Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إحداث إصابات الرئة الحادة في الفئران عن طريق التبيل المباشر للكيس الشحمي داخل الرغامى

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59999
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

يقدم هنا إجراء خطوة بخطوة للحث على إصابة الرئة الحادة في الفئران عن طريق مباشرة داخل الرغامى السكاريد ولإجراء تحليل FACS عينات الدم، والسائل القصبات الهوائية، وأنسجة الرئة. الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقابلية للتكرار الجيد، ومعايرة شدة المرض هي مزايا هذا النهج.

Abstract

إدارة مجرى الهواء من السكاريد (LPS) هو وسيلة شائعة لدراسة التهاب رئوي وإصابة الرئة الحادة (ALI) في النماذج الحيوانية الصغيرة. وقد وصفت نُهج مختلفة، مثل استنشاق الهباء الجوي وغرس الأنف أو داخل الرغامى. يصف البروتوكول المقدم إجراءً مفصلاً خطوة بخطوة لحث ALI في الفئران عن طريق تهيئة LPS داخل الرغامى مباشرة وإجراء تحليل FACS لعينات الدم، وسوائل غسل القصبات (BAL)، وأنسجة الرئة. بعد التخدير داخل الحَرَب، يتم تعريض القصبة الهوائية وتدار الـ LPS بواسطة قسطرة وريديّة 22 G. يتم التسبب في رد فعل التهابي قوي وقابل للتكرار مع غزو الكريات البيض ، وupregulation من السيتوكينات proinflammatory ، وتعطيل حاجز الحويفين الشعري في غضون ساعات إلى أيام ، اعتمادا على جرعة LPS المستخدمة. يتم وصف جمع عينات الدم، والسائل BAL، وحصاد الرئة، فضلا عن معالجة لتحليل FACS، بالتفصيل في البروتوكول. على الرغم من أن استخدام LPS المعقمة ليست مناسبة لدراسة التدخلات الدوائية في الأمراض المعدية، فإن النهج الموصوف يقدم الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقدرة على استنساخ جيدة للرد على الأسئلة المناعية الميكانيكية. وعلاوة على ذلك، فإن المعايرة بالتحليل الكيميائي للجرعة، فضلا عن استخدام الاستعدادات البديلة لـ LPS أو سلالات الماوس تسمح بتحوير الآثار السريرية، والتي يمكن أن تظهر درجات مختلفة من شدة ALI أو في وقت مبكر مقابل بداية متأخرة من أعراض المرض.

Introduction

النماذج الحيوانية التجريبية لا غنى عنها في البحوث المناعية الأساسية. وقد استخدمت إدارة البكتيريا الكاملة أو المكونات الميكروبية في كثير من الأحيان في النماذج الحيوانية الصغيرة للحث على التهاب محلي أو نظامي1. Lipopolysaccharide (LPS، أو التوكسين البكتيري) هو مكون جدار الخلية ومستضد السطح من البكتيريا السالبة للجرام (على سبيل المثال، البكتيريا المعوية، الزائفة spp.، أو الفيلق spp.). يتكون الجزيء المستقرة بالحرارة والكبيرة (الوزن الجزيئي 1-4 × 106 kDa) من مويتي الدهون (الدهون A)، ومنطقة أساسية (oligosaccharide)، وO السكريات (أو مستضد). الدهون A، مع سلاسل الأحماض الدهنية المسعورة، يرسو الجزيء في غشاء بكتيري وتوسط (على تدهور البكتيريا) النشاط المناعي وسمية LPS. بعد الربط إلى البروتين ملزم LPS (LBP)، LPS: مجمع LBP ligate مجمع مستقبلات CD14/TLR4/MD2 تقع على سطح العديد من أنواع الخلايا، مما يؤدي إلى رد فعل proinflammatory قوي مع NF-κB نقل النووية وupregulation اللاحقة من السيتوكين التعبير2.

يتم تعريف إصابة الرئة الحادة (ALI) بأنها فشل الجهاز التنفسي الحاد مع وذمة رئوية ثنائية في غياب فشل القلب3. إدارة مجرى الهواء من LPS هو وسيلة شائعة للحث على التهاب رئوي وعلي4،5،6،7. على الرغم من أن المادة المعقمة ليست مناسبة لدراسة التدخلات الدوائية في الأمراض المعدية، يمكن الإجابة على الأسئلة المناعية الميكانيكية بدقة كافية. غرس LPS في القصبة الهوائية يحفز على رد فعل التهابي قوي مع غزو الكريات البيض، وupregulation من السيتوكينات proinflammatory، وتعطيل حاجز الحويفين الشعرية في غضون ساعات إلى أيام، اعتمادا على جرعة LPS3، 6,7.

يصف البروتوكول المقدم إجراءً مفصلاً خطوة بخطوة لحث ALI في الفئران عن طريق تبيل LPS داخل الرغامى. تم التحقق من صحة النموذج من خلال تقييم التعبير السيتوكين، غزو المحببة العدلية، وتسرب الألبومين داخل الحُقف كما سبق وصفه8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المحلية لرعاية الحيوانات على هذا البروتوكول (LANUV، ريكلينغهاوزن، ألمانيا؛ البروتوكول رقم 84-02.04.2015) وتم تنفيذه وفقاً للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لاستخدام الحيوانات الحية (نشرالمعاهد الوطنية للصحة) )١٠( رقم ٨٥-٢٣، المنقح ١٩٩٦.

1. علي التعريفي

  1. استخدام الكبار C57BL/6 الفئران في سن 10-12 أسابيع. تُقام الحيوانات في أقفاص ذات تهوية فردية مع إمكانية الوصول المجاني إلى المياه وحساء القوارض القياسي. ومع ذلك، فمن الممكن لأداء هذا النهج على الحيوانات الأصغر سنا ومع سلالات الفئران الأخرى.
  2. مخزن LPS (الإشريكية القولونية O111: B4) في الأليقوات في تركيزات 5 ملغ / مل في -20 درجة مئوية. وبالنسبة للغرس داخل الرغامى، تمييع الـ LPS في محلول ملحي معقم بفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي قدره 000 2 ميكروغرام/مل.
  3. وزن الماوس. حقن الكيتامين [120 ملغ/ كغ وزن الجسم بالفأر (BW)] وزيلازين (16 ملغ / كغ BW) داخل peritoneally (أقل ثلث البطن، paramedian)، والانتظار حتى بداية التخدير.
  4. تحقق من عمق التخدير عن طريق تحفيز اللمس. في حالة عدم كفاية التخدير، كرر الحقن مع الكيتامين (30 ملغ/كغ BW) وإكسيلازين (4 ملغم/كلغ BW).
  5. ضع الماوس في موضع عرضة على طاولة يتم التحكم في درجة حرارتها للحفاظ على درجة حرارة الجسم 37 درجة مئوية.
  6. تطبيق مواد التشحيم المعقمة في العين لمنع جفاف القرنية تحت التخدير.
  7. رفع القواطع الرأس والخطاف على شريط أفقي وضع ما يقرب من 5 سم فوق الجدول بينما لا تزال forepaws على اتصال وثيق مع الجدول. فائقة تمديد الرقبة في زاوية 90 درجة بالنسبة إلى الجدول (الشكل 1). عقد اللسان مع ملقط لتقويم الحلق لظروف التنبيب أسهل.
  8. قطع 22 قياس (G) القسطرة الوريدية إلى طول 20 ملم. ضع مصدر ًا للضوء البارد على الجلد فوق الحنجرة للمساعدة في تصور الحبال الصوتية واستهداف القصبة الهوائية. إذا حدثت مقاومة للحنجرة، قم بسحب القسطرة بضعة ملليمترات قبل التقدم مرة أخرى.
  9. أدخل القسطرة حوالي 10 مم في القصبة الهوائية. تأكد من أن الإدراج ليس عميقا ً جداً لأن ذلك سيؤدي إلى غرس السوائل من جانب واحد في القصبات الهوائية الرئيسية اليمنى أو اليسرى.
  10. حقن LPS (5 ميكروغرام / غرام BW) المخفف في PBS باستخدام ماصة [حجم حقن يعتمد على وزن جسم الماوس (على سبيل المثال، 20 غرام وزن الجسم → استخدام 50 μL من الحل LPS)].
    ملاحظة: عادة ما يستجيب الماوس مع السعال أو يلهث لغرس السائل السليم في القصبة الهوائية.
  11. توصيل حقنة وإضافة بولوس من 50 مل الهواء لضمان أن يتم توزيع حجم السائل الكامل في الرئتين. إزالة القسطرة ببطء.
  12. حافظ على الجزء العلوي من جسم الفأر في وضعية منتصبة لمدة 30 مرة لتجنب تسرب السائل من القصبة الهوائية.
  13. في الحيوانات التي تعمل بالصور، حقن 50 ميكرولتر من PBS المعقمة داخل الرغامى بدلا من LPS.
  14. حقن بوبرينورفين هيدروكلوريد 0.08 ملغ / كغ BW تحت الجلد في الجلد فضفاضة على الرقبة مباشرة بعد الحث علي وكل 12 ساعة بعد ذلك، خلال أول 48 ساعة.
  15. الحفاظ على درجة حرارة الجسم من 37 درجة مئوية حتى يتم استعادة الوعي الكامل عن طريق الحفاظ على الماوس على وسادة الاحترار.
  16. نقل الماوس في قفص التهوية بشكل فردي مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. مراقبة الماوس بانتظام. انخفاض درجة حرارة الجسم والاكتئاب التنفسي يشير إلى الحث السليم من ALI.

2. أخذ عينات الدم، وغسيل القصبات، وحصاد الأعضاء

ملاحظة: يتوقف توقيت الإقلال على المسألة العلمية التي تم تناولها. عادة، يتم تنفيذ هات 12-72 بعدLPS 3،4،9،10. يمكن تحديد شدة ALI سريريا من خلال المراقبة المنتظمة لأعراض درجة حرارة الجسم واضطرابات الجهاز التنفسي11.

  1. حث التخدير عن طريق وضع الماوس في غرفة غمرت مع isoflurane. استخدم 3 فول٪ isoflurane مع تدفق الأكسجين من 1 لتر / دقيقة. في حالة عدم كفاية عمق التخدير، زيادة الايسوفلوران تصل إلى 5 المجلد٪.
  2. التضحية بالفأر ة بتخدير عميق عن طريق خلع الألانكو القذالي.
  3. إصلاح الماوس مع الشريط على طاولة عملية وتطهير قريبا الفراء على البطن مع 70٪ الإيثانول. فتح تجويف البطن بعناية في خط الوسط مع مقص وملاقط. إزالة أجزاء من الأمعاء لتحقيق الوصول إلى الوريد الكافا السفلي (IVC) الحق في العمود الفقري والشريان الأبهر البطني.
  4. حدد يُمكن وضع الأوردة الكلوية وأدخل قنينة 23 غ ملتصقة بحقنة 1 مل في الوريد الأوني مباشرة تحت التقاء الأوردة. يستنشق 250 ميكرولتر من الدم وينقل إلى أنبوب 1.5 مل مملوء ة بمحلول 0.5 ميكرولتر من حمض الإيثيلين ثنائي الإيثيلين رباعي الأستيك (EDTA). هز بلطف لتسهيل خلط EDTA ووضع الأنبوب على الجليد.
  5. للمف القصبات (BAL)، إعداد ثلاث حقن 1 مل مع 0.5 مل من PBS معقمة و0.1 مل من الهواء لكل منهما. تطهير الفراء من الحلق قريبا مع 70٪ الإيثانول وفضح بعناية القصبة الهوائية مع مقص وملاقط. تعبئة القصبة الهوائية والتفاف حول خياطة.
  6. أداء BAL: ثقب القصبة الهوائية باستخدام مقص اتصغر وأدخل 22 G قطع قثطار وريدي إلى طول 20 مم. استنشق السائل بعد 60 s. كرر الإجراء مع الحقنتين إضافية وجمع كله يستنشق في أنبوب 15 مل على الجليد.
  7. فتح بعناية الصدر مع مقص وملاقط لحصاد الرئتين. قطع الحجاب الحاجز على طول هامش costal وقطع من خلال الأضلاع مع اثنين من الشقوق الجانبية. تجنب ثقب الرئتين بعناية. رفع القص قحفيا وإصلاح أو إزالته.
  8. إعداد اثنين 10 مل المحاقن مع 37 درجة مئوية دافئ PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم). قم بإجراء شق صغير في البطين الأيسر. ثقب البطين الأيمن مع 26 G كانولا ومسح الدورة الدموية الرئوية مع PBS prewarmed. كن على علم بأن الرئتين تُنهي الشاحب أثناء العملية.
  9. إزالة الفص الأيمن من الرئتين وقطع إلى نصفين. تجميد هاهم في النيتروجين السائل، تليها تخزين طويل الأجل في -80 درجة مئوية لمزيد من التعبير الجيني وتحليل البروتين.
  10. إزالة الرئة اليسرى كلها وتجانس في لوحة بئر 48 عن طريق mincing الأنسجة مع مقص وملقط. احتضان الأنسجة في 2 مل من العازلة الهضم [RPMI 1640 مع 10٪ مصل العجل الجنين(FCS) و 0.1٪ NaN 3، كولاجيناز الأول (1 ملغ / مل)، وDNase II (7 ملغ / مل)] في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. اسفل.

3. إعداد الأنسجة لتحليل FACS

  1. إعداد العازلة FACS الطازجة (الجدول1):دائما استخدام الكالسيوم والمغنيسيوم خالية PBS للحد من الالتصاق الكاتيون تعتمد على الخلية إلى الخلية ومنع التكتل. ملحق مع FCS (1٪ لحماية الخلايا من المبرمج، ومنع تلطيخ غير محددة، ومنع الخلايا من التمسك أنابيب FACS. قم بتضمين EDTA (0.5 mM) لمنع التصاق الخلايا إلى الخلية القائم على الcation عند العمل مع الخلايا اللزجة والتابعة مثل الضامة. إضافة azide الصوديوم (0.1٪)، كما أنه يمنع التلوث البكتيري وphotobleaching من الفلوروكروم وكتل سفك الأجسام المضادة.
  2. نقل عينات الدم (الخطوة 2.4) إلى 5 أنابيب FACS مل ومزج بلطف الدم مع 2 مل من العازلة خلايا الدم الحمراء. وضع الأنابيب على الجليد وإنهاء رد الفعل بعد 2 دقيقة عن طريق إضافة 2 مل من PBS الجليد الباردة. طرد مركزي عينات لمدة 5 دقيقة في 400 x ز وتجاهل supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية مع 60 μL من العازلة FACS وعملية لتلطيخ FACS اللاحقة وفقا للبروتوكولات وصفها سابقا12.
    ملاحظة: توقيت قتل الفئران يؤثر على عدد الكريات البيض كجزء من التهاب الجهازية. ولذلك، فمن المستحسن لضبط رقم الخلية إلى 1 X 106 الخلايا /60 ميكرولتر في هذه الخطوة لتحقيق أفضل نتائج تلطيخ لتحليل الخلايا تدفق.
  3. السائل BAL الطرد المركزي (الخطوة 2.6) لمدة 5 دقائق في 400 × ز. ازه الـ supernatant وتجمده في النيتروجين السائل، يليه تخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية لمزيد من تحليل البروتين. إعادة تعليق بال خلية بيليه مع 2 مل من العازلة FACS الباردة، ثم نقل التعليق إلى أنبوب FACS 5 مل باستخدام مرشح شبكة 100 ميكروم لكبح جماح الشعر.
  4. مرة أخرى، والطرد المركزي العينة لمدة 5 دقيقة في 400 × ز. إعادة تعليق بيليه مع 60 μL من العازلة FACS وعملية لتلطيخ FACS اللاحقة وفقا للبروتوكولات وصفها سابقا12.
    ملاحظة: توقيت قتل الفئران يؤثر على عدد الكريات البيض في البال كجزء من الالتهاب. ولذلك، فمن المستحسن لضبط رقم الخلية إلى 1 X 106 الخلايا /60 ميكرولتر في هذه الخطوة لتحقيق أفضل نتائج تلطيخ لتحليل الخلايا تدفق.
  5. نقل أنسجة الرئة اليسرى المهضمة (الخطوة 2.10) إلى أنبوب FACS سعة 5 مل باستخدام فلتر شبكي سعة 100 ميكرولتر لاستخراج الكتل وإنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة 2 مل من العازلة من نظام FACS البارد. جهاز طرد مركزي العينة لمدة 5 دقائق في 400 x ز. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 60 μL من العازلة FACS وعملية لتلطيخ FACS اللاحقة وفقا للبروتوكولات وصفها سابقا12.
    ملاحظة: توقيت موت الفئران يؤثر على عدد الكريات البيض في أنسجة الرئة كجزء من الالتهاب. ولذلك، فمن المستحسن لضبط رقم الخلية إلى 1 X 106 خلايا /60 ميكرولتر لتحقيق أفضل نتائج تلطيخ لتحليل الخلايا تدفق.
  6. لتحليل FACS، تحضن الخلايا مع الأجسام المضادة CD16/CD32 في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لمنع الربط غير محددة من الغلوبولين المناعي لمستقبلات Fc. إضافة 20 μL من الحل حجب إلى 1 X 106 خلايا في 60 ميكرولتر في أنبوب 5 مل.
  7. وفي الوقت نفسه، إعداد مزيج رئيسي مع العازلة FACS والأجسام المضادة كما هو موضح في الجدول 2.
  8. بعد حجب، لا تغسل الخلايا. أضف 20 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الرئيسي لكل عينة للحصول على حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر.
  9. اغسل كل عينة بمل واحد من العازلة والطرد المركزي لـ 5 دقائق عند 400 ×غ. تخلص من الفوقاتان وإعادة تعليق بيليه مع العازلة FACS إلى تركيز الخلية المناسبة لقياسات FACS.
    ملاحظة: يقترح عدد خلايا 1 × 106 خلايا/500 ميكرولتر لتحقيق أفضل نتائج phenotyping المناعة في تحليل FACS مع هذا البروتوكول. ومع ذلك، فمن المستحسن أن الأجسام المضادة يجب أن تكون بتصنيفها بشكل فردي.
  10. إذا لزم الأمر، إضافة تلطيخ حية / ميتة قبلتلطيخ السطح باستخدام مجموعات محددة متاحة تجاريا 8.
  11. وأخيراً، أضف أعداداً ثابتة من حبات المعايرة المزودة بالفلوروكروم المتاحة تجارياً (3 x 105 حبات في 20 ميكرولتر من العازلة لـ FACS) إلى كل عينة لتحديد أرقام الخلايا المطلقة12. تظهر استراتيجية التخثر للدم، BAL، وخلايا الأنسجة في الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم التحقق من صحة النهج الموصوف للحث على ALI في الفئران عن طريق تقييم التعبير السيتوكين، وتسلل المحببات العدلية، وتعطيل حاجز الحويفيو الشعري 24 ساعة و 72 ساعة بعد غرس LPS. وكانت الحيوانات التي يتم حقنها من قبل PBS بمثابة عنصر تحكم. وقد تسببت إدارة LPS داخل الرغامى في استجابة قوية للالتهابات الرئوية. وقد تم تنظيم التعبير عن TNF-α في أنسجة الرئة بشكل ملحوظ، حيث وصل إلى زيادة مستمرة وأكثر من 50 ضعف مقارنة بالحيوانات المسيطرة [TNF-α/18s)؛ و24 ح: 53.7 (SD = 11.6)؛ 72 h: 55.0 (SD = 20.6)؛ p < 0.05)] (الشكل3A). غزو الكريات البيض في الأنسجة والحُقد الفضاء هو السمة المميزة والسمة لتطوير ALI13. كشف تحليل FACS عن تسلل كبير من المحببات العدلية (NG) في interstitium الرئة، مع عدد الخلايا المطلقة بعد زيادة ما يقرب من 9 أضعاف بالمقارنة مع الضوابط بعد 24 ح [65,243 (SD = 15,855) مقابل 7,358 (SD = 4,794), p < 0.05] ( الشكل 3باء). انخفض عدد NG المطلق قليلا بعد 72 ح. ومع ذلك، ظلت الزيادات عامل مقارنة مع الضوابط مستقرة [48,946 (SD = 5,223) مقابل 5,510 (SD = 654), p < 0.05]. وتمشيامع تسلل NG الخلالي، زاد التعبير MMP-9 في أنسجة الرئة بأكملها زيادة كبيرة على مدى فترة المراقبة الإجمالية [RQ (MMP-9/18s)، 24 ح: 7.4 (SD = 1.5)؛ 72 ح: 10.4 (SD = 2.0)؛ p < 0.05] (الشكل3C).

NG لم يتم زيادة فقط في أنسجة الرئة ولكن أيضا في السائل BAL. وكانت زيادة الطي مقارنة بالحيوانات المسيطرة أكثر وضوحاً مما كانت عليه في أنسجة الرئة، حيث بلغ عدد NG المطلق 24 ساعة بعد تحريض ALI بـ 52,005 (SD = 21,906) مقابل 1,829 (SD = 1,724) (p < 0.05) (الشكل3D). وبعد 72 ساعة، زاد معدل النانوغرام إلى 254 37 (SD = 478 4) مقابل 17.0 (SD = 10.8) (p < 0.05). وذمة الرئة بسبب ضعف شديد في حاجز الحويفية الشعرية هو pathognomonic لتطوير ALI، مع LPS تحفيز بسرعة المبرمج البطانية وزيادة نفاذية14،15. تحليل محتوى الألبومين في السائل BAL من قبل ELISA كشفت عن خسارة كبيرة في وظيفة الحاجز. 24 ساعة بعد غرس LPS، كان الألبومين في السائل BAL 43 نانوغرام / مل (SD = 13)، مقارنة مع 20 نانوغرام / مل (SD = 9) تحت ظروف السيطرة (p < 0.05) (الشكل3هاء). بعد 72 ح، في الحيوانات ALI، كان محتوى الألبومين 48 نانوغرام /مل (SD = 14)، مقارنة مع 29 نانوغرام /مل (SD = 9) (p < 0.05).

Figure 1
الشكل 1 رسم تخطيطي لإعداد التنبيب. تجدر الإشارة إلى أن عنق الماوس يجب أن يكون فائقة الموسعة في زاوية 90 درجة بالنسبة إلى طاولة العملية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 استراتيجية FACS التخثر للدم، BAL، وخلايا الأنسجة. تظهر البقع نقطة مثالية من تحليل FACS في اثنين من المعلمة (اللون المزدوج الفلورسنت) المؤامرات الزائفة. وتستند استراتيجية الجمّة للعينات المعنية على خلايا مفردة. (أ) شجرة الزغ لخلايا الدم: a = الخلايا الميتة؛ (ب) الخلايا الحية (وفقاً لتلطيخ الخلايا الحية/الميتة؛ لا يوجد تلطيخ CD45 ضروري كما هو الحال في الدم، وفلوري ة عالي يجعل سكان الخلايا مميزين بوضوح)؛ د = الحبيبات العدلية؛ ه = أحاديات (وفقا ل Gr1 و CD115 تلطيخ). (B) شجرة الزنج لسائل غسل القصبات (BAL): a = الخلايا الميتة؛ (ب) الخلايا الحية (وفقاً لتلطيخ الخلايا الحية/الميتة)؛ ج = CD45+ الخلايا المناعية. د = الحبيبات العدلية؛ و ه = الضامة (وفقا لLy6G و F4/80 تلطيخ). (C) شجرة الزغ لأنسجة الرئة: a = الخلايا الميتة؛ (ب) الخلايا الحية (وفقاً لتلطيخ الخلايا الحية/الميتة)؛ ج = CD45+ الخلايا المناعية. د = الحبيبات العدلية؛ و ه = الضامة (وفقا لLy6G و F4/80 تلطيخ). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم المواد / المعدات حجم التداول (مل)
الفوسفات العازل من دولبيكو (PBS)، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم، معقم 1000
مصل عجل الجنين (FCS) 1
محلول حمض الاثيلين ديامين تتراسيتيك (EDTA) 1
أزيد الصوديوم (NaN3) 0.1

الجدول 1: تركيب المخزن المؤقت لـ FACS.

اسم المواد / المعدات التخفيف المقترح Mastermix ل عينات 10: إضافة إلى 200 ميكرولتر FACS العازلة (= 20 ميكرولتر لكل عينة):
مضاد CD115 (c-fms) 0.5 ميكرولتر/100 ميكرولتر 5 ميكرولتر
مكافحة CD11b (M1/70) - FITC 0.5 ميكرولتر/100 ميكرولتر 5 ميكرولتر
مكافحة CD45 (30-F11) - eF450 0.5 ميكرولتر/100 ميكرولتر 5 ميكرولتر
مكافحة F4/80 (BM-8) - PE Cy7 0.5 ميكرولتر/100 ميكرولتر 5 ميكرولتر
مكافحة Gr1 (RB6-8C5) 0.5 ميكرولتر/100 ميكرولتر 5 ميكرولتر
مكافحة لly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 0.5 ميكرولتر/100 ميكرولتر 5 ميكرولتر
المضادة لليي (1A8) APC / Cy7 0.5 ميكرولتر/100 ميكرولتر 5 ميكرولتر

الجدول 2: إعداد مزيج رئيسي لتلوين الاختبارات الميدانية. يصف الجدول إعداد المزيج الرئيسي لعشرة عينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، وتكرار جيد هي السمات الرئيسية للنهج المقدم للحث على ALI في نموذج القوارض الصغيرة. استخدام LPS بدلا من البكتيريا كلها في النماذج الحيوانية له مزايا. وهو مركب مستقر ونقي ويمكن تخزينها في شكل الليوفيليز حتى الاستخدام. وهو منبه قوي للاستجابات المناعية الفطرية عبر مسار TLR4، ويمكن بسهولة قياس نشاطه البيولوجي، مما يسهل معايرة شدة المرض مع إمكانية استنساخ جيدة. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن استخدام LPS بمثابة نموذج آمن للحث على التهاب الشعب الهوائية الحاد في المتطوعين الأصحاء الإنسان، وبالتالي يسمح الترجمة من مقاعد البدلاء إلى السرير16. وقد أظهر ريترش وآخرون التطورات المعتمدة على الجرعة والوقت لتسرب الخصي الكبيّر المميّز فينموذج المورين من التبيل داخل الرغامى 6 . وهذا يسمح بمعايرة الجرعة لتحقيق بعض الآثار المرجوة، والتي يمكن أن توضح درجات مختلفة من شدة ALI أو في وقت مبكر مقابل بداية متأخرة من أعراض المرض. ومع ذلك، إذا كان هناك مشاكل خاصة بالعدوى أو الدوائية يجب معالجتها (مثل العلاج بالمضادات الحيوية)، فإن ALI الناجم عن تهيئة LPS المعقم ليس نموذجاً مناسباً.

وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الولادة داخل الرئة أو عن طريق الوريد من البكتيريا، ووصفتعطيل حاجز الحويفية الشعرية بأنها خفيفة نوعا ما 3، التشكيك في ملاءمة هذا النموذج وما إذا كان ينبغي أن يكون نفاذية تغيير التحقيق خاصة. وضع الصحيح من القسطرة لتسليم LPS ثنائيا في الجهاز التنفسي السفلي هو الخطوة الحاسمة من النهج. لضمان التنبيب السليم داخل الرغامى، يسهل التصوير وتعريف الحنجرة من قبل مصدر خارجي للضوء البارد. التغيرات في نمط الجهاز التنفسي (مثل السعال أو الخفقان) تحقق من الغرس الصحيح داخل الرغامى للسائل.

وعلاوة على ذلك، فإن اختيار سلالة الفأر وLPS حاسمة لتحريض ALI وتوليد النتائج القابلة للتكرار في هذا النموذج وتعتمد على القضية العلمية التي تم تناولها. وفقا للأدب, الجرعة التي تدار لإثارة تأثير أقصى مع أي زيادة أخرى مع جرعات متصاعدة يتراوح من 10 ميكروغرام / الماوس (عندما يتم حقن LPS من الزائفة الزنجارية F-D نوع 1 في الفئران بالب / ج الإناث) إلى 50 ميكروغرام / الماوس عندما حقن E. القولونية (النمط المصلي O111: B4) LPS (الذي كان يستخدم أيضا في البروتوكول) في الفئران C57BL/6 الذكور6,9. بشكل عام، من المفترض أن تتفاعل الفئران BALB/C بحساسية عند تحديها مع LPS، في حين أن الفئران C57BL/6 يبدو أن أكثر مقاومة3. وبالتالي، يوصى بإجراء تجارب أولية للمعايرة بالجرعات تحترم الظروف الفردية. وهذا ينطبق أيضا على توقيت الدم, BAL, وأخذ عينات من الأعضاء. يمكن تحديد شدة ALI سريريا عن طريق المراقبة المنتظمة لأعراض درجة حرارة الجسم وأعراض الضائقة التنفسية. وعلاوة على ذلك، منذ الفئران فقط حصة ما يقرب من 50٪ homology من مستقبلات TLR4 مع البشر، وتفسير دقيق للنتائج إلزامية3.

بدائل النهج المعروض هنا تشمل الطريق من إدارة التوكسين الداخلي إلى الرئتين. كما هو موضح من قبل Szarka وآخرون، يمكن أيضا أن تدار LPS عن طريق غرس داخل الأنف9. قارن ليو وآخرون الترسب المباشر داخل الرغامى باستنشاق الهباء الجوي LPS5. واستناداً إلى النتائج التي توصلوا إليها، خلصوا إلى أن الطريق الاستنشاقي يحفز على نوع أكثر اتساقاً من ALI. ومع ذلك، أجريت تجاربهم في الفئران مع تدفق موجهة الأنف فقط استنشاق، وبالتالي قد لا يتم بالضرورة نقلها إلى النهج المعروض هنا. وعلى النقيض من ذلك، غالباما تتعرض الفئران لLPS الهباء الجوي في غرفة10. حجم الغرفة، وتركيز LPS، وعدد الفئران تعامل في وقت واحد هي المتغيرات التي تحد من إمكانية المقارنة بين الدراسات المختلفة وجعل مؤسسة نموذج الفردية الموصى بها. وأخيرا، غالبا ما يستخدم الحقن الوريدي أو داخل القبلات في الـ LPS للحث على ALI17عن بعد،18. وكما تشير البيانات الواردة من Szarka et al. فإن الغرس داخل الرغامى يبدو أعلى من الطريق i.v. أو i.p. عندما يتم التصدي لتأثيرات التهابية رئوية محددة9. وفي الختام، يمثل البروتوكول نهجاً بسيطاً وقابلاً للتكرار لحث ALI المعقمة في الفئران على معالجة قضايا مناعية محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا جان كلينر وسوزان شولتز على تقديم الدعم التقني. ويقر المؤلفون بالدعم الممتاز الذي يقدمه المرفق الأساسي للقياس الدفقي في كلية الطب بجامعة بون. ولم يتلق المؤلفون أي تمويل من أي منظمة خارجية.  وقد سبق أن عرض جزء من البيانات الواردة في قسم النتائج والمبينة في الشكل 3 في منشور سابقرقم 8.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringes BD, Franklin Lakes, NJ, USA 300013
10 ml syringes BD, Franklin Lakes, NJ, USA 309110
Anti-CD115 (c-fms) APC Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) - FITC Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) - eF450 Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5) BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA 552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 Bio Legend, San Diego, CA 127623
Buprenorphine hydrochloride Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm) BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA 340487
Canula 23 gauge 1'' BD, Franklin Lakes, NJ, USA 300800
Canula 26 gauge 1/2'' BD, Franklin Lakes, NJ, USA 303800
Cell strainer 70 µm BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA 352350
Collagenase Type I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 1148089
Deoxyribonuclease II Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA D8764 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA D8662
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA D8537
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA E7889
FACS tubes, 5 ml Sarstedt, Nümbrecht, Germany 551579
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F2442
Forceps Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11049-10
Isoflurane Baxter, Unterschleißheim, Germany
Ketamine hydrochloride Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA L2630
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit Thermo Fisher, Waltham, MA, USA L23101
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 BD, Franklin Lakes, NJ, USA 553141
Red blood cell lysis buffer Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA R8758
Scissors Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 14060-09
Sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA S2002
Spring scissors Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 15018-10
Tissue forceps Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11021-12
Tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 30125150
Venous catheter, 22 gauge B.Braun, Melsungen, Germany 4268091B
Xylazine hydrochloride Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
  2. Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
  3. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
  4. Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
  5. Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
  6. Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
  7. D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
  8. Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
  9. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  10. Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
  11. Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
  12. Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
  13. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
  14. Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
  15. Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
  16. Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
  17. Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
  18. Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).

Tags

الطب العدد 149 إصابة الرئة الحادة السكاريد الشحمي LPS نموذج المورين تبيل داخل الرغامى التهاب FACS أي تحلل
إحداث إصابات الرئة الحادة في الفئران عن طريق التبيل المباشر للكيس الشحمي داخل الرغامى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ehrentraut, H., Weisheit, C. K.,… More

Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation. J. Vis. Exp. (149), e59999, doi:10.3791/59999 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter