Summary
Представлено здесь пошаговая процедура, чтобы вызвать острую травму легких у мышей путем прямого внутричехального липополисахарида закапывания и для выполнения FACS анализ образцов крови, бронхоальвеолярной жидкости для вавания, и легочной ткани. Минимальная инвазивность, простая обработка, хорошая воспроизводимость, и титрование тяжести заболевания являются преимуществами этого подхода.
Abstract
Администрация дыхательных путей липополисахарида (LPS) является распространенным способом изучения воспаления легких и острой травмы легких (ALI) в малых моделей животных. Были описаны различные подходы, такие как вдыхание аэрозольных ЛПС, а также носовое или внутримагистральное заволакивание. Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем прямого внутрипеченого зависания ЛПС и выполнения анализа FACS образцов крови, бронхоальвеолярной провай (BAL) жидкости и легочной ткани. После интраперитонеальной седации трахея подвергается воздействию и LPS вводится через 22 G венозного катетера. Надежная и воспроизводимая воспалительная реакция с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера индуцируется в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозы LPS используется. Сбор образцов крови, BAL жидкости, и вырубка легких, а также обработки для анализа FACS, подробно описаны в протоколе. Хотя использование стерильных LPS не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, описанный подход предлагает минимальную инвазивность, простое обращение и хорошую воспроизводимость для ответа на механистические иммунологические вопросы. Кроме того, доза титрации, а также использование альтернативных препаратов LPS или мыши штаммов позволяют модуляции клинических эффектов, которые могут проявлять различные степени али тяжести или раннего против позднего начала симптомов заболевания.
Introduction
Экспериментальные модели животных незаменимы в фундаментальных иммунных исследованиях. Администрация целых бактерий или микробных компонентов часто используется в небольшихмоделях животных, чтобы вызвать местное или системное воспаление 1. Липополисахарид (LPS, или бактериальный эндотоксин) является компонентом стенки клетки и поверхностным антигеном грамотрицательных бактерий (например, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., или Legionella spp.). Термостабильная и большая молекула (молекулярный вес 1-4 х 106 кДА) состоит из липидного муати (Липид A), основной области (олигосахарид) и ополисахарида (или O антигена). Липид А, с его гидрофобными цепями жирных кислот, закрепляет молекулу в бактериальной мембране и опосредует (после деградации бактерий) иммунологическую активность и токсичность ЛПС. После связывания с связывающим белком LPS (LBP), комплексы LPS:LBP сводят сягирование рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2, расположенного на поверхности многих типов клеток, вызывая сильную провоспалительную реакцию с ядерной транслокацией NF-QB и последующее регулирование цитокинов выражение2.
Острая травма легких (АЛИ) определяется как острая гипоксемическая дыхательная недостаточность с двусторонним отеком легких при отсутствии сердечной недостаточности3. Администрация дыхательных путей LPS является распространенным способом вызвать воспаление легких и ALI4,5,6,7. Хотя стерильное вещество не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, на механистические иммунологические вопросы можно ответить с достаточной точностью. Привитие ЛПС в трахею вызывает надежную воспалительную реакцию с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозировки LPS3, 6,7.
Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем внутричехального зависания ЛПС. Модель была подтверждена путем оценки экспрессии цитокинов, нейтрофилов гранулоцитов вторжения, и внутриальвеолярной утечки альбумин, как ранее описано8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол о животных был одобрен местным комитетом по уходу за животными (LANUV, Recklinghausen, Германия; протокол No 84-02.04.2015) и выполнен в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по использованию живых животных (публикация NIH No 85-23, пересмотренный 1996 год).
1. Введение АЛИ
- Используйте взрослых мышей C57BL/6 в возрасте около 10-12 недель. Дом животных в индивидуально проветриваемых клетках с бесплатным доступом к воде и стандартным грызунов чау. Тем не менее, можно выполнить этот подход на молодых животных и с другими штаммами мышей.
- Храните LPS (Escherichia coli O111:B4) в аликвотах в концентрациях 5 мг/мл при -20 градусах По цельсии. При внутриклеетном завислении разбавляют ЛПС в стерильном фосфатно-буферном солей (PBS) до конечной концентрации в 2000 мкг/мл.
- Взвесьте мышь. Вводят кетамин (120 мг/кг мыши для тела (BW) и ксилазин (16 мг/кг BW) интраперитонеально (нижняя треть живота, парамедиа) и подождите до начала анестезии.
- Проверьте глубину анестезии, вызывая тактильный стимул. При недостаточной анестезии повторите инъекцию кетамина (30 мг/кг ввт) и ксилазина (4 мг/кг ВВ).
- Поместите мышь в лежачем положении на контролируемом температурой столе для поддержания температуры тела 37 градусов по Цельсию.
- Нанесите стерильную офтальмологическую смазку для предотвращения высыхания роговицы под наркозом.
- Поднимите резцы головы и крючка на горизонтальной штанге, расположенной примерно на 5 см над столом, в то время как передние лапы остаются в тесном контакте со столом. Супер-продлить шею в 90 "угол по отношению к таблице (Рисунок 1). Держите язык с щипками, чтобы выпрямить горло для облегчения условий интубации.
- Вырежьте 22-калиберный (G) венозный катетер длиной 20 мм. Аккуратно вставьте катетер в вертикальном направлении вдоль корня языка. Поместите источник холодного света на кожу над гортани, чтобы помочь визуализировать голосовые связки и стремиться к трахееи. Если сопротивление гортани происходит, убирать катетер несколько миллиметров, прежде чем продвигаться снова.
- Вставьте катетер примерно 10 мм в трахею. Убедитесь, что вставка не слишком глубока, так как это приведет к одностороннему затаханию жидкости в правый или левый основной бронх.
- Инъекционные LPS (5 г/г BW), разбавленные в PBS с помощью пипетки «вводимый объем зависит от массы тела мыши (например, 20 г массы тела, используйте 50 л раствора LPS)».
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь, как правило, реагировать с кашлем или задыхаясь на надлежащее задыхание жидкости в трахею. - Подключите шприц и добавьте болюс 50 мл воздуха, чтобы гарантировать, что полный объем жидкости распределяется в легких. Медленно удалите катетер.
- Держите верхнюю часть тела мыши в вертикальном положении в течение 30 с, чтобы избежать утечки жидкости из трахеи.
- У фиктивных животных, вводят 50 л стерильных PBS внутритрачеально вместо LPS.
- Вводят бупренорфин гидрохлорид 0,08 мг/кг BW подкожно в свободную кожу над шеей сразу после индукции ALI и каждые 12 ч после этого, в течение первых 48 ч.
- Поддерживайте температуру тела в 37 градусов по Цельсию до тех пор, пока полное осознание не будет восстановлено, удерживая мышь на согревающей площадке.
- Перенесите мышь в индивидуально проветриваемую клетку с бесплатным доступом к пище и воде. Регулярно следите за мышью. Снижение температуры тела и угнетение дыхания указывает на надлежащую индукцию ALI.
2. Отбор проб крови, бронхоальвеолярный лаваж, сбор органов
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки эвтаназии зависит от рассматриваемого научного вопроса. Обычно, он выполняется 12-72 ч послезависания LPS 3,4,9,10. Тяжесть АЛИ может быть определена клинически путем регулярного наблюдения температуры тела и респираторных симптомов дистресс11.
- Вызвать анестезию, поместив мышь в камеру, затопленную изофлюраном. Используйте 3 vol% изофлуран с потоком кислорода 1 Л/мин. Обеспечить глубокий наркоз, вызывая тактильный стимул. При недостаточной глубине анестезии, увеличение изолюранидой до 5 вольт%.
- Пожертвуйте мышью в глубокой анестезии при атланто-затылком вывихе.
- Закрепите мышь лентой на оперативном столе и вскоре дезинфицируете мех на животе 70% этанола. Тщательно откройте брюшную полость в средней линии ножницами и пинцетом. Удалить части кишечника для достижения доступа к полиной вены (IVC) прямо к позвоночнику и брюшной аорты.
- Найдите вены почек и вставьте изогнутую 23 G канулу, соединенную со шприцем 1 мЛ, в IVC непосредственно под слиянием вен. Аспир 250 л крови и перекладывается в трубку 1,5 мл, наполненную 20 мл этилендиаминетететической кислоты (ЭДТА). Встряхните осторожно, чтобы облегчить EDTA смешивания и положить трубку на лед.
- Для бронхоальвеолярной лавировки (BAL) приготовьте три шприца по 1 мл с 0,5 мл стерильных PBS и 0,1 мл воздуха каждый. Вскоре дезинфицируйте мех горла 70% этанола и тщательно разоблачить трахею ножницами и пинцетом. Мобилизуй трахею и оберните вокруг шва.
- Выполните BAL: Прокол трахеи с помощью микро-ножниц и вставьте 22 G венозный катетер сократить до длины 20 мм. Исправить катетер с швом и привить 0,5 мл стерильных PBS и 0,1 мл воздуха. Аспирите жидкость после 60 с. Повторите процедуру с дополнительными двумя шприцев и соберите весь аспират в трубку 15 мл на льду.
- Тщательно откройте грудную клетку ножницами и пинцетом для сбора легких. Вырезать диафрагму вдоль дорогостоящего края и прорезать ребра с двумя боковыми разрезами. Осторожно избегайте прокалывая легкие. Поднимите грудину черепно и исправить или удалить его.
- Приготовьте два шприца по 10 мл с теплой PBS (без кальция и магния) с 37 градусов по Цельсию. Сделайте небольшой разрез в левый желудочек. Проколить правый желудочек с канулой 26 G и промыть легочную циркуляцию с предварительно разогретым PBS. Будьте в курсе легких бледнеют во время процедуры.
- Удалить правую долбу легких и разрезать его на две половинки. Заморозить их в жидком азоте, а затем долгосрочное хранение при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего экспрессии генов и анализа белка.
- Удалите все левое легкое и гомогенизировать его в 48 хорошо пластины, сжигая ткани ножницами и пинцетом. Инкубировать ткани в 2 мл пищеварительного буфера (RPMI 1640 с 10% плода теленка сыворотки (FCS) и 0,1% NaN3, коллагеназi I (1 мг/мл), и DNase II (7 мг/мл) » при 37 градусах по Цельсию в течение 60 мин. Выполните дальнейшую гомогенизацию путем тщательного пайпетирования частей легочной ткани и вверх и вверх и вверх и вверх и Вниз.
3. Подготовка тканей для анализа FACS
- Подготовка свежих FACS буфера (Таблица 1): всегда используйте кальция и магния без PBS, чтобы уменьшить катион-зависимых клеток к клетке слипания и предотвратить слипания. Дополнение с FCS (1%) для защиты клеток от апоптоза, предотвращения неспецифических окрашивания, и предотвратить клетки от прилипания к FACS труб. Включите ЭДТА (0,5 мМ) для предотвращения слипания клеток на основе катиции при работе с липкими и адептовыми клетками, такими как макрофаги. Добавить азид натрия (0,1%), так как он предотвращает бактериальное загрязнение и фотоотбеление фторхромов и блокирует пролитие антител.
- Перенесите образцы крови (шаг 2.4) в 5 мл трубки FACS и аккуратно смешайте кровь с 2 мл буфера лиза красных кровяных телец. Положите трубки на лед и прекратить реакцию после 2 мин, добавив 2 мл ледяной PBS. Centrifuge образцы в течение 5 мин на 400 х г и отбросить супернатант. Приостановите действие клеточной гранулы с 60 зл буфера FACS и процесс для последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки эвтаназии мыши влияет на количество лейкоцитов как часть системного воспаления. Поэтому, рекомендуется настроить число клеток до 1 х 106 клеток / 60 Л в этом шаге для достижения наилучших результатов окрашивания для анализа цитометрии потока. - Centrifuge BAL жидкости (шаг 2,6) в течение 5 мин при 400 х г. Призадыхать супернатант и заморозить его в жидком азоте, а затем длительного хранения при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа белка. Resuspend BAL ячеек гранулы с 2 мл холодного буфера FACS, а затем передать подвеску в 5 мл трубки FACS с помощью 100 мкм сетчатый фильтр для сдерживания волос.
- Опять же, центрифуга образца в течение 5 мин на 400 х г. Приостановите гранулы с 60 зл буфера FACS и процесс для последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки эвтаназии мыши влияет на количество лейкоцитов в BAL как часть воспаления. Поэтому, рекомендуется настроить число клеток до 1 х 106 клеток / 60 Л в этом шаге для достижения наилучших результатов окрашивания для анализа цитометрии потока. - Перенесите переваренную левую легочную ткань (шаг 2.10) в трубку 5 мл FACS с помощью фильтра сетки 100 л для извлечения комков и прекращения процесса пищеварения, добавив 2 мл ледяного буфера FACS. Центрифуги образца в течение 5 мин на 400 х г. Отбросить супернатант и resuspend гранулы с 60 зл буфера FACS и процесс для последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки эвтаназии мыши влияет на количество лейкоцитов в легочной ткани, как часть воспаления. Поэтому рекомендуется настроить число клеток до 1 х 106 клеток/60 Л для достижения наилучших результатов окрашивания для анализа цитометрии потока. - Для анализа FACS, инкубировать клетки с антителами CD16/CD32 при 4 c для 15 мин, чтобы блокировать неспецифические связывания иммуноглобулина к рецепторам FC. Добавьте 20 зл блокирующий раствор в 1 х 106 ячеек в 60 л в трубке 5 мл.
- Между тем, подготовить мастер смесь с FACS буфера и антител, как описано в таблице 2.
- После блокировки не мыть клетки. Добавьте 20 qL мастер-микса антител на образец, чтобы получить окончательный объем 100 qL. Инкубировать образцы в течение 20 минут в темноте при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте каждый образец с 1 мл буфера FACS и центрифуги в течение 5 мин при 400 хг. Отбросьте супернатант и отрептите гранулы с буфером FACS к соответствующей концентрации клеток для измерений FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток 1 х 106 клеток/500 Л предлагается для достижения наилучших результатов иммунной фенотипирования в анализе FACS с этим протоколом. Тем не менее, рекомендуется, чтобы антитела должны быть тиснены индивидуально. - При необходимости добавьте живое/мертвое окрашивание до окрашивания поверхности с использованием специальных коммерчески доступных комплектов8.
- Наконец, добавить фиксированные номера коммерчески доступных фторхромных связанных калибровочных шариков (3 х 105 бусин в 20 л буфера FACS) к каждому образцу, чтобы определить абсолютные номера клеток12. Стратегия gating для крови, BAL, и клетки ткани показана в рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный подход к индуцированию АЛИ у мышей был подтвержден путем оценки экспрессии цитокинов, инфильтрации нейтрофилов гранулоцитов и нарушения альвеоло-капиллярного барьера 24 ч и 72 ч после закапывания ЛПС. PBS-инъекционных животных служил ими. Внутриартериальный lpS администрации индуцированных надежной легочной провоспалительной реакции. Выражение ТНФ-З в легочной ткани было значительно upregulated, достигнув устойчивого и более чем 50-кратного увеличения по сравнению с контрольных животных (TNF-no/18s); 24 ч: 53,7 (SD No 11,6);72 ч: 55,0 (SD 20,6); стр. Вторгшийся в ткани и альвеолярное пространство лейкоцитов является отличительной чертой и характерной чертой для развития ALI13. Анализ FACS показал значительное проникновение нейтрофилов гранулоцитов (NG) в интерститий легких, при этом абсолютное количество клеток увеличилось почти в 9 раз по сравнению с контрольом после 24 ч 65 243 (SD 15,855) против 7,358 (SD 4,794), р.00; 0,05 . Рисунок 3B). Абсолютный отсчет NG несколько уменьшил сяпосле после 72 h; тем не менее, коэффициент увеличения по сравнению с контроля оставался стабильным (SD 5,223) против 5,510 (SD No 654), р lt; 0,05 ". В соответствии с интерстициальной инфильтрацией NG, выражение MMP-9 во всей ткани легких также значительно увеличилось в течение всего периода наблюдения (MMP-9/18s), 24 ч: 7,4 (SD No 1,5); 72 ч: 10,4 (SD No 2.0); стр. 0.05 (Рисунок 3C).
NG были увеличены не только в легочной ткани, но и в жидкости BAL. Увеличение раза по сравнению с контрольных животных был более выраженным, чем в легочной ткани, с абсолютным NG рассчитывает 24 ч после ИНДукции ALI 52,005 (SD No 21,906) против 1,829 (SD 1,724) (p q lt; 0.05)(Рисунок 3D). После 72 ч, NG были увеличены до 37,254 (SD No 4,478) против 17,0 (SD No 10,8) (p qlt; 0.05). Отек легких из-за тяжелого нарушения альвеоло-капиллярного барьера является патогномоническим для развития ALI, с LPS быстро индуцирования эндотелиального апоптоза и повышенной проницаемости14,15. Анализ содержания альбумина в жидкости BAL от ELISA показал значительную потерю барьерной функции. 24 ч после зависания LPS, альбумин в жидкости BAL был 43 нг/мл (SD No 13), по сравнению с 20 нг/мл (SD No 9) при условиях контроля (p qlt; 0.05)(рисунок 3E). После 72 ч, в АЛИ животных, содержание альбумина было 48 нг/мл (SD No 14), по сравнению с 29 нг/мл (SD No 9) (p qlt; 0.05).
Рисунок 1 : Схематическая диаграмма настройки интубации. Следует отметить, что шея мыши должна быть супер-расширенной под углом 90 градусов по отношению к оперативному столу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : стратегия FACS gating для крови, BAL, и клеток ткани. Примерные точечные пятна анализа FACS показаны в двухпараметрах (двойной цвет флуоресценции) псевдоцветных участках. Стратегия Gating для соответствующих образцов основана на одиночных ячейках. (A) Gating дерево для клеток крови: й мертвых клеток; b - живые клетки (согласно живому/мертвому окрашиванию клеток; отсутствие CD45 окрашивания необходимо, как в крови, высокая аутофлуоресценция делает популяции клеток четко различимыми); г нейтрофильные гранулоциты; моноцитов e (в соответствии с окрашиванием Gr1 и CD115). (B) Gating дерево для бронхоальвеолярной лаважа (BAL) жидкости: мертвые клетки; b - живые клетки (согласно живому/мертвому окрашиванию клеток); c CD45- иммунные клетки; г нейтрофильные гранулоциты; и макрофаги (согласно окрашиванию Ly6G и F4/80). (C) Gating дерево для легочной ткани: мертвые клетки; b - живые клетки (согласно живому/мертвому окрашиванию клеток); c CD45- иммунные клетки; г нейтрофильные гранулоциты; и макрофаги (согласно окрашиванию Ly6G и F4/80). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Проверка модели murine ALI против контрольных животных. (A) Выражение TNF-я в легочной ткани самок C57BL/6 мышей 24 ч и 72 ч после внутричечной зависания LPS (сворачивание выражения фиктивных животных). (B) АНАЛИЗ FACS абсолютного количества нейтрофилов гранулоцитов в легочной ткани. (C) Выражение MMP-9 в легочной ткани (изменение экспрессии фиктивных животных). (D) АНАЛИЗ FACS абсолютного количества нейтрофилов гранулоцитов в бронхоальвеолярной жидкости для лаважа. (E) Содержание альбумина в жидкости BAL (среднее - SD, n No 7, тест Манн-Уитни U, "p lt; 0.05 ( против управления PBS) ". Эта цифра была изменена с Эрентраут и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Название материала/ Оборудование | Объем (мЛ) |
| Фосфат Dulbecco Buffered Saline (PBS), без хлорида кальция и хлорида магния, стерильный | 1000 г. |
| Сыворотка плода (FCS) | 1 |
| Раствор этиленедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) | 1 |
| Азид натрия (NaN3) | 0,1 |
Таблица 1: Состав буфера FACS.
| Название материала/ Оборудование | Предлагаемое разбавление | Mastermix для 10 образцов: добавить к 200 l FACS буфера (20 л на образец): |
| Анти-CD115 (c-fms) БТР | 0,5 л/100 л | 5 зл |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | 0,5 л/100 л | 5 зл |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | 0,5 л/100 л | 5 зл |
| Анти-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | 0,5 л/100 л | 5 зл |
| Анти-Gr1 (RB6-8C5) | 0,5 л/100 л | 5 зл |
| Анти-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | 0,5 л/100 л | 5 зл |
| Анти-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 л/100 л | 5 зл |
Таблица 2: Подготовка мастер смеси для окрашивания FACS. Таблица описывает подготовку мастер смеси для 10 образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Минимальная инвазивность, простая обработка и хорошая воспроизводимость являются ключевыми особенностями представленного подхода, чтобы побудить ALI в небольшой модели грызунов. Использование LPS вместо целых бактерий в животных моделях имеет свои преимущества. Это стабильное и чистое соединение и может храниться в лиофилизированной форме до использования. Это мощный стимулятор для врожденных иммунных реакций через tLR4 путь, и его биологическая активность может быть легко количественно, способствуя титровации тяжести заболевания с хорошей воспроизводимости. Кроме того, использование LPS было показано, чтобы служить безопасной моделью, чтобы вызвать острый бронхит у здоровых добровольцев человека и, таким образом, позволяет перевод со скамейки в постели16. Rittirsch et al. продемонстрировали дозу- и зависящие от времени разработки характерной альвеоло-капиллярной утечки в моринной модели внутрипечевого зависания LPS6. Это позволяет дозы титрации для достижения определенных желаемых эффектов, которые могут проиллюстрировать различные степени али тяжести или раннего против позднего начала симптомов болезни. Однако, если следует решать различные инфекционные или фармакологические вопросы (например, антибиотикотерапия), то АЛИ, индуцированный стерильным закапыванием ЛПС, не является подходящей моделью.
Кроме того, по сравнению с интрапульмонарных или внутривенных доставки бактерий, нарушение альвеоло-капиллярный барьер был описан как довольно мягкий3, ставя под сомнение пригодность этой модели и является ли измененная проницаемость должна быть в частности. Правильное размещение катетера для доставки ЛПС на двусторонней основе в нижние дыхательные пути является критическим шагом подхода. Для обеспечения надлежащей интрубации внутричехальной, визуализации и идентификации гортани способствует внешний источник холодного света. Изменения в дыхательной структуре (например, кашель или задыхаясь) проверить правильное внутричечное запор жидкости.
Кроме того, выбор штамма мыши и LPS имеют решающее значение для индукции АЛИ и генерации воспроизводимых результатов в этой модели и зависят от рассматриваемого научного вопроса. Согласно литературе, дозировка вводят, чтобы вызвать максимальный эффект без дальнейшего увеличения с эскалацией дозы колеблется от 10 мкг /мышь (когда LPS от Pseudomonas aeruginosa F-D типа 1 вводится в женщин BALB/c мышей) до 50 мкг / мышь, когда инъекционные E. coli (серотип O111:B4) LPS (который также был использован в протоколе) в мужчинC C57BL/6 мышей6,9. В целом, BALB/c мышей должны реагировать чувствительно, когда оспаривается с LPS, в то время как C57BL/6 мышей, кажется, более устойчивы3. Таким образом, рекомендуется эксперименты по первоначальной титроции дозсортных, с учетом индивидуальных условий. Это также относится к срокам взятия крови, BAL, и орган выборки. Тяжесть АЛИ может быть определена клинически путем регулярного наблюдения температуры тела и респираторных симптомов дистресса. Кроме того, поскольку мыши разделяют только около 50% гомологии рецептора TLR4 с людьми, тщательное толкование результатов является обязательным3.
Альтернативы представленного в настоящем подходе включают в себя путь эндотоксина в легкие. Как описано Szarka et al., LPS также может быть введен через интраназальное закапывание9. Лю и др. сравнили прямое внутритрачельное осаждение свдыханием аэрозольной LPS 5. Основываясь на своих выводах, они пришли к выводу, что ингаляционный маршрут индуцирует более однородный тип АЛИ. Тем не менее, их эксперименты были проведены на крысах с направленным потоком нос только ингаляции и, следовательно, не обязательно могут быть переданы в настоящем представленном подходе. В отличие от этого, мыши часто подвергаются аэрозольной LPS в камере10. Размер камеры, концентрация LPS, и число мышей обработанных одновременно являются переменными, которые ограничивают сопоставимость между различными исследованиями и сделать индивидуальное создание модели рекомендуется. Последнее, внутривенное или внутриперенимальное введение LPS часто используется для индуцирования удаленных ALI17,18. Как показывают данные Szarka et al., внутрипеченевая закапывание, кажется, превосходит i.v. или i.p. route, когда конкретные воспалительные эффекты легочного сустава рассматриваются9. В заключение, протокол представляет собой простой и воспроизводимый подход к индуцированию стерильных АЛИ у мышей для решения конкретных иммунологических вопросов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Яна Кляйнера и Сюзанну Шульц за техническую поддержку. Авторы признают отличную поддержку потока цитометрии основной объект на медицинском факультете Боннского университета. Авторы не получали финансирования от какой-либо внешней организации. Часть данных, приведенных в разделе результатов и изображенных на рисунке 3, уже была показана в предыдущей публикации8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
