Summary
Burada sunulan bir adım-adım prosedür doğrudan intratrakeal lipopolisakkarid instilasyon tarafından fareler akut akciğer hasarı neden ve kan örnekleri, Bronkoalveoler Lavaj sıvısı ve akciğer dokusu FACS analizi gerçekleştirmek için. Minimal invasiveness, basit kullanım, iyi reproducibility, ve hastalık şiddeti titrasyon bu yaklaşımın avantajlarıdır.
Abstract
Lipopolisakkarid (LPS) Airway yönetimi küçük hayvan modellerinde pulmoner inflamasyon ve akut akciğer hasarı (alı) incelemek için yaygın bir yoldur. Aerosolize LPS inhalasyonu ve burun ya da intratrakeal instilasyon gibi çeşitli yaklaşımlar tanımlanmıştır. Sunulan protokol, doğrudan intratrakeal LPS instıtasyon tarafından farelerde alı 'yi teşvik etmek ve kan örnekleri, Bronkoalveoler Lavaj (bal) sıvısı ve akciğer dokusu FACS analizi gerçekleştirmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür açıklanmaktadır. İntraperitoneal sedasyon sonrasında trakea maruz kalır ve LPS 22 G venöz kateter üzerinden uygulanır. Lökosit invazyonu ile sağlam ve tekrarlanabilir bir inflamatuar reaksiyon, proenflamatuar sitokinlerin updüzenleme ve alveolo-kapiller bariyerinin bozulması, kullanılan LPS dozaja bağlı olarak saatlerce gün içinde indüklenir. Kan numunelerinin toplanması, BAL sıvısı, ve akciğer hasat, hem de FACS analizi için işleme, protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Steril LPS kullanımı bulaşıcı hastalıklarda farmakolojik müdahaleleri incelemek için uygun olmasa da, açıklanan yaklaşım, mekanik immünolojik sorulara cevap vermek için minimal invasiveness, basit kullanım ve iyi yeniden Üretilebilirlik sunar. Ayrıca, doz titrasyonu yanı sıra alternatif LPS preparatları veya fare suşları kullanımı klinik etkilerinin modülasyon izin, hangi ALI şiddeti farklı derecelerde gösterebilir veya erken vs hastalık belirtileri geç başlangıcı.
Introduction
Deneysel hayvan modelleri temel bağışıklık araştırmalarında vazgeçilmez. Tüm bakterilerin veya mikrobiyal bileşenlerin yönetilmesi, yerel veya sistemik inflamasyona yol açan küçük hayvan modellerinde sıklıkla kullanılmıştır1. Lipopolysaccharide (LPS veya bakteriyel endotoksin) bir hücre duvar bileşeni ve gram-negatif bakterilerin yüzey antijeni (örn., Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., veya Legionella spp.). Termostabil ve büyük molekül (Moleküler Ağırlık 1-4 x 106 kDa) bir lipid kısım (lipid a), çekirdek bölge (oligosaccharide) ve bir o polisakkarit (veya o antijen) oluşur. Lipid A, hidrofobik yağ asidi zincirleri ile, molekül bir bakteriyel membran ve arabulucuları (bakterilerin bozulması üzerine) immünolojik aktivite ve LPS toksisitesi ile çapa. LPS bağlama proteini (LBP), LPS: LBP kompleksleri, birçok hücre türlerinin yüzeyinde bulunan CD14/TLR4/MD2 reseptör kompleksine bağlanarak, NF-κB nükleer translokasyon ve sonraki upregülasyonu ile güçlü bir proinflamatuar reaksiyon inducing sitokin ifadesi2.
Akut akciğer hasarı (ALI) kalp yetmezliği yokluğunda bilateral pulmoner ödem ile akut hipoxemik solunum yetmezliği olarak tanımlanır3. LPS Airway yönetimi pulmoner inflamasyon ve alı4,5,6,7teşvik etmek için yaygın bir yoldur. Steril madde bulaşıcı hastalıklarda farmakolojik müdahaleler çalışmak için uygun olmasa da, mekanik immünolojik sorular yeterli hassasiyetle cevaplanabilir. LPS 'in trakeanın içine ınbrilasyonu, lökosit invazyonu ile sağlam bir enflamatuar reaksiyon, proinflamatuar sitokinlerin updüzenleme, ve alveolo-kapiller bariyerinin saatler içinde gün içinde bozulması, LPS dozajı3' e bağlı olarak, 6,7.
Sunulan protokol, intratrakeal LPS instıtasyon tarafından farelerde alı 'yi teşvik etmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür açıklar. Model, sitokin ifadesi, nötrofil granülosit invazyonu ve intra alveoler albümin kaçağı olarak önceden açıklandığı gibi değerlendirilerek doğrulandı8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu hayvan protokolü, yerel hayvan bakımı Komitesi (LANUV, Recklinghausen, Almanya; protokol No. 84-02.04.2015) tarafından onaylandı ve canlı hayvanların kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak gerçekleştirildi (NıH yayını No. 85-23, revize 1996).
1. ALI indüksiyon
- Yaklaşık 10-12 hafta yaşlarda yetişkin C57BL/6 fareler kullanın. Su ve standart kemirgen Chow ücretsiz erişim ile bireysel havalandırılmış kafeslerde hayvanları ev. Ancak, bu yaklaşım genç hayvanlar ve diğer fareler suşları ile gerçekleştirmek mümkündür.
- Depo LPS (Escherichia coli O111: B4)-20 °c ' de 5 mg/ml konsantrasyonlarda plakaya içinde. İntratrakeal instilasyon için, steril fosfat-tampon tuz (PBS) 2.000 μg/ml son konsantrasyonda seyreltildi LPS.
- Fareyi tartın. Ketamin enjekte [120 mg/kg fare vücut ağırlığı (BW)] ve xylazine (16 mg/kg BW) intraperitoneal (alt üçte biri karın, paramedian), ve anestezi başlangıcına kadar bekleyin.
- Bir dokunsal Stimulus inducing tarafından anestezi derinliği kontrol edin. Yetersiz anestezi durumunda, ketamin (30 mg/kg BW) ve xylazine (4 mg/kg BW) ile enjeksiyonu tekrarlayın.
- 37 °C ' lik vücut sıcaklığını korumak için fareyi sıcaklık kontrollü bir masaya meyilli pozisyona yerleştirin.
- Anestezi altında korneaların kurutulur önlemek için steril oftalmik yağlayıcı uygulayın.
- Baş ve kanca Kesici taşları masanın yaklaşık 5 cm yukarısında yer alan yatay bir çubuk üzerine çıkarın ve önler masaya yakın temas halinde kalır. Tablo (Şekil 1) göreli olarak 90 ° ' lik bir açı ile boynunun süper uzatın. Daha kolay entübasyon koşulları için boğaz düzeltmek için forseps ile dilini tutun.
- 22 ölçer (G) venöz kateteri 20 mm uzunluğa keser. kateteri dilin kökü boyunca dikey yönde hafifçe takın. Ses akorları görselleştirmek ve trakea amacı yardımcı olmak için larinks üzerinde cilde soğuk ışık kaynağı yerleştirin. Larinks direnci oluşursa, tekrar ilerleymeden önce kateter birkaç milimetre geri çekin.
- Kateteri yaklaşık 10 mm trakeaya takın. Bu doğru veya sol ana bronş içine sıvı tek taraflı instilasyon neden olacak gibi ekleme çok derin olmadığından emin olun.
- PBS 'de pipet kullanılarak seyreltilmiş LPS (5 μg/g BW) enjekte edilir [enjekte hacmi fare vücut ağırlığına bağlıdır (örn., 20 g vücut ağırlığı → kullanım 50 μL LPS çözeltisi)].
Not: fare genellikle öksürük veya trakea içine sıvı doğru instilasyon için nefes nefese ile yanıt verecektir. - Bir şırınga bağlayın ve tam sıvı hacminin akciğerlerde dağıtıldığından emin olmak için 50 mL hava bolus ekleyin. Kateteri yavaşça çıkarın.
- Trakea 'dan sıvının sızıntısını önlemek için farenin üst gövdesini 30 s için dik konumda tutun.
- Sham tarafından işletilen hayvanların, 50 μL steril PBS intratracheally yerine LPS enjekte.
- Buprenorfik hidroklorür enjekte 0,08 mg/kg BW hemen altında gevşek cilt içine subkutan sel indüksiyon ve her 12 saat sonra, ilk 48 h sırasında.
- Fare ısınma yastığı üzerinde tutarak tam farkındalığa kavuşana kadar 37 °C ' lik bir vücut sıcaklığını koruyun.
- Fareyi, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile ayrı olarak havalandırılan bir kafeye aktarın. Fareyi düzenli olarak izleyin. Azalan vücut sıcaklığı ve solunum depresyonu ALI 'nin doğru indüksiyonu gösterir.
2. kan örnekleme, Bronkoalveoler Lavaj, organ hasat
Not: ötenizasyonun zamanlaması, ele alınan bilimsel soruna bağlıdır. Genellikle, LPS instıtasyon3,4,9,10aşağıdaki 12-72 h gerçekleştirilir. ALI 'nin şiddeti, vücut sıcaklığının ve solunum sıkıntısı semptomlarının düzenli olarak gözlemlenmesi ile klinik olarak tespit edilebilir11.
- Isoflurane ile sular altında bir odaya fareyi yerleştirerek anestezi neden. 1 L/dak oksijen debisi ile 3 vol% Isoflurane kullanın. bir dokunsal Stimulus inducing derin narkoz emin olun. Yetersiz anestezi derinliği durumunda,% 5 ' e kadar Isoflurane artırın.
- Atlanto-oksipital dislocation tarafından derin anestezi fare fedakarlık.
- Bir operasyon masasında bantla fareyi düzeltin ve% 70 etanol ile karın üzerindeki kürkü kısa sürede dezenfekte edin. Karın boşluğunu, makas ve cımbız ile Median satırda dikkatlice açın. Omuroz alt ve abdominal aorta doğru Vena Cava inferior (ıVC) erişim elde etmek için bağırsak parçalarını çıkarın.
- Böbrek damarlarını bulun ve 1 mL şırıngaya bağlı bir bükülmüş 23 G canulun doğrudan damarların konfluence altında ıVC içine takın. Aspirate 250 μL kan ve transfer bir 1,5 mL tüp ile dolu 20 μL ile 0,5 M etylenediaminetetraasetic asit (EDTA) solüsyonu. EDTA karıştırma kolaylaştırmak ve buz tüp koymak yavaşça sallayın.
- Bronkoalveoler Lavaj (BAL) için, 0,5 ml steril PBS ve 0,1 mL hava ile üç adet 1 mL şırıngalar hazırlayın. Kısa sürede% 70 etanol ile boğazın kürk dezenfekte ve dikkatle makas ve cımbız ile trakea maruz. Trakeası harekete geçirin ve bir sütür etrafında sarın.
- BAL gerçekleştirin: mikro-makas kullanarak trakea delinmesi ve 20 mm uzunluğunda bir 22 G venöz kateter kesme takın. kateter ile sütür ve instillate 0,5 mL steril PBS ve 0,1 mL hava ile düzeltin. 60 s sonra sıvı Aspire. ek iki şırıngalar ile prosedürü tekrarlayın ve buz üzerinde 15 ml tüp tüm aspirat toplamak.
- Dikkatle akciğer hasat için makas ve cımbız ile toraks açın. Diyaframı, kostal marjı boyunca kesip iki lateral kesiyle kaburgalar arasında keser. Dikkatle akciğerleri delme kaçının. Sternum ' ı kransal olarak kaldırın ve düzeltin veya çıkarın.
- 2 10 mL şırıngalar 37 °C sıcak PBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) hazırlayın. Sol ventrikül içine küçük bir kesi olun. 26 G kanula ile sağ ventrikül delinmesi ve prewarmed PBS ile pulmoner dolaşım Flush. Prosedür sırasında soluk dönen akciğerlerin farkında olun.
- Akciğerlerin sağ lob çıkarın ve iki yarıya kesip. Daha fazla gen ifadesi ve protein analizi için uzun süreli depolama-80 °C ' ye kadar sıvı nitrojende onları çırpıda dondurur.
- Tüm Sol akciğer çıkarın ve makas ve cımbız ile doku kıyma tarafından bir 48 iyi plaka homojenize. Dokusunu 2 ml sindirim tamponunda [RPMI 1640% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 0,1% Nan3, kolajenaz ı (1 mg/ml) ve DNase II (7 mg/ml)], 37 °c ' de 60 dk. daha fazla Homojenleştirme ile akciğer dokusu parçalarını dikkatli bir şekilde pipetleme ile gerçekleştirin ve Aşağı.
3. FACS analizi için doku hazırlığı
- Taze FACS tamponu hazırlayın (Tablo 1): her zaman katır bağımlı hücre-hücre yapışmasını azaltmak ve küme önlemek için kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS kullanın. FCS ile ek (1%) hücre apoptosis korumak için, non-spesifik boyama önlemek ve hücreleri FACS tüpler yapışmasını önlemek. Makrofajlar gibi yapışkan ve yapışkan hücrelerle çalışırken, akma tabanlı hücre-hücre yapışmasını önlemek için EDTA (0,5 mM) içerir. Sodyum azid ekleyin (% 0,1), bakteriyel kontaminasyon ve florokromlarla ve bloklar antikor dökülme fotobleaching önler.
- Kan örneklerini (adım 2,4) 5 mL FACS tüplerine aktarın ve kanı 2 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponunu hafifçe karıştırın. Buz üzerinde tüpler koymak ve 2 dk buz-soğuk PBS ekleyerek iki dakika sonra reaksiyonu sonlandırmak. 400 x g 'de 5 dk için numuneleri santrifüjün ve supernatant atın. Daha önce açıklanan protokoller12' ye göre sonraki FACS boyama için 60 μL FACS tampon ve proses ile hücre Pelet resuspend.
Not: fare ötenizasyon zamanlaması sistemik inflamasyonun bir parçası olarak lökosit sayısını etkiler. Bu nedenle, akış sitometri analizi için en iyi boyama sonuçlarını elde etmek için bu adımda hücre numarasını 1 x 106 hücreli/60 μL olarak ayarlamanız önerilir. - Santrifüj BAL sıvı (adım 2,6) için 5 dk 400 x g. Süpernatant aspirate ve sıvı nitrojen içinde dondurmak, uzun süreli depolama sonra-80 °c daha fazla protein analizi için. 2 ml soğuk FACS tampon ile resuspend bal hücre Pelet, daha sonra 5 ml FACS tüp içine bir 100 μm Mesh filtre kılları yeniden uygulamak için süspansiyon transfer.
- Yine, numune Santrifüjü 5 dk 400 x g. Daha önce açıklanan protokoller12' ye göre sonraki FACS boyama için 60 μL FACS tampon ve proses ile Pelet resuspend.
Not: fareye ait ötenizasyon zamanlaması, inflamasyonun bir parçası olarak BAL 'da lökosit sayısını etkiler. Bu nedenle, akış sitometri analizi için en iyi boyama sonuçlarını elde etmek için bu adımda hücre numarasını 1 x 106 hücreli/60 μL olarak ayarlamanız önerilir. - Ekleme sindirilmiş Sol akciğer dokusu (adım 2,10) bir 5 mL FACS tüp içine bir 100 μL Mesh filtre kullanarak kümeleri ayıklamak ve sindirim sürecini sonlandırmak için ekleyerek 2 mL buz-soğuk FACS tampon. Numuneyi 5 dakika 400 x g 'de santrifüjün. Süpernatant atın ve daha önce açıklanan protokoller göre sonraki FACS boyama için 60 μL FACS tampon ve süreç ile Pelet pelletini12.
Not: Farenizin ötenizasyonunun zamanlaması, inflamasyonun bir parçası olarak akciğer dokusunda lökosit sayısını etkiler. Bu nedenle, akış sitometri analizi için en iyi boyama sonuçlarını elde etmek için hücre numarasını 1 x 106 hücreli/60 μL olarak ayarlamanız önerilir. - FACS analizi için, CD16/CD32 antikor ile hücreleri 4 °C ' de 15 dakika boyunca, immünoglobulinin FC reseptörlerine spesifik olmayan bağlayıcılığı engellemek için inkük et. 5 mL 'Lik bir tüpte 60 μL 'de 1 x 106 hücreye 20 μl engelleme çözümü ekleyin.
- Bu arada, Tablo 2' de açıklandığı gibi FACS tampon ve antikorlar ile bir Master Mix hazırlayın.
- Engelleme işleminden sonra hücreleri yıkayınız. 100 en son hacmi elde etmek için numune başına 20 μL antikor ana karışımı ekleyin. örnekleri 4 °C ' de karanlıkta 20 dakika boyunca Kulyattır.
- Her numuneyi 1 mL FACS tampon ile yıkayın ve 400 x g'de 5 dakika santrifüjün. Süpernatant atın ve FACS ölçümleri için uygun hücre konsantrasyonu için FACS tampon ile Pelet pelletini.
Not: Bu protokol ile FACS analizinde en iyi bağışıklık fenotipleme sonuçlarını elde etmek için 1 x 106 hücreli/500 μL hücre sayısı önerilir. Ancak, antikorların bireysel titoy olması önerilir. - Gerekirse, ticari olarak mevcut özel kitleri kullanarak yüzey boyama öncesinde canlı/ölü boyama ekleyin8.
- Son olarak, mutlak hücre numaraları12belirlemek için her örnek için ticari olarak kullanılabilen fluorokrom bağlantılı kalibrasyon boncuk (3 x 105 boncuk 20 μl FACS tampon) sabit sayıda ekleyin. Kan, BAL ve doku hücreleri için gating stratejisi Şekil 2' de gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farelerde ALI 'yi teşvik etmek için açıklanan yaklaşım, sitokin ifadesi, nötrofil granülosit infiltrasyonu, ve alveolo-kapiller bariyer bozulması 24 h ve 72 h sonra LPS instıtasyon değerlendirilerek doğrulandı. PBS enjekte hayvanlar kontrol olarak görev yaptı. İntratracheal LPS yönetimi sağlam bir pulmoner proinflamatuar tepkiye sebep oldu. Akciğer dokusunda TNF-α ifadesi, kontrol hayvanları [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD = 20,6); p < 0,05)] (Şekil 3a) ile karşılaştırıldığında, sürdürülebilir ve 50 ' den fazla kat artışa ulaşan önemli ölçüde yükselmiştir. Lökosit, doku ve alveoler uzayda invazyonu, ALI13' ün gelişimi için bir damgasını ve karakteristik bir özelliktir. FACS analizi, nötrofil granülositlerinin (NG) akciğer interstisyumunda önemli bir infiltrasyonu ortaya çıkardı, mutlak hücre sayımı 24 saat sonra kontrollere kıyasla neredeyse 9 kat arttı [65.243 (SD = 15.855) vs. 7.358 (SD = 4.794), p < 0,05] ( Şekil 3B). Mutlak NG Count 72 h sonra biraz azaldı; Ancak, kontrollere kıyasla faktör artar kararlı kaldı [48.946 (SD = 5.223) vs. 5.510 (SD = 654), p < 0,05]. İnterstisyel NG infiltrasyonu ile tutarlı, tüm akciğer dokusunda MMP-9 ifadesi aynı şekilde toplam gözlem döneminde önemli ölçüde arttı [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (SD = 1,5); 72 h: 10,4 (SD = 2,0); p < 0,05] (Şekil 3C).
NG sadece akciğer dokusunda değil, aynı zamanda BAL sıvısında da arttı. Kontrol hayvanlarına kıyasla kat artışı akciğer dokusunda daha belirgin oldu, mutlak NG sayar ile 24 ALI indüksiyon ardından h 52.005 (SD = 21.906) vs. 1.829 (SD = 1.724) (p < 0,05) (Şekil 3D). 72 sonra h, NG 37.254 (SD = 4.478) vs. 17,0 (SD = 10,8) (p < 0,05) arttı. Alveolo-kapiller bariyerinin şiddetli bozukluğuna bağlı akciğer ödem, alı 'nin gelişimi için patognomonik olup, LPS ile endotel apoptozis hızla İndükleme ve artmış geçirgenlik14,15. BAL sıvısındaki albümin içeriğinin ELISA tarafından Analizi önemli bir bariyer fonksiyonu kaybı ortaya koydu. LPS instilasyonunu takiben 24 saat, BAL sıvısı albümin 43 ng/mL (SD = 13), kontrol koşullarında 20 ng/mL (SD = 9) ile karşılaştırıldığında (p < 0,05) (Şekil 3E). 72 h sonra, alı hayvanlarda, albümin içeriği 48 ng/ml (SD = 14), 29 ng/ml (SD = 9) (p < 0,05) ile karşılaştırıldığında oldu.
Şekil 1 : Entübasyon ayarının şematik şeması. Bu fare boynunun işlem masasına göre 90 ° açı süper genişletilmiş olmalıdır unutulmamalıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Kan, bal ve doku hücreleri Için FACS gating stratejisi. FACS Analizi örnek nokta lekesi iki parametre (çift renk floresan) pseudocolor çizimleri gösterilir. İlgili numuneler için gating stratejisi tek hücrelere dayanır. (A) kan hücreleri için gating ağacı: bir = ölü hücreler; b = yaşayan hücreler (canlı/ölü hücre boyasına göre; kan gibi hiçbir CD45 boyama gerekli, yüksek otofloresans hücre nüfus açıkça ayırt yapar); d = Nötrofil granülositler; e = monosit (GR1 ve CD115 boyama göre). (B) bronkoalveoler LAVAJ (bal) sıvısı için gating ağacı: a = ölü hücreler; b = yaşayan hücreler (canlı/ölü hücre lekeme göre); c = CD45+ bağışıklık hücreleri; d = Nötrofil granülositler; ve e = macrofajlar (Ly6G ve F4/80 boyama göre). (C) akciğer dokusu için ağaç gating: bir = ölü hücreler; b = yaşayan hücreler (canlı/ölü hücre lekeme göre); c = CD45+ bağışıklık hücreleri; d = Nötrofil granülositler; ve e = macrofajlar (Ly6G ve F4/80 boyama göre). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Kontrol hayvanlarına karşı murine alı modelinin doğrulanması. (A) kadın C57BL/6 farelerin akciğer dokusunda TNF-α ifadesi 24 saat ve 72 h intratrakeal LPS instıtasyon aşağıdaki (Sham çalışan hayvanların ifade kat değişikliği). (B) akciğer dokusunda mutlak nötrofil granülosit sayısının FACS analizi. (C) akciğer dokusunda MMP-9 ifadesi (Sham tarafından işletilen hayvanların ifadesinin kat değişimi). (D) Bronkoalveoler Lavaj sıvısında mutlak nötrofil granülosit sayımı FACS analizi. (E) BAL sıvısındaki albumin içeriği [Mean ± SD, n = 7, Mann-Whitney U testi, * p < 0,05 (PBS kontrolü ile)]. Bu rakam Ehrentraut ve al.8' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Malzeme adı/ekipman | Hacim (mL) |
| Dulbecco fosfat tamponlu tuz (PBS), kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan, steril | 1000 |
| Fetal buzağı serumu (FCS) | 1 |
| Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözümü | 1 |
| Sodyum azid (NaN3) | 0,1 |
Tablo 1: FACS arabelleğinin bileşimi.
| Malzeme adı/ekipman | Önerilen seyreltme | Mastermix 10 örnekleri için: 200 μL FACS tampon ekleyin (= 20 μl örnek başına): |
| Anti-CD115 (c-FMS) APC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD11b (M1/70)-FITC | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-CD45 (30-F11)-eF450 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-F4/80 (BM-8)-PE Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-GR1 (RB6-8C5) | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6C (HK 1.4) PerCP-Cy 5.5 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 μL/100 μL | 5 μL |
Tablo 2: FACS boyama için ana karışımı hazırlanması. Tablo, 10 numune için ana karışım hazırlığını açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimal invasiveness, basit elleçleme ve iyi yeniden Üretilebilirlik, küçük bir kemirgen modelde ALI 'yi teşvik etmek için sunulan yaklaşımın temel özellikleridir. Hayvan modellerinde tüm bakterilerin yerine LPS kullanımı avantajları vardır. İstikrarlı ve saf bir bileşiktir ve kullanımına kadar liyofilize formda depolanabilir. Bu TLR4 yolu ile doğuştan gelen immün tepkiler için güçlü bir uyarıcı olduğunu, ve biyolojik aktivite kolayca nicelik olabilir, iyi reproducibility ile hastalığın şiddetinin titrasyon kolaylaştırılması. Dahası, LPS kullanımı insan Sağlıklı gönüllülerde akut bronşit ikna etmek için güvenli model olarak hizmet göstermiştir ve böylece tezgah başı16' ya tercüme sağlar. Rittirsch ve ark. intratrakeal LPS instıtasyon6bir duvar modelinde karakteristik alveolo-kapiller sızıntı doz ve zaman bağımlı gelişmeler göstermiştir. Bu doz titrasyon bazı istenen etkileri elde etmek için izin verir, hangi ALI şiddeti farklı derecelerde gösterebilir veya erken vs hastalık belirtileri geç başlangıcı. Ancak, ayrı olarak enfeksiyyolojik veya farmakolojik sorunlar ele alınırsa (örneğin, antibiyotik terapisi), steril LPS instıtasyon ile indüklenen ALI uygun bir model değildir.
Dahası, bakterilerin intrapulmoner veya intravenöz teslimine kıyasla alveolo-kapiller bariyerinin bozulması oldukça hafif3olarak tanımlanmıştır, bu modelin uygunluğunun sorgulanması ve değiştirilmiş geçirgenlik olması gerekip gerekmediğini Özellikle incelenmiştir. Kateterin doğru yerleştirilmesi, LPS 'i alt solunum yolu içine tek taraflı olarak teslim etmek, yaklaşımın kritik adımıdır. Uygun intratrakeal entübasyonu sağlamak için, larinks görselleştirme ve tanımlanması dış soğuk ışık kaynağı tarafından kolaylaştırılır. Solunum düzeninde değişiklikler (örneğin, öksürük veya gasping) sıvının doğru intratrakeal instilasyonunu doğrulayın.
Dahası, fare gerinim ve LPS seçimi alı indüksiyon ve bu modelde tekrarlanabilir sonuçlar nesil için çok önemlidir ve ele bilimsel soruna bağlıdır. Literatürde göre, Dozajlar tırmanarak daha fazla artış ile maksimum etkisi için uygulanan doz 10 μg/fare ( Pseudomonas aeruginosa F-D tip 1 dan LPS KADıN Balb/c fareler içine enjekte edilir) aralıkları ile 50 μg/Mouse E. coli enjekte (serotype O111: B4) LPS (aynı zamanda protokolde kullanılan) erkek C57BL/6 fareler6,9içine. Genel olarak, BALB/c fareler C57BL/6 fareler daha dayanıklı gibi görünse de, LPS ile meydan okunurken hassasiyetle tepki gerekiyordu3. Böylece, bireysel koşullara saygı ilk doz titrasyon denemeleri önerilir. Bu da kan, BAL ve organ örnekleme zamanlaması için de geçerlidir. ALI 'nin şiddeti, vücut sıcaklığının ve solunum sıkıntısı semptomlarının düzenli olarak gözlemlenmesi ile klinik olarak tespit edilebilir. Ayrıca, fareler sadece paylaşmak yaklaşık 50% Homoloji TLR4 reseptör insanlarla, sonuçların dikkatli yorumu zorunludur3.
Burada sunulan yaklaşımın alternatifleri, endostoksinin akciğerlere uygulanması rotasını oluşturmaktadır. Szarka ve ark. tarafından açıklandığı gibi, LPS de intranazal instıtasyon ile uygulanabilir9. Liu ve ark. doğrudan intratrakeal verimini aerosolize LPS5' in inhalasyonu ile karşılaştırıldı. Bulgularına dayanarak, inhalasyon rotasının daha üniforma bir ALI türü olduğunu ortaya atmışlardır. Ancak, deneyler bir yönlendirilmiş akış burun-sadece inhalasyon ile fareler içinde gerçekleştirilen ve bu nedenle mutlaka burada sunulan yaklaşımı transfer edilmeyebilir. Buna karşılık, fareler genellikle bir oda10aerosolize LPS maruz kalır. Oda büyüklüğü, LPS konsantrasyonu ve aynı anda tedavi edilen fareler sayısı, farklı çalışmalar arasındaki karşılaştırılabilirliği sınırlayan ve bireysel bir model kurulması tavsiye edilebilir değişkenlerdir. Son olarak, intravenöz veya intraperitoneal LPS yönetimi genellikle uzak alı17,18teşvik etmek için kullanılır. Szarka ve el ile gelen veriler olarak, intratrakeal instilasyon belirli pulmoner enflamatuar etkileri9ele alınmakta olan IV veya ı.l rota üstün gibi görünüyor. Sonuç olarak, protokol, belirli immünolojik sorunları gidermek için fareler içinde steril ALI 'yi teşvik etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar teknik destek sağlamak için Jan Kleiner ve Susanne Schulz teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Bonn Üniversitesi Tıp Fakültesi akış sitometri çekirdek tesis mükemmel destek kabul. Yazarlar herhangi bir dış kuruluştan hiçbir fon aldı. Sonuçlar bölümünde verilen ve Şekil 3 ' te tasvir edilen verilerin bir kısmı zaten önceki yayında8' de gösterildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
