protokollen) til mandlige C57BL/6 mus6,9. Generelt, BALB/c mus formodes at reagere følsomt, når udfordret med LPS, mens C57BL/6 mus synes at være mere resistente3. Derfor anbefales forsøg med initialdosis titrering under overholdelse af individuelle betingelser. Dette gælder også for timingen af blod, BAL, og organ prøvetagning. Sværhedsgraden af ALI kan bestemmes klinisk ved regelmæssig observation af kropstemperatur og åndedrætsbesvær symptomer. Endvidere, da mus kun deler ca 50% homologi af TLR4-receptoren med mennesker, omhyggelig fortolkning af resultaterne er obligatorisk3.
Alternativer til den heri præsenterede tilgang omfatter ruten af endotoksin administration til lungerne. Som beskrevet af Szarka et al., kan LPS også administreres via intranasal instillation9. Liu et al. sammenlignede den direkte intratrakeale aflejring med indånding af aerosoliseret LPS5. På grundlag af deres resultater konkluderede de, at den inhalationsmæssige rute inducerer en mere ensartet type af ALI. Men, deres eksperimenter blev udført i rotter med en instrueret-flow næse-kun indånding og kan derfor ikke nødvendigvis overføres til den heri præsenterede tilgang. I modsætning hertil er mus ofte udsat for aerosoliserede LPS i et kammer10. Kammer størrelse, LPS-koncentration og antallet af mus, der behandles samtidigt, er variabler, der begrænser sammenligneligheden mellem forskellige undersøgelser og gør en individuel model virksomhed anbefalbar. Sidste, intravenøs eller intraperitoneal administration af LPS bruges ofte til at inducere fjerntliggende Ali17,18. Som dataene fra Szarka et al. antyder, synes intratrakeinstillationen at være overlegen i forhold til i.v.-eller IP-ruten, når specifikke pulmonale inflammatoriske virkninger behandles9. Konklusionen er, at protokollen repræsenterer en enkel og reproducerbar tilgang til at inducere steril ALI i mus til at behandle specifikke immunologiske problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Jan Kleiner og Susanne Schulz for at yde teknisk støtte. Forfatterne anerkender den fremragende støtte af flow cytometri kerne facilitet på det medicinske fakultet ved Bonn Universitet. Forfatterne modtog ingen støtte fra nogen ekstern organisation. En del af de data, der er angivet i resultatafsnittet og afbildet i figur 3 , er allerede vist i en tidligere publikation8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
