Summary
Her presenteres en trinnvis fremgangsmåte for å indusere akutt lungeskade hos mus ved direkte intratrakeal lipopolysakkarid drypping og for å utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming og lunge vev. Minimal invasiveness, enkel håndtering, god reproduserbarhet og titrering av alvorlighetsgraden av sykdommen er fordelene med denne tilnærmingen.
Abstract
Luftveis administrering av lipopolysakkarid (LPS) er en vanlig måte å studere lungebetennelse og akutt lungeskade (ALI) i små dyremodeller. Ulike tilnærminger har blitt beskrevet, slik som inhalasjon av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal drypping. Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved direkte intratrakeal LPS drypping og utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming (BAL) væske, og lunge vev. Etter intraperitoneal sedasjon, luftrøret er eksponert og LPS administreres via en 22 G venøs kateter. En robust og reproduserbar inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere er indusert i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering brukt. Innsamling av blodprøver, BAL-væske, og lunge høsting, samt behandling for FACS analyse, er beskrevet i detalj i protokollen. Selv om bruken av den sterile LPS-en ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, tilbyr den beskrevne tilnærmingen minimalt invasiveness, enkel håndtering og god reproduserbarhet for å besvare mekanistisk immunologiske spørsmål. Videre, dosetitrering samt bruk av alternative LPS preparater eller mus stammer tillate modulering av de kliniske effektene, som kan vise ulike grader av ALI alvorlighetsgrad eller tidlig g. sen utbruddet av sykdomssymptomer.
Introduction
Eksperimentelle dyremodeller er uunnværlig i grunnleggende immun forskning. Administrasjon av hele bakterier eller mikrobielle komponenter har blitt hyppig brukt i små dyremodeller for å indusere lokal eller systemisk betennelse1. Lipopolysakkarid (LPS, eller bakteriell endotoksin) er en cellevegg komponent og overflateantigen av gram-negative bakterier (f. eks, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Det thermostable og store molekylet (molekylvekt 1-4 x 106 KDA) består av en lipid moiety (lipid a), kjerne region (Oligosaccharide), og en o polysakkarid (eller O antigen). Lipid A, med sine hydrofobe fettsyrer kjeder, forankrer molekylet til en bakteriell membran og formidler (ved nedbrytning av bakterier) den immunologiske aktivitet og toksisitet av LPS. Etter binding til LPS bindende protein (LBP), LPS: LBP komplekser ombinde CD14/TLR4/MD2 reseptoren komplekset ligger på overflaten av mange celletyper, inducing en sterk proinflammatoriske reaksjon med NF-KB kjernefysiske translokasjon og påfølgende oppregulering av cytokin uttrykk2.
Akutt lungeskade (ALI) er definert som akutt hypoksemirespirasjonssvikt respirasjonssvikt med bilateral lungeødem i fravær av hjertesvikt3. Luftveis administrering av LPS er en vanlig måte å indusere lungebetennelse og Ali4,5,6,7. Selv om det sterile stoffet ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, kan mekanistisk immunologiske spørsmål besvares med tilstrekkelig presisjon. Drypping av LPS inn i luftrøret induserer en robust inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering3, 6,7.
Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved intratrakeal LPS drypping. Modellen har blitt validert ved å vurdere cytokin uttrykk, nøytrofile granulocytt invasjon, og intra-alveolære albumin lekkasje som tidligere beskrevet8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette dyret protokollen ble godkjent av den lokale komiteen for dyr omsorg (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokoll nr. 84-02.04.2015) og ble utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer for bruk av levende dyr (NIH publikasjon Nr. 85-23, revidert 1996).
1. ALI induksjon
- Bruk voksen C57BL/6 mus i alderen av ca 10-12 uker. Huset dyrene i individuelt ventilert bur med fri tilgang til vann og standard gnager Chow. Det er imidlertid mulig å utføre denne tilnærmingen på yngre dyr og med andre mus stammer.
- Lagre LPS (Escherichia coli O111: B4) i alikvoter i konsentrasjoner på 5 mg/mL ved-20 ° c. For intratrakeal drypping, fortynne LPS i steril fosfat-bufret saltvann (PBS) til en endelig konsentrasjon av 2 000 μg/mL.
- Veie musa. Injiser ketamin [120 mg/kg mus kroppsvekt (BW)] og xylazine (16 mg/kg BW) intraperitonealt (lavere en tredjedel av buken, paramedian), og vent til utbruddet av anestesi.
- Sjekk dybden av anestesi ved å indusere en taktil stimulans. Ved utilstrekkelig anestesi, gjenta injeksjonen med ketamin (30 mg/kg BW) og xylazine (4 mg/kg BW).
- Plasser musen i liggende posisjon på et temperatur kontrollert bord for å opprettholde en kroppstemperatur på 37 ° c.
- Påfør sterilt smøremiddel for å hindre uttørking av hornhinner under anestesi.
- Løft hodet og kroken fortenner på en horisontal linje plassert ca 5 cm over bordet mens forepaws forblir i nær kontakt med bordet. Super-forlenge nakken i en 90 ° vinkel i forhold til bordet (figur 1). Hold tungen med pinsett for å rette halsen for enklere intubering forhold.
- Skjær en 22 gauge (G) venøs kateter til en lengde på 20 mm. forsiktig inn kateteret i vertikal retning langs tungen rot. Legg en kald lyskilde på huden over strupen for å hjelpe til med å visualisere vokal akkorder og sikte på luftrøret. Hvis motstanden i strupen oppstår, trekke kateteret noen få millimeter før fremme igjen.
- Sett kateteret ca. 10 mm inn i luftrøret. Pass på at innsettingen ikke er for dyp, da dette vil føre til ensidig drypping av væsken i høyre eller venstre hoved bronkie.
- Injiser LPS (5 μg/g BW) fortynnet i PBS ved hjelp av en pipette [injisert volum avhenger av mus kroppsvekt (f.eks. 20 g kroppsvekt → bruk 50 μL av LPS-løsning)].
Merk: musen vil vanligvis svare med hoste eller gisper til riktig drypping av væske i luftrøret. - Koble til en sprøyte og Legg til en bolus med 50 mL luft for å sikre at komplett væske volum fordeles i lungene. Fjern kateteret langsomt.
- Hold musen over overkroppen i oppreist stilling i 30 s for å unngå lekkasje av væsken fra luftrøret.
- I humbug-opererte dyr, injisere 50 μL av sterile PBS intratracheally stedet for LPS.
- Injiser med buprenorfin-hydrochloride 0,08 mg/kg BW subkutant i den løse huden over nakken rett etter ALI induksjon og hver 12 h deretter, i løpet av første 48 h.
- Opprettholde en kroppstemperatur på 37 ° c til full oppmerksomhet er gjenvunnet ved å holde musen på oppvarmingen puten.
- Overfør musen til et individuelt ventilert bur med fri tilgang til mat og vann. Overvåk musen regelmessig. Redusere kroppstemperatur og Respirasjonsdepresjon indikerer riktig induksjon av ALI.
2. blodprøve, lunges tømming, orgel høsting
Merk: timing av euthanization avhenger av vitenskapelige problemet adressert. Vanligvis er det utført 12-72 h etter LPS drypping3,4,9,10. Alvorlighetsgraden av ALI kan fastslås klinisk ved regelmessig observasjon av kroppstemperatur og respirasjons nød symptomer11.
- Indusere anestesi ved å plassere musen i et kammer oversvømmet med isoflurane. Bruk 3 Vol% isoflurane med en oksygen strøm på 1 L/min. sikre dyp narkose ved å indusere en taktil stimulans. I tilfelle av utilstrekkelig dybde av anestesi, øke isoflurane opp til 5 Vol%.
- Ofre musen i dyp bedøvelse ved atlanto-occipital forvridning.
- Fest musen med tape på et operasjonsbord og kort desinfisere pelsen over magen med 70% etanol. Åpne bukhulen forsiktig i median linje med saks og pinsett. Fjern deler av tarmen for å oppnå tilgang til vena cava mindreverdig (IVC) rett til vertebrale kolonnen og abdominal aorta.
- Finn nyre årer og sett inn en bøyd 23 G canula koblet til en 1 mL sprøyte inn i IVC direkte under samløpet av venene. Aspirer 250 μL av blod og overføring til et 1,5 mL rør fylt med 20 μL av 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning. Rist forsiktig for å lette EDTA miksing og sette røret på isen.
- For lunges tømming (BAL) klargjør du tre 1 mL sprøyter med 0,5 mL steril PBS og 0,1 mL luft hver. Kort desinfisere pelsen av halsen med 70% etanol og forsiktig utsette luftrøret med saks og pinsett. Mobilisere luftrøret og vikle rundt en Sutur.
- Utfør BAL: punktering av luftrøret ved hjelp av mikro-saks og sett inn en 22 G venøs kateter kuttet til en lengde på 20 mm. Fest kateteret med Sutur og instillate 0,5 mL sterilt PBS og 0,1 mL luft. Aspirer væsken etter 60 s. Gjenta prosedyren med de to ekstra sprøyter og samle hele aspirer i et 15 mL rør på isen.
- Åpne forsiktig thorax med saks og pinsett for å høste lungene. Skjær membranen langs Costal margin og skjære gjennom ribbeina med to lateral snitt. Forsiktig unngå punktering lungene. Løft den bryst cranially og reparer eller fjern den.
- Forbered 2 10 mL sprøyter med 37 ° c varm PBS (uten kalsium og magnesium). Lag et lite snitt i venstre ventrikkel. Punktering høyre ventrikkel med en 26 G canula og skyll lunge sirkulasjonen med prewarmed PBS. Vær oppmerksom på lungene snu blek under inngrepet.
- Fjern høyre flik av lungene og skjær den i to halvdeler. Fest dem i flytende nitrogen, etterfulgt av langtidslagring ved-80 ° c for videre genuttrykk og proteinanalyse.
- Fjern hele venstre lunge og homogenisere den i en 48 brønn plate ved å hakking vevet med saks og TWEEZER. Ruge vevet i 2 mL av fordøyelsen buffer [RPMI 1640 med 10% fosterets kalv serum (FCS) og 0,1% NaN3, kollagenase I (1 mg/ml), og DNase II (7 mg/ml)] ved 37 ° c for 60 min. Utfør ytterligere homogenisering av forsiktig pipettering av lungevevet bitene opp og Ned.
3. vevs forberedelser for FACS-analyse
- Forbered frisk FACS buffer (tabell 1): Bruk alltid kalsium-og magnesium-fri PBS for å redusere den ikke-avhengige celle-til-celle vedheft og forhindre klumper. Tillegg med FCS (1%) å beskytte celler fra apoptose, hindre ikke-spesifikke flekker, og hindre celler fra å stikke til FACS rør. Inkluder EDTA (0,5 mM) for å hindre at den er basert på celle-til-celle-vedheft når du arbeider med klebrige og tilhenger celler som makrofager. Legg natrium Natriumazid (0,1%), som det hindrer bakteriell forurensning og photobleaching av fluorokromer og blokkerer antistoff shedding.
- Overfør blodprøvene (trinn 2,4) til 5 mL FACS-rør og bland blodet forsiktig med 2 mL rød blod cellelyse Rings buffer. Sett rørene på isen og avslutte reaksjonen etter 2 min ved å legge 2 mL iskald PBS. Sentrifuger prøvene i 5 minutter ved 400 x g og kast supernatanten. Resuspend celle pellet med 60 μL av FACS buffer og prosess for påfølgende FACS farging i henhold til tidligere beskrevne protokoller12.
Merk: timing av euthanization av musen påvirker leukocytter telle som en del av systemisk betennelse. Derfor anbefales det å justere celle tallet til 1 x 106 celler/60 μL i dette trinnet for å oppnå de beste fargeresultatene for strømnings flowcytometri analyse. - Sentrifuger BAL-væske (trinn 2,6) i 5 min ved 400 x g. Aspirer supernatanten og Frys den i flytende nitrogen, etterfulgt av langtidslagring ved-80 ° c for ytterligere proteinanalyse. Resuspend BAL celle pellet med 2 mL kaldt FACS buffer, deretter overføre suspensjonen til en 5 mL FACS tube ved hjelp av en 100 μm mesh filter for å holde hår.
- Igjen, sentrifuger prøven i 5 min ved 400 x g. Resuspend pellet med 60 μL av FACS buffer og prosess for påfølgende FACS farging i henhold til tidligere beskrevne protokoller12.
Merk: timing av euthanization av musen påvirker leukocytter telle i BAL som en del av betennelsen. Derfor anbefales det å justere celle tallet til 1 x 106 celler/60 μL i dette trinnet for å oppnå de beste fargeresultatene for strømnings flowcytometri analyse. - Overfør fordøyd venstre lunge vev (trinn 2,10) til en 5 mL FACS tube ved hjelp av en 100 μL mesh filter for å trekke klumper og avslutte fordøyelsen prosessen ved å legge til 2 mL iskald FACS buffer. Sentrifuger prøven i 5 minutter ved 400 x g. Kast supernatanten og resuspend pellet med 60 μL av FACS buffer og prosess for påfølgende FACS farging i henhold til tidligere beskrevne protokoller12.
Merk: timing av euthanization av musen påvirker leukocytter telle i lunge vev som en del av betennelsen. Derfor anbefales det å justere celle tallet til 1 x 106 celler/60 μL for å oppnå de beste fargeresultatene for strømnings flowcytometri analyse. - For FACS-analyse ruge celler med CD16/CD32-antistoff ved 4 ° c i 15 minutter for å blokkere ikke-spesifikk binding av immunglobulin til FC-reseptorene. Tilsett 20 μL av blokkerings løsning til 1 x 106 celler i 60 μL i et 5 ml rør.
- I mellomtiden forbereder en Master Mix med FACS buffer og antistoffer som beskrevet i tabell 2.
- Etter blokkering, ikke vaske cellene. Tilsett 20 μL av antistoff Master blanding per prøve for å oppnå et endelig volum på 100 μL. ruge prøvene i 20 minutter i mørket ved 4 ° c.
- Vask hver prøve med 1 mL FACS buffer og sentrifuger i 5 min ved 400 x g. Kast supernatanten og resuspend pellet med FACS buffer til riktig celle konsentrasjon for FACS målinger.
Merk: et celle nummer på 1 x 106 celler/500 μL foreslås for å oppnå den beste immun bestemmelse av fenotype resultater i FACS-analyse med denne protokollen. Det anbefales imidlertid at antistoffer må titrert individuelt. - Om nødvendig, Legg til levende/Dead farging før overflaten farging ved hjelp av spesifikke kommersielt tilgjengelige kits8.
- Til slutt legger du til et fast antall kommersielt tilgjengelige fluorokromkonjugert kalibrerings perler (3 x 105 perler i 20 ΜL av FACS buffer) til hver prøve for å bestemme absolutte celle tall12. Den gating strategien for blod, BAL, og vev celler er vist i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne tilnærmingen til å indusere ALI i mus ble validert ved å vurdere cytokin uttrykk, nøytrofile granulocytt infiltrasjon, og alveolo-kapillær barriere avbrudd 24 h og 72 h etter LPS drypping. PBS-injisert dyr fungerte som kontroll. Intratrakeal LPS administrasjon indusert en robust lunge proinflammatoriske respons. Uttrykk for TNF-α i lungevevet var signifikant upregulated, nådde en varig og mer enn 50-fold økning sammenlignet med kontroll dyrene [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD = 20,6); p < 0,05)] (Figur 3a). Leukocytter invasjon i vev og alveolære plass er et kjennetegn og karakteristisk for utviklingen av ALI13. FACS analyse avdekket en betydelig infiltrasjon av nøytrofile granulocytter (NG) i lunge interstitium, med absolutte celle tall har økt nesten 9-fold i forhold til kontrollene etter 24 h [65 243 (SD = 15 855) vs 7 358 (SD = 4 794), p < 0,05] ( Figur 3B). Absolute NG teller litt redusert etter 72 h; Men, faktoren øker i forhold til kontrollene forble stabile [48 946 (SD = 5 223) vs. 5 510 (SD = 654), p < 0,05]. I samsvar med interstitiell NG infiltrasjon, var MMP-9 uttrykk i hele lungevevet også betydelig økt over den totale observasjonsperioden [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (SD = 1,5); 72 h: 10,4 (SD = 2,0); p < 0,05] (Figur 3C).
NG var ikke bare økt i lunge vev, men også i BAL væsken. Den fold økning i forhold til kontroll dyr var mer uttalt enn i lunge vev, med absolutte NG teller 24 h etter ALI induksjon av 52 005 (SD = 21 906) vs. 1 829 (SD = 1 724) (p < 0,05) (Figur 3D). Etter 72 h, ble NG økt til 37 254 (SD = 4 478) vs 17,0 (SD = 10,8) (p < 0,05). Lungeødem på grunn av alvorlig svekkelse av alveolo-kapillær barrieren er Patognomonisk for utviklingen av Ali, med LPS raskt inducing endothelial apoptose og økt permeabilitet14,15. Analyse av albumin innhold i BAL Fluid av ELISA avdekket et betydelig tap av barrierefunksjon. 24 h etter LPS drypping, albumin i BAL Fluid var 43 ng/mL (SD = 13), sammenlignet med 20 ng/mL (SD = 9) under kontroll forhold (p < 0,05) (Figur 3E). Etter 72 h, i ALI dyr, var albumin innhold 48 ng/mL (SD = 14), sammenlignet med 29 ng/mL (SD = 9) (p < 0,05).
Figur 1 : Skjematisk diagram av intubering innstilling. Det bør bemerkes at musen halsen skal være super-utvidet ved en 90 ° vinkel i forhold til operasjonsbordet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : FACS gating strategi for blod, Bal, og vev celler. Eksemplarisk prikk blots av FACS analyse er vist i to-parameter (dual Color fluorescens) pseudofarger tomter. Gating strategi for de respektive prøvene er basert på enkeltceller. (A) gating treet for blodceller: A = døde celler; b = levende celler (i henhold til levende/døde celle flekker; ingen CD45 farging nødvendig som i blodet, høy autofluorescence gjør cellen populasjoner klart gjenkjennelig); d = nøytrofile granulocytter; e = monocytter (i henhold til Gr1 og CD115 farging). (B) gating treet for lunges tømming (Bal) væske: a = døde celler; b = levende celler (i henhold til levende/døde celle farging); c = CD45+ immunceller; d = nøytrofile granulocytter; og e = makrofager (i henhold til Ly6G og F4/80 farging). (C) gating treet for lunge vev: a = døde celler; b = levende celler (i henhold til levende/døde celle farging); c = CD45+ immunceller; d = nøytrofile granulocytter; og e = makrofager (i henhold til Ly6G og F4/80 farging). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Validering av MURINE Ali-modell mot kontroll dyr. (A) uttrykk for TNF-α i lunge vev av kvinnelige C57BL/6 mus 24 h og 72 h etter intratrakeal LPS drypping (fold endring av uttrykk for humbug operert dyr). (B) FACS analyse av absolutt nøytrofile granulocytt telle i lunge vev. (C) uttrykk for MMP-9 i lunge vev (fold endring av uttrykk for humbug operert dyr). (D) FACS analyse av absolutt nøytrofile granulocytt i lunges væske. (E) albumin innhold i Bal Fluid [MEAN ± SD, n = 7, mann-Whitney U test, * p < 0,05 (vs PBS kontroll)]. Dette tallet har blitt modifisert fra Ehrentraut et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn på materiale/utstyr | Volum (mL) |
| Dulbecco ' s fosfat bufret Saline (PBS), uten kalsiumklorid og magnesium klorid, sterile | 1000 for alle |
| Fosterets kalv serum (FCS) | 1 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) løsning | 1 |
| Natrium Natriumazid (NaN3) | 0,1 for alle |
Tabell 1: sammensetning av FACS-buffer.
| Navn på materiale/utstyr | Anbefalt fortynning | Mastermix for 10 prøver: Legg til 200 μL FACS buffer (= 20 μL per prøve): |
| Anti-CD115 (c-FMS) APC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD11b (M1/70)-FITC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD45 (30-F11)-eF450 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-F4/80 (BM-8)-PE-Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6C (HK 1.4) PerCP-CY 5.5 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
Tabell 2: utarbeidelse av Master mix for FACS farging. Tabellen beskriver Master Mix forberedelse for 10 prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimal invasiveness, enkel håndtering, og god reproduserbarhet er viktige funksjoner i den presenterte tilnærmingen for å indusere ALI i en liten gnager modell. Bruk av LPS i stedet for hele bakterier i dyremodeller har fordeler. Det er en stabil og ren sammensatte og kan lagres i lyofilisert form til bruk. Det er en potent stimulerende for medfødte immunresponser via TLR4 veien, og dens biologiske aktivitet kan lett bli kvantifisert, tilrettelegge for titrering av sykdom alvorlighetsgrad med god reproduserbarhet. Videre har bruk av LPS vist å fungere som en sikker modell for å indusere akutt bronkitt hos menneskelige friske frivillige og dermed tillater oversettelse fra benk til seng16. Rittirsch et al. har demonstrert dose-og tidsavhengig utvikling av den karakteristiske alveolo-kapillær lekkasje i en murine modell av intratrakeal LPS drypping6. Dette gjør det mulig for dosetitrering å oppnå visse ønskede effekter, som kan illustrere ulike grader av ALI alvorlighetsgrad eller tidlig kontra sen utbruddet av sykdomssymptomer. Men hvis distinkte infectiological eller farmakologiske problemer skal håndteres (f. eks antibiotika behandling), ALI indusert av sterile LPS drypping er ikke en passende modell.
Videre, sammenlignet med intrapulmonary eller intravenøs levering av bakterier, ble forstyrrelsen av alveolo-kapillær barrieren beskrevet som ganske mild3, avhør egnetheten av denne modellen og om endret permeabilitet bør være spesielt undersøkt. Riktig plassering av kateteret for å levere LPS-bilateralt i den nedre luftveiene er det kritiske trinnet i tilnærmingen. For å sikre riktig intratrakeal intubering, visualisering og identifisering av strupen er tilrettelagt av en ekstern kaldt lys kilde. Endringer i luftveis mønster (f.eks. hoste eller gisper) bekrefter korrekt intratrakeal drypping av væsken.
Videre er valget av musen belastning og LPS avgjørende for induksjon av ALI og generering av reproduserbar resultater i denne modellen, og avhenger av det vitenskapelige problemet adressert. Ifølge litteraturen, dosering administreres for å lokke fram en maksimal effekt uten ytterligere økning med økende doser varierer fra 10 μg/mus (når LPS fra Pseudomonas aeruginosa F-D type 1 injiseres i kvinnelige BALB/c mus) til 50 μg/mus når sprøytebruk E. coli (serotype O111: B4) LPS (som også ble brukt i protokollen) til mannlig C57BL/6 mus6,9. Generelt skal BALB/c-mus reagere følsomt når de blir utfordret med LPS, mens C57BL/6 mus synes å være mer motstandsdyktig3. Dermed anbefales det at eksperimenter med innledende dosetitrering respekterer individuelle forhold. Dette gjelder også for tidspunktet for blod, BAL, og orgel prøvetaking. Alvorlighetsgraden av ALI kan fastslås klinisk ved regelmessig observasjon av kroppstemperatur og pustebesvær symptomer. Videre, siden mus bare dele ca 50% homologi av TLR4 reseptoren med mennesker, er forsiktig tolkning av resultatene obligatorisk3.
Alternativer til heri presentert tilnærming utgjør ruten for endotoksin administrasjon til lungene. Som beskrevet av Szarka et al., kan LPS også administreres via intranasal drypping9. Liu et al. sammenlignet direkte intratrakeal deponering med inhalasjon av aerosolized LPS5. Basert på funnene, konkluderte de med at den inhalativ ruten induserer en mer ensartet type ALI. Men deres eksperimenter ble utført i rotter med en rettet-Flow nese-bare innånding og kan derfor ikke nødvendigvis overføres til heri presentert tilnærming. I kontrast, mus er ofte utsatt for aerosolized LPS i et kammer10. Kammer størrelse, LPS konsentrasjon, og antall mus behandlet samtidig er variabler som begrenser sammenlignbarhet mellom ulike studier og gjøre en individuell modell etablering anbefales. Sist, intravenøs eller intraperitoneal administrering av LPS er ofte brukt til å indusere ekstern Ali17,18. Som data fra Szarka et al. foreslå, synes intratrakeal drypping å være overlegen til IV eller IP rute når bestemte lunge inflammatoriske effekter blir adressert9. Avslutningsvis representerer protokollen en enkel og reproduserbar tilnærming for å indusere sterile ALI i mus for å løse spesifikke immunologiske problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Jan Kleiner og Susanne Schulz for å gi teknisk støtte. Forfatterne erkjenner utmerket støtte av flyten flowcytometri kjernen anlegget ved medisinsk fakultet Bonn University. Forfatterne fikk ingen støtte fra noen ekstern organisasjon. Deler av dataene i resultat seksjonen og avbildet i Figur 3 er allerede vist i en tidligere publikasjon8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
