Summary
Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap procedure om acute longschade in muizen induceren door directe intratracheal lipopolysaccharide instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage vloeistof, en longweefsel. Minimale invasieve, eenvoudige handling, goede reproduceerbaarheid, en titratie van de ziekte ernst zijn voordelen van deze aanpak.
Abstract
Luchtweg toediening van lipopolysaccharide (LPS) is een veel voorkomende manier om longontsteking en acute longschade (ALI) studie in kleine diermodellen. Verschillende benaderingen zijn beschreven, zoals de inhalatie van vernevelde LP'S en nasale of intratracheal instillatie. Het gepresenteerde protocol beschrijft een gedetailleerde stap-voor-stap procedure om ALI te induceren in muizen door directe intratracheal LPS instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof, en longweefsel. Na intraperitoneale sedatie, is de luchtpijp blootgesteld en LPS wordt toegediend via een 22 G veneuze katheter. Een robuuste en reproduceerbare inflammatoire reactie met leukocyten invasie, upregulering van proinflammatoire cytokines, en verstoring van de alveolo-capillaire barrière wordt geïnduceerd binnen enkele uren tot dagen, afhankelijk van de gebruikte LPS dosering. De inzameling van bloedsteekproeven, BAL vloeistof, en Long het oogsten, evenals de verwerking voor FACS analyse, worden beschreven in detail in het protocol. Hoewel het gebruik van de steriele LPS niet geschikt is om farmacologische interventies bij besmettelijke ziekten te bestuderen, biedt de beschreven aanpak minimale invasieve, eenvoudige handling en goede reproduceerbaarheid om mechanistische immunologische vragen te beantwoorden. Bovendien, dosis titratie, alsmede het gebruik van alternatieve LP'S preparaten of muis stammen kunnen modulatie van de klinische effecten, die kunnen vertonen verschillende graden van ALI ernst of vroege versus late begin van de ziektesymptomen.
Introduction
Experimentele diermodellen zijn onmisbaar in fundamenteel immuun onderzoek. Toediening van hele bacteriën of microbiële componenten is vaak gebruikt in kleine diermodellen om lokale of systemische ontsteking te induceren1. Lipopolysaccharide (LPS, of bacteriële endotoxine) is een component van de celwand en het Oppervlakteantigeen van gram-negatieve bacteriën (b.v., Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., of Legionella spp.). De thermostable en grote molecule (molecuulgewicht 1-4 x 106 kDa) bestaat uit een lipide moiety (lipide a), kerngebied (oligosaccharide), en een o-polysaccharide (of o-antigeen). Lipide A, met zijn hydrofobe vetzuurketens, verankert het molecuul in een bacterieel membraan en bemiddelt (bij afbraak van bacteriën) de immunologische activiteit en de toxiciteit van LPS. Na binding aan de LPS bindende eiwitten (LBP), LPS: LBP complexen binden de CD14/TLR4/MD2 receptor complex gelegen op het oppervlak van vele soorten cellen, het induceren van een sterke proinflammatoire reactie met NF-κB nucleaire translocatie en latere upregulering van cytokine uitdrukking2.
Acute longschade (ALI) wordt gedefinieerd als acute hypoxemic respiratoir falen met bilaterale longoedeem in de afwezigheid van hartfalen3. Luchtweg toediening van LPS is een veel voorkomende manier om longontsteking en Ali4,5,6,7te induceren. Hoewel de steriele stof niet geschikt is om farmacologische interventies bij besmettelijke ziekten te bestuderen, kunnen mechanistische immunologische vragen met voldoende nauwkeurigheid worden beantwoord. Instillatie van LPS in de luchtpijp induceert een robuuste inflammatoire reactie met leukocyten invasie, upregulering van proinflammatoire cytokines, en verstoring van de alveolo-capillaire barrière binnen enkele uren tot dagen, afhankelijk van de LPS dosering3, 6,7.
Het gepresenteerde protocol beschrijft een gedetailleerde stap-voor-stap procedure om ALI te induceren in muizen door intratracheal LPS instillatie. Het model is gevalideerd door de beoordeling van cytokine-expressie, Neutrofiele granulocyt invasie, en intra-alveolaire albumine lekkage zoals eerder beschreven8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit dierlijke protocol werd goedgekeurd door de lokale Commissie voor dierlijke zorg (LANUV, Recklinghausen, Duitsland; Protocol nr. 84-02.04.2015) en werd uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van de richtlijnen van de gezondheid voor het gebruik van levende dieren (de publicatie van NIH Nr. 85-23, herziene versie van 1996).
1. ALI inductie
- Gebruik volwassen C57BL/6 muizen op leeftijden van ongeveer 10-12 weken. Huis de dieren in individueel geventileerde kooien met gratis toegang tot water en standaard knaagdier Chow. Het is echter mogelijk om deze aanpak op jongere dieren en met andere muizenstammen uit te voeren.
- Opslag LPS (Escherichia coli O111: B4) in fracties in concentraties van 5 mg/mL bij-20 °C. Voor intratracheal aanbrenging, verdunnen LPS in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 2.000 µ g/mL.
- Weeg de muis. Injecteren ketamine [120 mg/kg muis lichaamsgewicht (BW)] en xylazine (16 mg/kg BW) ze intraperitoneaal (onderste een derde van de buik, paramediane), en wacht tot het begin van de anesthesie.
- Controleer de diepte van de anesthesie door het induceren van een tactiele stimulus. In geval van onvoldoende anesthesie, herhaal de injectie met ketamine (30 mg/kg BW) en xylazine (4 mg/kg BW).
- Plaats de muis in een gevoelige positie op een temperatuur-gecontroleerde tafel om een lichaamstemperatuur van 37 ° c te behouden.
- Breng steriele oogheelkundige smeermiddel om uitdroging van hoornvlies te voorkomen onder narcose.
- Til het hoofd en de haak snijtanden op een horizontale balk geplaatst ongeveer 5 cm boven de tafel, terwijl de forepaws blijven in nauw contact met de tafel. Super-Verleng de nek in een hoek van 90 ° ten opzichte van de tafel (Figuur 1). Houd de tong met een tang om de keel rechtzetten voor gemakkelijker intubatie voorwaarden.
- Snijd een 22 gauge (G) veneuze katheter tot een lengte van 20 mm. plaats de katheter voorzichtig in de verticale richting langs de wortel van de tong. Plaats een koude-lichtbron op de huid boven het strottenhoofd te helpen visualiseren van de vocale akkoorden en streven naar de luchtpijp. Als de weerstand van het strottenhoofd optreedt, trekt u de katheter een paar millimeter voor de oprukkende weer.
- Plaats de katheter ongeveer 10 mm in de luchtpijp. Zorg ervoor dat de insertie niet te diep is, omdat dit zal resulteren in unilaterale instillatie van vloeistof in de rechter of linker belangrijkste bronchus.
- Injecteren LPS (5 µ g/g BW) verdund in PBS met behulp van een pipet [geïnjecteerd volume is afhankelijk van de muis lichaamsgewicht (bijv. 20 g lichaamsgewicht → gebruik 50 µ L van LPS oplossing)].
Opmerking: de muis zal meestal reageren met hoesten of hijgend naar een goede instillatie van vocht in de luchtpijp. - Sluit een spuit en voeg een bolus van 50 mL lucht om ervoor te zorgen dat volledige vloeibare volume wordt verdeeld in de longen. Verwijder de katheter langzaam.
- Houd de muis bovenlichaam in een rechtopstaande positie voor 30 s om lekkage van de vloeistof uit de luchtpijp te voorkomen.
- In Sham-Operated dieren, Injecteer 50 µ L van steriele PBS intratracheally in plaats van LPS.
- Injecteren buprenorfine hydrochloride 0,08 mg/kg BW onderhuids in de losse huid over de nek onmiddellijk na ALI inductie en elke 12 h daarna, tijdens de eerste 48 h.
- Handhaaf een lichaamstemperatuur van 37 °C tot het volledige bewustzijn wordt herwonnen door de muis op het verwarmende stootkussen te houden.
- Breng de muis over in een individueel geventileerde kooi met gratis toegang tot voedsel en water. Controleer de muis regelmatig. Afnemende lichaamstemperatuur en respiratoire depressie geeft een goede inductie van ALI.
2. bloedbemonstering, bronchoalveolaire lavage, orgaan oogsten
Opmerking: timing van euthanization hangt af van de wetenschappelijke kwestie aangepakt. Meestal wordt het uitgevoerd 12-72 h na LPS instillatie3,4,9,10. De strengheid van ALI kan klinisch door regelmatige observatie van lichaamstemperatuur en ademhalingsklachten11worden bepaald.
- Induceren anesthesie door het plaatsen van de muis in een kamer overstroomd met Isofluraan. Gebruik 3 vol% Isofluraan met een zuurstof stroom van 1 L/min. zorg voor diepe narcose door het induceren van een tactiele stimulus. In geval van onvoldoende diepte van de anesthesie, verhogen Isofluraan tot 5 vol%.
- Offer de muis in diepe anesthesie door Atlantisch-achterhoofd dislocatie.
- Bevestig de muis met tape op een operatietafel en binnenkort ontsmet de vacht over de buik met 70% ethanol. Open de buikholte zorgvuldig in de mediaanlijn met een schaar en een pincet. Verwijder delen van de darm om toegang te krijgen tot de vena cava inferior (IVC) recht op de wervelkolom en de abdominale aorta.
- Zoek de nier aderen en plaats een gebogen 23 G canula aangesloten op een 1 mL spuit in het IVC direct onder de samenvloeiing van de aderen. Aspireren 250 µ L van bloed en de overdracht in een 1,5 mL buis gevuld met 20 µ L van 0,5 M ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) oplossing. Schud zachtjes te vergemakkelijken EDTA mengen en zet de buis op ijs.
- Voor bronchoalveolaire lavage (BAL), bereid drie 1 mL spuiten met 0,5 mL steriel PBS en 0,1 mL lucht elk. Desinfecteer binnenkort de vacht van de keel met 70% ethanol en voorzichtig bloot de luchtpijp met een schaar en een pincet. Mobiliseren van de luchtpijp en wikkel rond een hechtdraad.
- Voer BAL: punctie de luchtpijp met behulp van micro-schaar en plaats een 22 G veneuze katheter gesneden tot een lengte van 20 mm. Bevestig de katheter met de hechtdraad en instillate 0,5 mL steriel PBS en 0,1 mL lucht. Aspireren de vloeistof na 60 s. Herhaal de procedure met de extra twee spuiten en het verzamelen van de hele aspireren in een 15 mL buis op ijs.
- Open zorgvuldig de thorax met een schaar en een pincet om de longen te oogsten. Snijd het middenrif langs de kostbare marge en snijd door de ribben met twee laterale incisies. Vermijd voorzichtig prikken de longen. Til het borstbeen craniale en vast te stellen of te verwijderen.
- Bereid 2 10 mL spuiten met 37 °C warme PBS (zonder calcium en magnesium). Maak een kleine incisie in de linker ventrikel. Punctie de rechter ventrikel met een 26 G canula en spoel de pulmonale circulatie met de voorverwarmde PBS. Wees je bewust van de longen draaien bleke tijdens de procedure.
- Verwijder de rechter kwab van de longen en snijd het in twee helften. Snap-Freeze ze in vloeibare stikstof, gevolgd door lange-termijn opslag bij-80 °C voor verdere genexpressie en eiwitanalyse.
- Verwijder de hele linker long en meng het in een 48 goed plaat doorgehakt het weefsel met schaar en pincet. Incubeer het weefsel in 2 mL van de spijsvertering buffer [RPMI 1640 met 10% foetale kalf serum (FCS) en 0,1% NaN3, Collagenase I (1 mg/ml), en DNase II (7 mg/ml)] bij 37 °c voor 60 min. Voer verdere homogenisering uit door zorgvuldig de stukken van het longweefsel omhoog te pipetten en neer.
3. weefsel voorbereiding voor FACS analyse
- Bereid verse FACS buffer (tabel 1): gebruik altijd calcium-en magnesium vrije PBS om kation-afhankelijke cel-naar-cel adhesie te verminderen en te voorkomen dat klonteren. Supplement met FCS (1%) om cellen te beschermen tegen apoptosis, voorkomen dat niet-specifieke kleuring, en voorkomen dat cellen vasthouden aan de FACS buizen. Omvatten EDTA (0,5 mM) om kation-gebaseerde cel-naar-cel adhesie te voorkomen bij het werken met kleverige en aanhangende cellen zoals macrofagen. Voeg natrium azide (0,1%), omdat het voorkomt bacteriële besmetting en het fotobleken van fluorochromes en blokkeert antilichaam vergieten.
- Breng de bloedmonsters (stap 2,4) over in 5 mL FACS buizen en meng het bloed voorzichtig met 2 mL rode bloedcel lysis buffer. Zet de buizen op ijs en eindig de reactie na 2 min door toevoeging van 2 mL ijskoude PBS. Centrifugeer de monsters voor 5 min bij 400 x g en gooi de bovendrijvende. Hersuspendeer de cel pellet met 60 µ L van FACS buffer en proces voor de daaropvolgende FACS kleuring volgens eerder beschreven protocollen12.
Opmerking: timing van de euthanization van de muis invloeden leukocyten tellen als onderdeel van de systemische ontsteking. Daarom is het raadzaam om de cel nummer aan te passen aan 1 x 106 cellen/60 µ l in deze stap om de beste kleuring resultaten voor flow Cytometry analyse te bereiken. - Centrifugeer BAL vloeistof (stap 2,6) voor 5 min bij 400 x g. Aspireren de bovendrijvende en bevriezen in vloeibare stikstof, gevolgd door opslag op lange termijn bij-80 °C voor verdere eiwitanalyse. Opnieuw op te schorten BAL Cell pellet met 2 mL koude FACS buffer, breng de schorsing in een 5 mL FACS buis met behulp van een 100 µm mesh filter om haren te beperken.
- Nogmaals, Centrifugeer het monster voor 5 min bij 400 x g. Hersuspendeer de pellet met 60 µ L van FACS buffer en proces voor de daaropvolgende FACS kleuring volgens eerder beschreven protocollen12.
Opmerking: timing van de euthanization van de muis invloeden leukocyten tellen in BAL als onderdeel van de ontsteking. Daarom is het raadzaam om de cel nummer aan te passen aan 1 x 106 cellen/60 µ l in deze stap om de beste kleuring resultaten voor flow Cytometry analyse te bereiken. - Breng de verteerde linker longweefsel (stap 2,10) in een 5 mL FACS buis met behulp van een 100 µ L mesh filter om klontjes extract en het spijsverteringsproces te beëindigen door toevoeging van 2 mL ijskoude FACS buffer. Centrifugeer het monster voor 5 min bij 400 x g. Gooi de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet met 60 µ L van FACS buffer en het proces voor de daaropvolgende FACS kleuring volgens eerder beschreven protocollen12.
Nota: de timing van euthanization van de muis beïnvloedt leukocyten telling in longweefsel als deel van de ontsteking. Daarom is het raadzaam om de cel aantal aan te passen aan 1 x 106 cellen/60 µ l om de beste kleuring resultaten voor flow Cytometry analyse te bereiken. - Voor FACS analyse, incubeer cellen met CD16/CD32 antilichaam bij 4 °C voor 15 min te blokkeren niet-specifieke binding van immunoglobuline aan de FC-receptoren. Voeg 20 µ L van het blokkeren van oplossing aan 1 x 106 cellen in 60 µ l in een 5 ml buis toe.
- Ondertussen, bereid een Master mix met FACS buffer en antilichamen zoals beschreven in tabel 2.
- Na het blokkeren, niet wassen van de cellen. Voeg 20 µ L van antilichamen Master Mix per monster toe om een definitief volume van 100 µ L. Incubeer de monsters voor 20 min in het donker bij 4 ° c te verkrijgen.
- Was elk monster met 1 mL FACS buffer en Centrifugeer gedurende 5 min bij 400 x g. Gooi de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet met FACS buffer naar de juiste cel concentratie voor FACS metingen.
Nota: een cel aantal van 1 x 106 cellen/500 µ l wordt voorgesteld om de beste immune fenotyping resultaten in FACS analyse met dit protocol te bereiken. Het is echter aanbevolen dat antilichamen moeten individueel worden getitratied. - Indien nodig, voeg Live/Dead vlekken voorafgaand aan het oppervlak vlekken met behulp van specifieke commercieel beschikbare kits8.
- Tot slot, voeg vaste nummers van commercieel beschikbare fluorochrome-gekoppelde kalibratie kralen (3 x 105 kralen in 20 µ l van FACS buffer) aan elk monster om absolute cel nummers te bepalen12. De gating-strategie voor bloed-, BAL-en weefselcellen wordt weergegeven in Figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven aanpak voor het induceren van ALI in muizen werd gevalideerd door de beoordeling van cytokine-expressie, Neutrofiele granulocyt infiltratie, en alveolo-capillaire barrière verstoring 24 h en 72 h na LPS instillatie. PBS-geïnjecteerde dieren diende als controle. Intratracheal LPS toediening geïnduceerde een robuuste Long proinflammatoire respons. De uitdrukking van TNF-α in longweefsel was beduidend upgereguleerd, het bereiken van een aanhoudende en meer dan 50-voudige toename ten opzichte van de controledieren [OV (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD = 20,6); p < 0,05)] (Figuur 3a). Leukocyten invasie in weefsel en alveolaire ruimte is een kenmerk en kenmerkend voor de ontwikkeling van ALI13. FACS analyse bleek een significante infiltratie van neutrofiele granulocyten (NG) in de Long interstitium, met absolute cel tellen met bijna 9-voudige toegenomen ten opzichte van de controles na 24 h [65.243 (SD = 15.855) vs. 7.358 (SD = 4.794), p < 0,05] ( Figuur 3B). Absolute NG Count licht gedaald na 72 h; echter, de factor stijgt ten opzichte van de controles bleef stabiel [48.946 (SD = 5.223) vs. 5.510 (SD = 654), p < 0,05]. Consistent met infiltratie van interstitiële NG, MMP-9 de uitdrukking in geheel longweefsel werd eveneens beduidend verhoogd over de totale observatieperiode [OV (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (BR = 1,5); 72 h: 10,4 (BR = 2,0); p < 0,05] (Figuur 3C).
NG werden niet alleen verhoogd in het longweefsel, maar ook in de BAL vloeistof. De vouw verhoging in vergelijking met controledieren was meer uitgesproken dan in longweefsel, met absolute NG telt 24 h na ALI inductie van 52.005 (BR = 21.906) versus 1.829 (BR = 1.724) (p < 0,05) (Figuur 3D). Na 72 h, werden NG verhoogd tot 37.254 (SD = 4.478) vs. 17,0 (SD = 10,8) (p < 0,05). Longoedeem als gevolg van ernstige stoornissen van de alveolo-capillaire barrière is Pathognomonisch voor de ontwikkeling van Ali, met LPS snel inducerende endothelial apoptosis en verhoogde permeabiliteit14,15. De analyse van albumine inhoud in BAL vloeistof door ELISA openbaarde een significant verlies van barrièrefunctie. 24 h na de LPS-instillatie was albumine in BAL Fluid 43 ng/mL (SD = 13), vergeleken met 20 ng/mL (SD = 9) onder controle omstandigheden (p < 0,05) (Figuur 3E). Na 72 h, in ALI dieren, was het albumine gehalte 48 ng/mL (BR = 14), vergeleken bij 29 ng/mL (BR = 9) (p < 0,05).
Figuur 1 : Schematisch diagram van de intubatie instelling. Opgemerkt moet worden dat de muis de nek moet worden super-uitgebreid met een 90 ° hoek ten opzichte van de operatietafel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : FACS gating strategie voor bloed, bal, en weefselcellen. De voorbeeldige vlekken van de punt van FACS analyse worden getoond in twee-parameter (dubbele kleuren fluorescentie) PSEUDOCOLOR percelen. De strategie van gating voor de respectieve steekproeven is gebaseerd op enige cellen. (A) gating boom voor bloedcellen: a = dode cellen; b = levende cellen (volgens levende/dode cel kleuring; geen CD45 kleuring noodzakelijk zoals in het bloed, maakt de hoge autofluorescentie de cel bevolking duidelijk te onderscheiden); d = neutrofiele granulocyten; e = monocyten (volgens GR1 en CD115 kleuring). (B) gating boom voor bronchoalveolaire LAVAGE (bal) vloeistof: a = dode cellen; b = levende cellen (volgens levende/dode cel kleuring); c = CD45+ immuun cellen; d = neutrofiele granulocyten; en e = macrofagen (volgens Ly6G en F4/80 kleuring). Cgating boom voor longweefsel: a = dode cellen; b = levende cellen (volgens levende/dode cel kleuring); c = CD45+ immuun cellen; d = neutrofiele granulocyten; en e = macrofagen (volgens Ly6G en F4/80 kleuring). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Validatie van muizen Ali model tegen controledieren. (A) uitdrukking van TNF-α in longweefsel van vrouwelijke C57BL/6 muizen 24 h en 72 h na intratracheal LPS instillatie (vouwen verandering van uitdrukking van schijn in werking gestelde dieren). BFACS analyse van absolute Neutrofiele granulocyt telling in longweefsel. (C) uitdrukking van MMP-9 in longweefsel (vouw verandering van uitdrukking van Sham geëxploiteerde dieren). (D) FACS analyse van absolute Neutrofiele granulocyt tellen in bronchoalveolaire lavage vloeistof. (E) albumine gehalte in bal vloeistof [mean ± SD, n = 7, Mann-Whitney U test, * p < 0,05 (VS. PBS controle)]. Dit cijfer is gewijzigd van Ehrentraut et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam van materiaal/uitrusting | Volume (mL) |
| Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), zonder calciumchloride en magnesiumchloride, steriel | 1000 |
| Foetale kalf serum (FCS) | 1 |
| Ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) oplossing | 1 |
| Natrium azide (NaN3) | 0,1 |
Tabel 1: samenstelling van FACS buffer.
| Naam van materiaal/uitrusting | Voorgestelde verdunning | Mastermix voor 10 monsters: Voeg toe aan 200 µ l FACS buffer (= 20 µ l per sample): |
| Anti-CD115 (c-FMS) APC | 0,5 µ L/100 µ L | 5 µ L |
| Anti-CD11b (M1/70)-FITC | 0,5 µ L/100 µ L | 5 µ L |
| Anti-CD45 (30-F11)-eF450 | 0,5 µ L/100 µ L | 5 µ L |
| Anti-F4/80 (BM-8)-PE Cy7 | 0,5 µ L/100 µ L | 5 µ L |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | 0,5 µ L/100 µ L | 5 µ L |
| Anti-Ly6C (HK 1.4) PerCP-CY 5.5 | 0,5 µ L/100 µ L | 5 µ L |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 µ L/100 µ L | 5 µ L |
Tabel 2: voorbereiding van Master mix voor FACS kleuring. De tabel beschrijft Master Mix voorbereiding voor 10 monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimale invasieve, eenvoudige behandeling, en een goede reproduceerbaarheid zijn de belangrijkste kenmerken van de gepresenteerde aanpak om ALI te induceren in een klein knaagdier model. Het gebruik van LPS in plaats van hele bacteriën in diermodellen heeft voordelen. Het is een stabiele en zuivere verbinding en kan in gelyofiliseerde vorm tot gebruik worden opgeslagen. Het is een krachtige stimulans voor aangeboren immuunsysteem reacties via de TLR4 pathway, en de biologische activiteit kan gemakkelijk worden gekwantificeerd, het vergemakkelijken van de titratie van de ziekte ernst met een goede reproduceerbaarheid. Voorts is het gebruik van LPS getoond om als veilig model te dienen om scherpe bronchitis in menselijke gezonde vrijwilligers te veroorzaken en laat zo vertaling van Bank aan bed16toe. Rittirsch et al. hebben aangetoond de dosis-en tijd-afhankelijke ontwikkelingen van de karakteristieke alveolo-capillaire lekkage in een muizenmodel van intratracheal LPS instillatie6. Dit staat dosis titratie toe om bepaalde gewenste gevolgen te bereiken, die verschillende graden van ALI strengheid of vroeg versus laat begin van ziektesymptomen kunnen illustreren. Echter, als er verschillende infectiologische of farmacologische kwesties moeten worden aangepakt (bijv. antibiotische therapie), ALI geïnduceerd door steriele LPS instillatie is niet een geschikt model.
Bovendien, in vergelijking met intrapulmonary of intraveneuze levering van bacteriën, werd de verstoring van de alveolo-capillaire barrière beschreven zoals zijnd vrij milde3, vragend de geschiktheid van dit model en of de veranderde doordringbaarheid zou moeten zijn in het bijzonder onderzocht. Juiste plaatsing van de katheter om de LPS bilateraal te leveren in de onderste luchtwegen is de kritieke stap van de aanpak. Om te zorgen voor een goede intratracheal intubatie, visualisatie en identificatie van het strottenhoofd wordt vergemakkelijkt door een externe koude lichtbron. Veranderingen in het ademhalingspatroon (bijv. hoesten of hijgen) controleren of de juiste intratracheal instillatie van de vloeistof.
Bovendien, de keuze van de muis stam en LP'S zijn van cruciaal belang voor de inductie van ALI en de productie van reproduceerbare resultaten in dit model en afhankelijk van de wetenschappelijke kwestie aangepakt. Volgens de literatuur, de dosering toegediend aan een maximaal effect te wekken met geen verdere toename met escalerende dosering varieert van 10 µ g/muis (wanneer LPS van Pseudomonas aeruginosa F-D type 1 wordt geïnjecteerd in vrouwelijke Balb/c muizen) tot 50 µ g/Mouse wanneer injecteren E. coli (serotype O111: B4) LPS (die ook werd gebruikt in het Protocol) in mannelijke C57BL/6 muizen6,9. In het algemeen, BALB/c muizen worden verondersteld om gevoelig te reageren wanneer uitgedaagd met LPS, terwijl C57BL/6 muizen lijken meer resistent3. Zo worden initiële dosis titratie experimenten met inachtneming van individuele voorwaarden aanbevolen. Dit geldt ook voor de timing van bloed, BAL, en orgel bemonstering. De strengheid van ALI kan klinisch door regelmatige observatie van lichaamstemperatuur en ademhalingsklachten symptomen worden bepaald. Voorts aangezien de muizen slechts ongeveer 50% homologie van de TLR4 receptor met mensen delen, is de zorgvuldige interpretatie van de resultaten verplicht3.
Alternatieven voor de hierin gepresenteerde aanpak omvatten de route van endotoxine toediening aan de longen. Zoals beschreven door Natali et al., kan LPS ook worden toegediend via intranasal instillatie9. Liu et al. vergeleek de directe intratracheal depositie met de inhalatie van vernevelde LPS5. Op basis van hun bevindingen concludeerden zij dat de inhalatie route een uniformere vorm van ALI veroorzaakt. Echter, hun experimenten werden uitgevoerd bij ratten met een gerichte-flow neus-only inhalatie en kan daarom niet noodzakelijkerwijs worden overgedragen aan de hierin gepresenteerde aanpak. In tegenstelling, muizen zijn vaak blootgesteld aan aërosolen LPS in een kamer10. Kamergrootte, LPS concentratie, en het aantal gelijktijdig behandelde muizen zijn variabelen die de vergelijkbaarheid tussen verschillende studies beperken en een individuele model instelling aan te bevelen. Het laatste, intraveneuze of intraperitoneale beleid van LPS wordt vaak gebruikt om verre Ali17,18te veroorzaken. Als de gegevens van Natali et al. suggereren, de intratracheal instillatie lijkt superieur te zijn aan de i.v. of i.p. route wanneer specifieke pulmonale inflammatoire effecten worden aangepakt9. Tot slot, het protocol is een eenvoudige en reproduceerbare benadering van het induceren steriele ALI in muizen om specifieke immunologische kwesties aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Jan kleiner en Susanne Schulz bedanken voor het verlenen van technische ondersteuning. De auteurs erkennen de uitstekende ondersteuning van de flow Cytometry core Facility aan de medische faculteit van de Universiteit van Bonn. De auteurs kregen geen financiering van een externe organisatie. Een deel van de gegevens in de resultaten sectie en afgebeeld in Figuur 3 is reeds getoond in een vorige publicatie8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
