Summary
यहाँ प्रस्तुत एक कदम दर कदम प्रक्रिया सीधे intratracheal lipopolisaccharide instillation द्वारा चूहों में तीव्र फेफड़ों की चोट प्रेरित करने के लिए और रक्त के नमूनों का FACS विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए है, ब्रोंकोएलवेलर lavage तरल पदार्थ, और फेफड़ों के ऊतकों. न्यूनतम इनवेसिवनेस, सरल हैंडलिंग, अच्छा reproducibility, और रोग गंभीरता के अनुमापन इस दृष्टिकोण के फायदे हैं.
Abstract
lipopolysaccharide के एयरवे प्रशासन (एलपीएस) छोटे पशु मॉडल में फुफ्फुसीय सूजन और तीव्र फेफड़ों की चोट (एलआई) का अध्ययन करने के लिए एक आम तरीका है। विभिन्न दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है, जैसे एयरोसोलाइज्ड एलपीएस के साथ-साथ नाक या इंट्राट्रेकल इन्स्टिट्यूट का अंत:श् वांत। प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष इंट्राट्रेकल एलपीएस पैदा करने और रक्त के नमूनों का FACS विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा चूहों में ALI प्रेरित करने के लिए एक विस्तृत कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है, ब्रोंकोalveolar lavage (BAL) तरल पदार्थ, और फेफड़ों के ऊतकों. इंट्रापेरिटोनल सेडेशन के बाद, श्वासनली को उजागर किया जाता है और एलपीएस को 22 जी शिरापरक कैथेटर के माध्यम से प्रशासित किया जाता है। ल्यूकोसाइट आक्रमण के साथ एक मजबूत और पुन: उत्पादनीय सूजन प्रतिक्रिया, प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का विनियमन, और एवओलो-कैपिलरी बाधा के विघटन का उपयोग किए गए एलपीएस खुराक के आधार पर घंटों के भीतर प्रेरित किया जाता है। रक्त के नमूने का संग्रह, बाल तरल पदार्थ, और फेफड़ों की कटाई, साथ ही FACS विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण, प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित हैं. हालांकि बाँझ एलपीएस का उपयोग संक्रामक रोगों में फार्माकोलॉजिक हस्तक्षेप का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है, वर्णित दृष्टिकोण न्यूनतम आक्रामकता प्रदान करता है, सरल हैंडलिंग, और मशीनी प्रतिरक्षा संबंधी सवालों का जवाब देने के लिए अच्छा reproducibility. इसके अलावा, खुराक अनुमापन के साथ ही वैकल्पिक एलपीएस तैयारी या माउस उपभेदों के उपयोग नैदानिक प्रभाव है, जो ALI गंभीरता या जल्दी बनाम रोग के लक्षणों की देर से शुरुआत के विभिन्न डिग्री प्रदर्शन कर सकते हैं के मॉडुलन की अनुमति देते हैं.
Introduction
प्रायोगिक पशु मॉडल बुनियादी प्रतिरक्षा अनुसंधान में अपरिहार्य हैं. स्थानीय या प्रणालीगत सूजन1को प्रेरित करने के लिए छोटे जानवरों के मॉडलों में पूरे बैक्टीरिया या माइक्रोबियल घटकों के प्रशासन का अक्सर उपयोग किया जाता रहा है . Lipopolysaccharide (LPS, या बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन) एक सेल दीवार घटक और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की सतह प्रतिजन है (उदाहरण के लिए, Enterobacteraceae, Peudomonas spp., या Legionella spp.). थर्मोस्टेबल और बड़े अणु (आण्विक भार 1-4 x 106 केडीए) में लिपिड मोइटी (लिपिड ए), कोर क्षेत्र (ओलिगोसैकराइड), और एक ओ पॉलीसैकेराइड (या ओ प्रतिजन) होते हैं। लिपिड ए, अपने हाइड्रोफोबिक फैटी एसिड चेन के साथ, अणु को जीवाणु झिल्ली में स्थिर करता है और (बैक्टीरिया की गिरावट पर) इम्यूनोलॉजिकल गतिविधि और एलपीएस की विषाक्तता को मध्यस्थता करता है। एलपीएस बाइंडिंग प्रोटीन (एलएसपी) के लिए बाध्यकारी होने के बाद, एलपीएस:एलबीपी परिसरों कई सेल प्रकार की सतह पर स्थित CD14/TLR4/MD2 रिसेप्टर परिसर को निर्देशित करता है, एनएफ-बी परमाणु स्थानांतरण और बाद में अपरेगुलेशन के साथ एक मजबूत प्रोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है साइटोकीन अभिव्यक्तिकी 2|
तीव्र फेफड़ों की चोट (एएलआई) को दिल की विफलता3की अनुपस्थिति में द्विपक्षीय फुफ्फुसीय एडीमा के साथ तीव्र हाइपोक्सेमिक श्वसन विफलता के रूप में परिभाषित किया गया है। एलपीएस का एयरवे प्रशासन फुफ्फुसीय सूजन और एएलआई4,5,6,7को प्रेरित करने का एक आम तरीका है . हालांकि बाँझ पदार्थ संक्रामक रोगों में फार्माकोलॉजिक हस्तक्षेप का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है, मशीनी प्रतिरक्षा संबंधी प्रश्नों का पर्याप्त परिशुद्धता के साथ उत्तर दिया जा सकता है। ट्रेकिया में एलपीएस के instillation ल्यूकोसाइट आक्रमण के साथ एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया लाती है, प्रो भड़काऊ साइटोकिन्स के विनियमन, और दिनों के लिए घंटे के भीतर alveolo-केपिला बाधा के विघटन, एलपीएस खुराकपरनिर्भर करता है3, 6,7.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल intratracheal LPS instillation द्वारा चूहों में ALI प्रेरित करने के लिए एक विस्तृत कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है. मॉडल साइटोकिन अभिव्यक्ति का आकलन करके मान्य किया गया है, न्यूट्रोफिल granulocyte आक्रमण,और इंट्रा-एलोडोर एल्बुमिन रिसाव के रूप में पहले 8 वर्णित .
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Protocol
इस पशु प्रोटोकॉल पशु देखभाल के लिए स्थानीय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (LANUV, Recklinghausen, जर्मनी; प्रोटोकॉल संख्या 84-02.04.2015) और जीवित पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था (NIH प्रकाशन नहीं, 85-23, संशोधित 1996).
1. अली प्रेरण
- के बारे में 10-12 सप्ताह की उम्र में वयस्क C57BL/6 चूहों का प्रयोग करें. पानी और मानक कृंतक चाउ के लिए नि: शुल्क उपयोग के साथ व्यक्तिगत हवादार पिंजरों में जानवरों घर। हालांकि, यह युवा जानवरों पर और अन्य चूहों उपभेदों के साथ इस दृष्टिकोण प्रदर्शन करने के लिए संभव है.
- स्टोर एलपीएस (Escherichia कोलाई O111:B4) की सांद्रता में 5 mg/mL पर -20 डिग्री सेल्सियस. अंत:श् लकी आसवन के लिए, 2,000 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) में एलपीएस को पतला करें।
- चूहे का वजन करें। केटामाइन [120 mg/kg माउस बॉडीवेट (BW)] और xylazine (16 mg/kg BW) इंट्रापेरिटोनली (पेट का कम एक तिहाई, पैरामिडियान), और संज्ञाहरण की शुरुआत तक प्रतीक्षा करें।
- एक स्पर्श उत्तेजना inducing द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें. अपर्याप्त संज्ञाहरण के मामले में, केटामाइन (30 मिलीग्राम/किलोग्राम BW) और xylazine (4 मिलीग्राम/kg BW) के साथ इंजेक्शन दोहराएँ।
- 37 डिग्री सेल्सियस के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए माउस को तापमान-नियंत्रित मेज पर प्रवण स्थिति में रखें।
- संज्ञाहरण के तहत कॉर्निया के शुष्कीकरण को रोकने के लिए बाँझ नेत्र स्नेहक लागू करें।
- मेज के ऊपर लगभग 5 सेमी की स्थिति में एक क्षैतिज पट्टी पर सिर और हुक छेदक को उठाएं, जबकि फोरपाव तालिका के साथ निकट संपर्क में रहते हैं। सारणी के सापेक्ष 90 डिग्री कोण में गर्दन का अति विस्तार (चित्र1)। आसान intubation शर्तों के लिए गले को सीधा करने के लिए forceps के साथ जीभ पकड़ो.
- 20 मिमी की लंबाई के लिए एक 22 गेज (जी) शिरापरक कैथेटर काटें। जीभ की जड़ के साथ ऊर्ध्वाधर दिशा में कैथेटर डालें। मुखर chords कल्पना और श्वासनली के लिए उद्देश्य में मदद करने के लिए गला के ऊपर त्वचा पर एक ठंडा प्रकाश स्रोत रखें। गला का प्रतिरोध होता है, तो फिर से आगे बढ़ने से पहले कैथेटर कुछ मिलीमीटर वापस ले।
- कैथेटर लगभग 10 मिमी श्वासनली में डालें। सुनिश्चित करें कि प्रविष्टि बहुत गहरी नहीं है क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सही या बाएं मुख्य ब्रोंकस में तरल पदार्थ की एकतरफा पैदा हुई होगी।
- पीबीएस में पतला एलपीएस (5 ग्राम/जी बीडब्ल्यू) को एक पिपेट [इंजेक्शन मात्रा का उपयोग करके पतला किया गया) माउस बॉडीवेट पर निर्भर करता है (उदा., 20 ग्राम बॉडीवेट [ एलपीएस समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें)]।
नोट: माउस आम तौर पर खांसी या श्वासनली में तरल पदार्थ की उचित डालने के लिए gasping के साथ जवाब देंगे. - एक सिरिंज कनेक्ट करें और यह आश्वासन देने के लिए 50 एमएल हवा का एक बोलू जोड़ें कि फेफड़ों में तरल मात्रा वितरित की जाती है। धीरे-धीरे कैथेटर को हटा दें।
- श्वासनली से तरल पदार्थ के रिसाव से बचने के लिए 30 s के लिए एक ईमानदार स्थिति में माउस के ऊपरी शरीर रखें।
- शम-संचालित जंतुओं में एलपीएस के स्थान पर बाँझ पीबीएस का 50 डिग्री सेल्सियस इंजेक्ट करें।
- इंजेक्शन buprenorphine हाइड्रोक्लोराइड 0.08 mg/kg BW गर्दन पर ढीली त्वचा में तुरंत ALI प्रेरण के बाद और उसके बाद हर 12 एच, पहले 48 एच के दौरान.
- 37 डिग्री सेल्सियस के शरीर के तापमान को बनाए रखें जब तक कि वार्मिंग पैड पर माउस को रखकर पूरी जागरूकता हासिल न हो।
- भोजन और पानी के लिए नि: शुल्क उपयोग के साथ एक व्यक्तिगत हवादार पिंजरे में माउस स्थानांतरण। नियमित रूप से माउस की निगरानी करें। शरीर के तापमान और श्वसन अवसाद को कम करना अली के उचित प्रेरण को इंगित करता है।
2. रक्त नमूना, ब्रोंकोएलवेलर लावेज, अंग कटाई
नोट: इच्छामृत्यु का समय संबोधित वैज्ञानिक मुद्दे पर निर्भर करता है. आमतौर पर एलपीएस के बाद यह 12-72 एच किया जाता है3,4,9,10. शरीर के तापमान और श्वसन संकट के लक्षणों11के नियमित अवलोकन से एलआई की गंभीरता का नैदानिक रूप से निर्धारण किया जा सकता है .
- आइसोफ्लुरेन से भरे कक्ष में माउस रखकर संज्ञाहरण को प्रेरित करें। 1 L/min के ऑक्सीजन प्रवाह के साथ 3 vol% isoflurane का प्रयोग करें. एक स्पर्श उत्तेजना को प्रेरित करके गहरे narcosis सुनिश्चित करें. संज्ञाहरण की अपर्याप्त गहराई के मामले में, 5 vol% तक isoflurane वृद्धि.
- एटलांटो-ऑकसीपल अव्यवस्था द्वारा गहरी संज्ञाहरण में माउस को बलिदान करें।
- एक ऑपरेशन टेबल पर टेप के साथ माउस को ठीक करें और शीघ्र ही 70% इथेनॉल के साथ पेट पर फर कीटाणुरहित। कैंची और चिमटी के साथ मध्य रेखा में ध्यान से पेट गुहा खोलें। आंत के कुछ हिस्सों को निकालें ताकि वेना अवर (आईवीसी) कशेरुक स्तंभ और पेट के आरटा तक पहुंच प्राप्त हो सके।
- गुर्दे की नसों का पता लगाएँ और नसों के संगम के नीचे सीधे आईवीसी में 1 एमएल सिरिंज से जुड़ा एक तुला 23 जी कैनुला डालें। रक्त की 250 डिग्री सेल्सियस और 0.5 एम एथिलीनडिएथिमनेट्राएटिक एसिड (EDTA) समाधान के 20 डिग्री सेल्सियस से भरा एक 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण। EDTA मिश्रण की सुविधा के लिए धीरे हिला और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया.
- ब्रोंकोएल्वेलर लावेज (बीएएल) के लिए, 0.5 एमएल बाँझ पीबीएस और 0.1 एमएल हवा प्रत्येक के साथ तीन 1 एमएल सिरिंज तैयार करें। शीघ्र ही 70% इथेनॉल के साथ गले के फर कीटाणुरहित और ध्यान से कैंची और चम्मित करने के साथ श्वासनली का पर्दाफाश। श्वासनली को जुटाने और एक सीवन के चारों ओर लपेटो.
- बीएई प्रदर्शन: माइक्रो-स्किस्टर का उपयोग करके श्वासनली को पंचर करें और 20 मिमी की लंबाई में 22 जी शिरापरक कैथेटर कट डालें। सीवन के साथ कैथेटर को ठीक करें और बाँझ पीबीएस और 0.1 एमएल हवा के 0.5 एमएल को पैदा करें। 60 s. अतिरिक्त दो सिरिंजों के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ और बर्फ पर एक 15 एमएल ट्यूब में पूरे aspirate इकट्ठा करने के बाद तरल पदार्थ aspirate.
- ध्यान से कैंची और छनरी के साथ छाती खोलने के लिए फेफड़ों फसल. लागत मार्जिन के साथ डायाफ्राम कट और दो पार्श्व चीरों के साथ पसलियों के माध्यम से कटौती. ध्यान से फेफड़ों puncturing से बचें. स्टर्नम क्रैनली लिफ्ट और ठीक या इसे हटा दें।
- 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) के साथ दो 10 एमएल सीरिंज तैयार करें। बाएं वेंट्रिकल में एक छोटा सा चीरा बनाएं। एक 26 जी कैनुला के साथ सही वेंट्रिकल पंचर और prewarmed पीबीएस के साथ फुफ्फुसीय परिसंचरण फ्लश। प्रक्रिया के दौरान फेफड़ों के पीले रंग के होने के बारे में पता होना।
- फेफड़ों के दाएं पालि को हटा दें और इसे दो हिस्सों में काट लें। स्नैप उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज, आगे जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के बाद.
- पूरे बाएं फेफड़े निकालें और कैंची और ट्वीजर के साथ ऊतक mincing द्वारा एक 48 अच्छी तरह से थाली में यह homogenize. पाचन बफर के 2 एमएल में ऊतक इनक्यूबेट [आरपीएमआई 1640 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 0.1% NaN3, collagenase मैं (1 mg/mL), और DNase II (7 mg/mL)] 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे homogenization प्रदर्शन और फेफड़ों के ऊतकों के टुकड़े ऊपर की सावधानी से पाइपिंग द्वारा और अधिक homogenization प्रदर्शन नीचे.
3. FACS विश्लेषण के लिए ऊतक तैयारी
- ताजा FACS बफर तैयार करें (तालिका1): हमेशा कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त पीबीएस का उपयोग करने के लिए cation-निर्भर सेल से सेल आसंजन को कम करने और clumping को रोकने के. एफसीएस के साथ अनुपूरक (1%) apoptosis से कोशिकाओं की रक्षा के लिए, गैर विशिष्ट धुंधला को रोकने के लिए, और FACS ट्यूबों से चिपके रहने से कोशिकाओं को रोकने के. मैक्रोफेज जैसे चिपचिपा और अनुलग्न कोशिकाओं के साथ काम करते समय धन-आधारित सेल-टू-सेल आसंजन को रोकने के लिए EDTA (0.5 एमएम) शामिल करें। सोडियम अज़ीड (0.1%) जोड़ें, क्योंकि यह बैक्टीरियल संदूषण और फ्लोरोक्रोमक्रोम्स के फोटोब्लीचिंग को रोकता है और एंटीबॉडी बहा को रोकता है।
- रक्त के नमूने (चरण 2.4) को 5 एमएल FACS ट्यूबों में स्थानांतरित करें और रक्त को लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 2 एमएल के साथ मिलाएं। बर्फ पर ट्यूब रखो और बर्फ ठंडा पीबीएस के 2 एमएल जोड़कर 2 मिनट के बाद प्रतिक्रिया समाप्त. 400 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को त्याग दें। पहले वर्णित प्रोटोकॉल12के अनुसार बाद में एफएसीएस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस एफएसीएस बफर और प्रक्रिया के साथ सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
नोट: माउस के सुथानीकरण का समय प्रणालीगत सूजन के भाग के रूप में ल्यूकोसाइट गिनती को प्रभावित करता है। इसलिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा धुंधला परिणाम प्राप्त करने के लिए इस चरण में 1 x 106 कोशिकाओं/60 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल संख्या को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है। - सेंट्रीफ्यूज बाल तरल पदार्थ (चरण 2.6) के लिए 5 मिनट पर 400 x g. सुपरनेंट को प्रेरित करें और इसे तरल नाइट्रोजन में स्थिर करें, इसके बाद आगे प्रोटीन विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण किया जाता है। बाल सेल गोली को 2 एमएल ठंड FACS बफर के साथ पुन: स्फूर्त करें, फिर बालों को नियंत्रित करने के लिए एक 100 डिग्री मीटर जाल फिल्टर का उपयोग करके 5 एमएल FACS ट्यूब में निलंबन को स्थानांतरित करें।
- फिर, 400 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रण। पहले वर्णित प्रोटोकॉल12के अनुसार बाद में एफएसीएस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस एफ ए एस बफर और प्रक्रिया के साथ गोली को पुन: निलंबित करें ।
नोट: माउस के सुथानीकरण का समय सूजन के भाग के रूप में बाल में ल्यूकोसाइट गिनती को प्रभावित करता है। इसलिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा धुंधला परिणाम प्राप्त करने के लिए इस चरण में 1 x 106 कोशिकाओं/60 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल संख्या को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है। - पचा बाएँ फेफड़ों के ऊतकों स्थानांतरण (चरण 2.10) एक 5 एमएल FACS ट्यूब में एक 100 डिग्री एल जाल फिल्टर का उपयोग करने के लिए clumps निकालने और बर्फ ठंडा FACS बफर के 2 एमएल जोड़कर पाचन प्रक्रिया को समाप्त. 400 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए नमूना सेंट्रीफ्यूज। अधिनात को त्याग दें और पहले वर्णित प्रोटोकॉल12के अनुसार बाद में एफएसीएस के लिए एफएसीएस बफर और प्रक्रिया के 60 डिग्री सेल्सियस के साथ गोली को पुन: बंद कर दें .
नोट: माउस के सुथानीकरण का समय सूजन के हिस्से के रूप में फेफड़ों के ऊतकों में ल्यूकोसाइट गिनती को प्रभावित करता है। इसलिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा धुंधला परिणाम प्राप्त करने के लिए 1 x 106 कोशिकाओं/60 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल संख्या को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है। - FACS विश्लेषण के लिए, FC रिसेप्टर्स करने के लिए इम्यूनोग्लोबुलिन के गैर-विशिष्ट बंधन को ब्लॉक करने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर CD16/CD32 एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं। 5 एमएल ट्यूब में 60 डिग्री सेल्सियस में 1 x 106 कोशिकाओं में अवरोधित विलयन का 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
- इस बीच, तालिका 2में वर्णित एफएसीएस बफर और एंटीबॉडी के साथ मास्टर मिश्रण तैयार करें।
- अवरुद्ध करने के बाद, कोशिकाओं को न धोएं। 100 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रति नमूने एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण का 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- 400 x gपर 5 मिनट के लिए 1 एमएल एफएसीएस बफर और अपकेंद्रित्र के साथ प्रत्येक नमूने को धोएं । supernatant छोड़ें और FACS माप के लिए उपयुक्त सेल एकाग्रता के लिए FACS बफर के साथ गोली resuspend.
नोट: 1 x 106 कोशिकाओं/500 जेडएल की एक सेल संख्या इस प्रोटोकॉल के साथ एफएसीएस विश्लेषण में सबसे अच्छा प्रतिरक्षा phenotyping परिणाम प्राप्त करने के लिए सुझाव दिया है। हालांकि, यह सिफारिश की जाती है कि एंटीबॉडी को व्यक्तिगत रूप से titrated किया जाना चाहिए। - यदि आवश्यक हो, तो विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट8का उपयोग करसतह धुंधला करने से पहले लाइव/डेड धुंधला जोड़ें।
- अंत में, पूर्ण सेल संख्या12निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोक्रोम-युग्मित अंशांकन मोती (3 x 105 मोती 20 $L FACS बफर में) की निश्चित संख्या जोड़ें। रक्त, बाल और ऊतक कोशिकाओं के लिए गेटिंग कार्यनीति चित्र 2में दर्शाया गया है।
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Representative Results
चूहों में ALI प्रेरित करने के लिए वर्णित दृष्टिकोण cytokine अभिव्यक्ति का आकलन करके मान्य किया गया था, न्यूट्रोफिल दानेदार घुसपैठ, और alveolo-कैपिलरी बाधा व्यवधान 24 एच और 72 एच LPS पैदा करने के बाद. पीबीएस इंजेक्शन जानवरों नियंत्रण के रूप में कार्य किया. इंट्राट्रेलल एलपीएस प्रशासन ने एक मजबूत फुफ्फुसीय प्रोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया प्रेरित की। फेफड़ों के ऊतकों में TNF-जेड की अभिव्यक्ति काफी ऊपर विनियमित किया गया था, नियंत्रण जानवरों की तुलना में एक निरंतर और 50 गुना से अधिक वृद्धि तक पहुँचने [RQ (TNF-$/18s); 24 h: 53.7 (एसडी ] 11.6); 72 h: 55.0 (एसडी ] 20.6); p और lt; 0.05) (चित्रा 3). ऊतक और कूपिका अंतरिक्ष में ल्यूकोसाइट आक्रमण एक पहचान है और अली13के विकास के लिए विशेषता है . FACS विश्लेषण से पता चला न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट्स (एनजी) की फेफड़ों के इंटरस्टिशियम में एक महत्वपूर्ण घुसपैठ, पूर्ण सेल गिनती के साथ लगभग 9 गुना वृद्धि हुई है के बाद नियंत्रण की तुलना में 24 h [65,243 (एसडी ] 15,855) बनाम 7,358 (एसडी [ 4,794), p; lt; 0.05 ] ( चित्र 3ठ) निरपेक्ष एनजी गिनती थोड़ा 72 ज के बाद कम हो गई; हालांकि, नियंत्रण की तुलना में कारक वृद्धि स्थिर बनी हुई [48,946 (एसडी $ 5,223) बनाम 5,510 (एसडी [ 654), p और lt; 0.05]. बीचवाला एनजी घुसपैठ के अनुरूप, पूरे फेफड़ों के ऊतकों में एमएमपी-9 अभिव्यक्ति इसी तरह कुल अवलोकन अवधि [आरक्यू (एमएमपी-9/18), 24 ज: 7.4 (एसडी जेड 1.5); 72 एच: 10.4 (एसडी जेड 2.0); पी और एलटी; 0.05 ] (चित्र 3सी) में काफी वृद्धि हुई थी।
एनजी न केवल फेफड़ों के ऊतकों में वृद्धि हुई है, लेकिन यह भी बाल तरल पदार्थ में थे। नियंत्रण जानवरों की तुलना में गुना वृद्धि फेफड़ों के ऊतकों की तुलना में अधिक स्पष्ट था, पूर्ण एनजी गिनती के साथ 24 एच के बाद ALI प्रेरण 52,005 (एसडी $ 21,906) बनाम 1,829 (एसडी $ 1,724) (पी एंड एलटी; 0.05) (चित्र 3डी)। 72 ज के बाद, एनजी को बढ़ाकर 37,254 (एसडी $ 4,478) बनाम 17.0 (एसडी $ 10.8) (पी एंड एलटी; 0.05) कर दिया गया। Alveolo-कैपिलरी बाधा की गंभीर हानि के कारण फेफड़ों edema ALI के विकास के लिए pathognomonic है, एलपीएस तेजी से endothelial apoptosis प्रेरित और वृद्धि पारगम्यता14,15के साथ. ELISA द्वारा बाल तरल पदार्थ में एल्बुमिन सामग्री के विश्लेषण बाधा समारोह का एक महत्वपूर्ण नुकसान से पता चला. 24 ज बाद एलपीएस आस,त, बाल द्रव में एल्बुमिन 43 एनजी/एमएल (एसडी जेड 13) था, जबकि नियंत्रण स्थितियों में 20 एनजी/एमएल (एसडी जेड 9) की तुलना में (पी एंड एलटी; 0.05) (चित्र 3ई)। 72 ज के बाद, ALI जानवरों में, एल्बुमिन सामग्री 48 ng/mL (SD $ 14) थी, 29 एनजी/एमएल (एसडी जेड 9) (पी एंड एलटी; 0.05) की तुलना में।
चित्र 1 : intubation सेटिंग के Schematic आरेख. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माउस की गर्दन ऑपरेशन टेबल के सापेक्ष 90 डिग्री कोण पर सुपर-एक्सटेंडेड होनी चाहिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : रक्त, बाल, और ऊतक कोशिकाओं के लिए FACS gating रणनीति. FACS विश्लेषण के अनुकरणीय डॉट blots दो पैरामीटर (दोहरी रंग फ्लोरोसेंट) छद्म रंग भूखंडों में दिखाए जाते हैं. संबंधित नमूनों के लिए गैटिंग रणनीति एकल कोशिकाओं पर आधारित है। (ए) रक्त कोशिकाओं के लिए गैटिंग ट्री: एक जेड मृत कोशिकाओं; ख ] जीवित कोशिकाओं (जीवित/मृत कोशिका के दाग के अनुसार; रक्त में, उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस के रूप में आवश्यक कोई CD45 धुंधला नहीं है, कोशिका ओंकार को स्पष्ट रूप से अलग करता है); घ ] न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट्स; ई - monocytes (Gr1 और CD115 धुंधला के अनुसार). (बी) ब्रोंकोएलवेलर लावेज (BAL) तरल पदार्थ के लिए गैटिंग ट्री: एक जेड मृत कोशिकाओं; ख ] जीवित कोशिकाओं (जीवित/मृत कोशिका धुंधला के अनुसार); c ] CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं; घ ] न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट्स; और ई - मैक्रोफेज (Ly6G और F4/80 धुंधला के अनुसार)। (ग) फेफड़ों के ऊतकों के लिए गैटिंग ट्री: एक जेड मृत कोशिकाओं; ख ] जीवित कोशिकाओं (जीवित/मृत कोशिका धुंधला के अनुसार); c ] CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं; घ ] न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट्स; और ई - मैक्रोफेज (Ly6G और F4/80 धुंधला के अनुसार)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : नियंत्रण जानवरों के खिलाफ murine ALI मॉडल का सत्यापन. (क) मादा C57BL/6 चूहे 24 ज और 72 h के फेफड़ों के ऊतकों में TNF-जेड की अभिव्यक्ति intratracheal LPS instillation के बाद (शर्म संचालित जानवरों की अभिव्यक्ति के गुना परिवर्तन). (बी) फेफड़ों के ऊतकों में पूर्ण न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट गणना का एफएसीएस विश्लेषण। (ग) फेफड़ों के ऊतकों में एमएमपी-9 की अभिव्यक्ति (शम संचालित पशुओं की अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन)। (घ) ब्रोंकोएल्वेलर लावेज तरल पदार्थ में पूर्ण न्यूट्रोफिल ग्रैन्युलोसाइट गणना का एफएसीएस विश्लेषण। (ई) बाल तरल पदार्थ में एल्बुमिन सामग्री [मतलब ] एसडी, n ] 7, मान-Whitney यू परीक्षण, * पी एंड एलटी; 0.05 (vs. PBS नियंत्रण)]। यह आंकड़ा Ehrentraut एट अल से संशोधित किया गया है8. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| सामग्री का नाम / | वॉल्यूम (एमएल) |
| कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड, बाँझ बिना Dulbecco के फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस), | 1000 |
| भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) | 1 |
| एथिलीनडिमिनेटेट्रासेटिक एसिड (EDTA) समाधान | 1 |
| सोडियम अज़ीदे (NAN3) | 0.1 |
तालिका 1: FACS बफर की संरचना.
| सामग्री का नाम / | सुझाए गए तनुकरण | 10 नमूनों के लिए Mastermix: करने के लिए जोड़ें 200 [l FACS बफर (प्रति नमूना $ 20 $l): |
| विरोधी CD115 (सी-एफएमएस) एपीसी | 0.5 जेडएल/ | 5 $L |
| विरोधी CD11b (M1/70) - FITC | 0.5 जेडएल/ | 5 $L |
| विरोधी CD45 (30-F11) - eF450 | 0.5 जेडएल/ | 5 $L |
| विरोधी F4/80 (बीएम-8) - पीई Cy7 | 0.5 जेडएल/ | 5 $L |
| विरोधी Gr1 (RB6-8C5) | 0.5 जेडएल/ | 5 $L |
| विरोधी Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | 0.5 जेडएल/ | 5 $L |
| विरोधी Ly6G (1A8) APC/ | 0.5 जेडएल/ | 5 $L |
तालिका 2: FACS धुंधला के लिए मास्टर मिश्रण की तैयारी. तालिका 10 नमूनों के लिए मास्टर मिश्रण तैयारी का वर्णन करता है.
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Discussion
न्यूनतम इनवेसिवनेस, सरल हैंडलिंग, और अच्छा reproducibility प्रस्तुत दृष्टिकोण की प्रमुख विशेषताएं एक छोटे कृंतक मॉडल में ALI प्रेरित कर रहे हैं. पशु मॉडल में पूरे बैक्टीरिया के बजाय एलपीएस का उपयोग लाभ है. यह एक स्थिर और शुद्ध यौगिक है और उपयोग होने तक lyophilized रूप में संग्रहीत किया जा सकता है। यह TLR4 मार्ग के माध्यम से सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए एक शक्तिशाली उत्तेजक है, और इसकी जैविक गतिविधि आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, अच्छा reproducibility के साथ रोग गंभीरता की अनुमापन की सुविधा. इसके अलावा, एलपीएस का उपयोग मानव स्वस्थ स्वयंसेवकों में तीव्र ब्रोंकाइटिस प्रेरित करने केलिए सुरक्षित मॉडल के रूप में सेवा करने के लिए दिखाया गया है और इस प्रकार 16 बिस्तर पर बेंच से अनुवाद की अनुमति देता है। Rittirsch एट अल की खुराक का प्रदर्शन किया है और समय पर निर्भर विशेषता alveolo-केपिला लीकेज के एक murine मॉडल में intratracheal LPS instillation6. यह खुराक अनुमापन कुछ वांछित प्रभाव प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, जो अली गंभीरता या जल्दी बनाम रोग के लक्षणों की देर से शुरुआत के विभिन्न डिग्री वर्णन कर सकते हैं. हालांकि, अगर अलग infectiological या औषधीय मुद्दों को संबोधित किया जाना है (जैसे, एंटीबायोटिक चिकित्सा), बाँझ एलपीएस instillation द्वारा प्रेरित ALI एक उपयुक्त मॉडल नहीं है.
इसके अलावा, बैक्टीरिया के इंट्रापल्मोनरी या अंतःशिरा वितरण की तुलना में, एवओलो-कैपिलरी बाधा के विघटन को हल्के3के रूप में वर्णित किया गया था, इस मॉडल की उपयुक्तता पर सवाल उठाते हुए और क्या परिवर्तित पारगम्यता होनी चाहिए विशेष रूप से जांच की. कम श्वसन पथ में द्विपक्षीय रूप से एलपीएस देने के लिए कैथेटर का सही स्थान दृष्टिकोण का महत्वपूर्ण कदम है। उचित इंट्राट्रेकल इंटूबेशन सुनिश्चित करने के लिए, लार्वा के दृश्य और पहचान को बाहरी ठंडे प्रकाश स्रोत द्वारा सुविधाप्रदान की जाती है। श्वसन पैटर्न में परिवर्तन (जैसे, खाँसी या गैसिंग) तरल पदार्थ के सही इंट्राट्रेकल डालने की पुष्टि करते हैं।
इसके अलावा, माउस तनाव और एलपीएस के चुनाव ALI और इस मॉडल में reproduible परिणामके उत्पादन के शामिल होने के लिए महत्वपूर्ण हैं और वैज्ञानिक मुद्दे पर ध्यान दिया पर निर्भर करते हैं. साहित्य के अनुसार, खुराक बढ़ते खुराकों के साथ आगे बढ़ने के साथ एक अधिकतम प्रभाव को प्राप्त करने के लिए प्रशासित 10 डिग्री ग्राम/माउस से पर्वतमाला (जब Peudomonas aeruginosa एफ-डी प्रकार से एलपीएस 1 महिला BALB/c चूहों में इंजेक्ट किया जाता है) करने के लिए 50 g / इंजेक्शन ई. कोलाई (सेरोटाइप O111:B4) एलपीएस (जो भी प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था) पुरुष C57BL/6 चूहोंमें 6,9. सामान्य तौर पर, BALB/c चूहों को एलपीएस के साथ चुनौती दिए जाने पर संवेदनशील रूप से प्रतिक्रिया करनी चाहिए, जबकि C57BL/6 चूहे अधिक प्रतिरोधीप्रतीतहोते हैं 3। इस प्रकार, व्यक्तिगत स्थितियों का सम्मान प्रारंभिक खुराक अनुमापन प्रयोगों की सिफारिश की जाती है। यह रक्त, बाल, और अंग नमूने के समय पर भी लागू होता है। अली की गंभीरता शरीर के तापमान और श्वसन संकट के लक्षणों के नियमित अवलोकन द्वारा चिकित्सकीय रूप से निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, के बाद से चूहों केवल मनुष्यों के साथ TLR4 रिसेप्टर के लगभग 50% homology का हिस्सा है, परिणामों की सावधान व्याख्या अनिवार्यहै 3.
यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण के लिए विकल्प फेफड़ों के लिए endotoxin प्रशासन के मार्ग शामिल हैं. के रूप में Szarka एट अल द्वारा वर्णित, LPS भी intranasal instillation9के माध्यम से प्रशासित किया जा सकता है. लियू एट अल. ने प्रत्यक्ष इंट्राट्रेकल निक्षेप की तुलना एयरोसोलाइज्ड एलपीएस5के इनहेलेशन से की। उनके निष्कर्षों के आधार पर, उन्होंने निष्कर्ष निकाला कि साँस लेना मार्ग एक अधिक समान प्रकार के अली को प्रेरित करता है। हालांकि, उनके प्रयोगों एक निर्देशित प्रवाह नाक केवल साँस लेना के साथ चूहों में प्रदर्शन किया गया और इसलिए जरूरी नहीं कि यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण को स्थानांतरित किया जा सकता है. इसके विपरीत, चूहों अक्सर एक कक्ष10में एयरोसोलाइज्ड एलपीएस के संपर्क में हैं. चैंबर आकार, एलपीएस एकाग्रता, और चूहों की संख्या एक साथ इलाज चर है कि विभिन्न अध्ययनों के बीच तुलनीयता सीमा और एक व्यक्तिगत मॉडल स्थापना recommendable बना रहे हैं. पिछले, अंतःशिरा या LPS के इंट्रापर्टोनल प्रशासन अक्सर दूरदराज के ALI प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है17,18. के रूप में Szarka एट अल से डेटा का सुझाव है, intratracheal instillation i.v. या i.p. मार्ग से बेहतर लगता है जब विशिष्ट फुफ्फुसीय भड़काऊ प्रभाव को संबोधित किया जा रहा है9. अंत में, प्रोटोकॉल विशिष्ट इम्यूनोलॉजिकल मुद्दों को संबोधित करने के लिए चूहों में बाँझ ALI प्रेरित करने के लिए एक सरल और reproduible दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए जन क्लेनर और सुसान Schulz शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. लेखकों बॉन विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय में प्रवाह cytometry कोर सुविधा के उत्कृष्ट समर्थन स्वीकार करते हैं. लेखकों को किसी भी बाहरी संगठन से कोई धन प्राप्त नहीं हुआ. परिणाम अनुभाग में दिए गए और चित्र 3 में दर्शाए गए आंकड़ों का एक भाग पहले ही पिछले प्रकाशन8में दिखाया जा चुका है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
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