Summary
Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.
Abstract
La administración de lipopolisacáridos (LPS) es una forma común de estudiar la inflamación pulmonar y la lesión pulmonar aguda (ALI) en modelos animales pequeños. Se han descrito varios enfoques, como la inhalación de LPS aerosolizado, así como la insculación nasal o intratraal. El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones mediante la insinfección directa de LPS intratraqueal y realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar. Después de la sedación intraperitoneal, la tráquea se expone y el LPS se administra a través de un catéter venoso de 22 G. Una reacción inflamatoria robusta y reproducible con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar se induce dentro de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS utilizado. La recolección de muestras de sangre, el líquido BAL y la recolección pulmonar, así como el procesamiento para el análisis de FACS, se describen en detalle en el protocolo. Aunque el uso del LPS estéril no es adecuado para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, el enfoque descrito ofrece una mínima invasividad, un manejo sencillo y una buena reproducibilidad para responder a preguntas inmunológicas mecanicistas. Además, la valoración de la dosis, así como el uso de preparaciones alternativas de LPS o cepas de ratón permiten la modulación de los efectos clínicos, que pueden exhibir diferentes grados de gravedad de la ALI o temprano frente a la aparición tardía de los síntomas de la enfermedad.
Introduction
Los modelos animales experimentales son indispensables en la investigación inmune básica. La administración de bacterias enteras o componentes microbianos se ha utilizado con frecuencia en modelos animales pequeños para inducir inflamación local o sistémica1. El lipopolisacárido (LPS, o endotoxina bacteriana) es un componente de pared celular y antígeno superficial de bacterias gramnegativas (por ejemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., o Legionella spp.). La molécula termoestable y grande (peso molecular 1-4 x 106 kDa) consiste en una mitad lipídica (Lípido A), región central (oligosacárido), y un polisacárido O (o antígeno O). El lípido A, con sus cadenas de ácidos grasos hidrófobos, ancla la molécula en una membrana bacteriana y media (sobre la degradación de las bacterias) la actividad inmunológica y la toxicidad de LPS. Después de la unión a la proteína de unión LPS (LBP), los complejos LPS:LBP ligan el complejo receptor CD14/TLR4/MD2 ubicado en la superficie de muchos tipos de células, induciendo una fuerte reacción proinflamatoria con translocación nuclear NF-B y posterior regulación ascendente de la expresión de citoquinas2.
La lesión pulmonar aguda (ALI) se define como insuficiencia respiratoria hipoxémica aguda con edema pulmonar bilateral en ausencia de insuficiencia cardíaca3. La administración de las vías respiratorias de LPSes una forma común de inducir inflamación pulmonar y ALI 4,5,6,7. Aunque la sustancia estéril no es adecuada para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, las preguntas inmunológicas mecanicistas pueden responderse con una precisión adecuada. La insitación de LPS en la tráquea induce una reacción inflamatoria robusta con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar en cuestión de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS3, 6,7.
El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones por instanición de LPS intratraal. El modelo ha sido validado mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la invasión de granulocitos neutrófilos y la fuga de albúmina intra-alveolar como se describió anteriormente8.
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Protocol
Este protocolo animal fue aprobado por el comité local para el cuidado de animales (LANUV, Recklinghausen, Alemania; protocolo no 84-02.04.2015) y se realizó de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el uso de animales vivos (publicación de la NIH No 85-23, revisado 1996).
1. Inducción de ALI
2. Muestreo de sangre, lavado broncoalveolar, extracción de órganos
NOTA: El momento de la eutanización depende de la cuestión científica abordada. Por lo general, se realiza 12-72 h siguiendo la instilación de LPS3,4,9,10. La gravedad de la ALI se puede determinar clínicamente mediante la observación regular de la temperatura corporal y los síntomas de dificultad respiratoria11.
- Inducir la anestesia colocando el ratón en una cámara inundada de isoflurano. Use 3 vol% isoflurano con un flujo de oxígeno de 1 L/min. Asegurar la narcosis profunda induciendo un estímulo táctil. En caso de falta de profundidad de la anestesia, aumentar el isoflurano hasta 5 vol%.
- Sacrificar el ratón en anestesia profunda por dislocación atlanto-occipital.
- Fije el ratón con cinta adhesiva en una mesa de operaciones y desinfecte pronto el pelaje sobre el abdomen con 70% de etanol. Abra la cavidad abdominal cuidadosamente en la línea mediana con tijeras y pinzas. Retire partes del intestino para lograr el acceso a la vena cava inferior (IVC) directamente a la columna vertebral y la aorta abdominal.
- Localice las venas renales e inserte una cánula doblada de 23 G conectada a una jeringa de 1 ml en la ICV directamente debajo de la confluencia de las venas. Aspirar 250 l de sangre y transferirlo a un tubo de 1,5 ml lleno de 20 ml de solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) de 0,5 M. Agitar suavemente para facilitar la mezcla de EDTA y poner el tubo en hielo.
- Para el lavado broncoalveolar (BAL), prepare tres jeringas de 1 ml con 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire cada una. Desinfecte brevemente el pelaje de la garganta con 70% de etanol y exponga cuidadosamente la tráquea con tijeras y pinzas. Moviliza la tráquea y envuelve una sutura.
- Realizar BAL: Perforar la tráquea usando microtijeras e insertar un catéter venoso de 22 G cortado a una longitud de 20 mm. Fije el catéter con la sutura e inculca 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire. Aspirar el líquido después de 60 s. Repita el procedimiento con las dos jeringas adicionales y recoja el aspirado completo en un tubo de 15 ml sobre hielo.
- Abra cuidadosamente el tórax con tijeras y pinzas para cosechar los pulmones. Corte el diafragma a lo largo del margen costal y corte las costillas con dos incisiones laterales. Evite cuidadosamente puncturar los pulmones. Levante el esternón cranealmente y arréjelo o retírelo.
- Preparar dos jeringas de 10 ml con PBS caliente a 37oC (sin calcio y magnesio). Haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo. Perforar el ventrículo derecho con una cáula de 26 G y lavar la circulación pulmonar con el PBS precalentado. Tenga en cuenta que los pulmones se vuelven pálidos durante el procedimiento.
- Retire el lóbulo derecho de los pulmones y córtelo en dos mitades. Congelación rápida en nitrógeno líquido, seguido de almacenamiento a largo plazo a -80 oC para una mayor expresión génica y análisis de proteínas.
- Retire todo el pulmón izquierdo y homogeneizarlo en una placa de 48 pocillos picando el tejido con tijera y pinza. Incubar el tejido en 2 ml de tampón de digestión [RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 0,1% NaN3, colagenasa I (1 mg/ml), y DNase II (7 mg/ml)] a 37 oC durante 60 min. Realizar una mayor homogeneización mediante una cuidadosa pipeteo de las piezas pulmonares de tejido hacia arriba y hacia abajo.
3. Preparación de tejidos para el análisis facS
- Preparar el tampón FACS fresco (Tabla1):utilice siempre PBS libre de calcio y magnesio para reducir la adhesión de célula a célula dependiente de cationes y evitar la acumulación. Suplemento con FCS (1%) para proteger las células de la apoptosis, evitar manchas inespecíficas y evitar que las células se peguen a los tubos FACS. Incluya EDTA (0,5 mM) para prevenir la adhesión de célula a célula basada en cationes cuando trabaje con células pegajosas y adherentes como macrófagos. Añadir azida sódica (0,1%), ya que evita la contaminación bacteriana y el fotoblanqueo de fluorocromos y bloquea el desprendimiento de anticuerpos.
- Transfiera las muestras de sangre (paso 2.4) a tubos FACS de 5 ml y mezcle suavemente la sangre con 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Poner los tubos en hielo y terminar la reacción después de 2 min añadiendo 2 ml de PBS helado. Centrifugar las muestras durante 5 min a 400 x g y desechar el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos12descritos anteriormente.
NOTA: El momento de la eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos como parte de la inflamación sistémica. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo. - Líquido BAL centrífugo (paso 2.6) durante 5 min a 400 x g. Aspirar el sobrenadante y congelarlo en nitrógeno líquido, seguido de un almacenamiento a largo plazo a -80 oC para un análisis de proteínas posterior. Resuspenda el gránulo de célula salconsión BAL con 2 ml de tampón FACS frío y, a continuación, transfiera la suspensión a un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 m para sujetar los vellos.
- Una vez más, centrifugar la muestra durante 5 min a 400 xg. Resuspenda el pellet con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos12descritos anteriormente.
NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en BAL como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo. - Transfiera el tejido pulmonar izquierdo digerido (paso 2.10) en un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 ml para extraer grumos y terminar el proceso de digestión añadiendo 2 ml de tampón FACS helado. Centrifugar la muestra durante 5 min a 400 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet con 60 l de tampón facS y proceso para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente12.
NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en el tejido pulmonar como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo. - Para el análisis facS, incubar células con anticuerpo CD16/CD32 a 4 oC durante 15 minutos para bloquear la unión no específica de la inmunoglobulina a los receptores Fc. Añadir 20 l de solución de bloqueo a 1 x 106 celdas en 60 l en un tubo de 5 ml.
- Mientras tanto, prepare una mezcla maestra con tampón FACS y anticuerpos como se describe en la Tabla2.
- Después del bloqueo, no lave las células. Añadir 20 l de mezcla maestra de anticuerpos por muestra para obtener un volumen final de 100 l. Incubar las muestras durante 20 minutos en la oscuridad a 4 oC.
- Lave cada muestra con 1 ml de tampón facS y centrífuga durante 5 min a 400 xg. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con tampón FACS a la concentración celular adecuada para las mediciones de FACS.
NOTA: Se sugiere un número de célula de 1 x 106 células/500 l para lograr los mejores resultados de fenotipado inmune en el análisis FACS con este protocolo. Sin embargo, se recomienda que los anticuerpos tengan que ser valorados individualmente. - Si es necesario, añada la tinción viva/muerta antes de la tinción de la superficie utilizando kits específicos disponibles comercialmente8.
- Por último, añada a cada muestra números fijos de perlas de calibración acopladas con fluorocromo disponibles en el mismo (3 x 105 perlas en 20 l de búfer FACS) para determinar los números de celda absolutos12. La estrategia de gating para la sangre, BAL y células tisulares se muestra en la Figura2.
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Representative Results
El enfoque descrito para inducir la ALI en ratones se validó mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la infiltración de granulocitos neutrófilos y la interrupción de la barrera alveolo-capilar 24 h y 72 h después de la instilación de LPS. Los animales inyectados por PBS sirvieron como control. La administración de LPS intratraqueal indujo una respuesta proinflamatoria pulmonar robusta. La expresión del TNF-o en el tejido pulmonar fue significativamente regulada, alcanzando un aumento sostenido y más de 50 veces en comparación con los animales de control [RQ (TNF-/18s); 24 h: 53,7 (SD a 11,6); 72 h: 55,0 (SD a 20,6); p < 0,05)] (Figura3A). La invasión de leucocitos en el espacio tisular y alveolar es un sello distintivo y característico para el desarrollo de ALI13. El análisis facS reveló una infiltración significativa de granulocitos neutrófilos (NG) en el intersticio pulmonar, con un recuento absoluto de células que se ha multiplicado casi 9 en comparación con los controles después de 24 h [65.243 (SD 15.855) frente a 7.358 (SD a 4.794), p < 0,05] ( Figura 3B). El recuento absoluto de NG disminuyó ligeramente después de 72 h; sin embargo, los aumentos del factor en comparación con los controles se mantuvieron estables [48.946 (SD a 5.223) frente a 5.510 (SD a 654), p < 0,05]. De acuerdo con la infiltración intersticial de NG, la expresión MMP-9 en el tejido pulmonar entero también se incrementó significativamente durante el período total de observación [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (SD a 1,5); 72 h: 10,4 (SD a 2,0); p < 0,05] (Figura3C).
NG no sólo se incrementaron en el tejido pulmonar, sino también en el líquido BAL. El aumento del pliegue en comparación con los animales de control fue más pronunciado que en el tejido pulmonar, con recuentos absolutos de NG 24 h después de la inducción de ALI de 52.005 (SD 21.906) frente a 1.829 (SD a 1.724) (p < 0,05) (Figura 3D). Después de 72 h, NG se incrementó a 37.254 (SD a 4.478) frente a 17,0 (SD a 10,8) (p < 0,05). El edema pulmonar debido a un deterioro grave de la barrera alveolo-capilar es patognomónico para el desarrollo de LAI, con LPS induciendo rápidamente la apoptosis endotelial y el aumento de la permeabilidad14,15. El análisis del contenido de albúmina en BAL fluid por ELISA reveló una pérdida significativa de la función de barrera. 24 h después de la instilación de LPS, la albúmina en el líquido BAL fue de 43 ng/ml (SD n.o 13), en comparación con 20 ng/mL (SD n.o 9) en condiciones de control (p < 0,05) (Figura3E). Después de 72 h, en animales de ALI, el contenido de albúmina era de 48 ng/ml (SD n.o 14), en comparación con 29 ng/mL (SD n.o 9) (p < 0,05).
Figura 1 : Diagrama esquemático de la configuración de intubación. Cabe señalar que el cuello del ratón debe ser super-extendido en un ángulo de 90o en relación con la mesa de operaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Estrategia de gating FACS para sangre, BAL y células tisulares. Las manchas de puntos ejemplares del análisis FACS se muestran en gráficas de pseudocolor de dos parámetros (fluorescencia de doble color). La estrategia de gating para las muestras respectivas se basa en células individuales. (A) Árbol de gating para las células de la sangre: a - células muertas; b - células vivas (según la tinción de células vivas /muertas; no es necesaria la tinción CD45 como en la sangre, la alta autofluorescencia hace que las poblaciones celulares sean claramente distinguibles); d • granulocitos neutrófilos; e - monocitos (según la tinción Gr1 y CD115). (B) Árbol de gating para el líquido de lavado broncoalveolar (BAL): a - células muertas; b - células vivas (según la tinción de células vivas/muertas); c - CD45+ células inmunitarias; d • granulocitos neutrófilos; y e - macrófagos (según la tinción Ly6G y F4/80). (C) Árbol de gating para el tejido pulmonar: a - células muertas; b - células vivas (según la tinción de células vivas/muertas); c - CD45+ células inmunitarias; d • granulocitos neutrófilos; y e - macrófagos (según la tinción Ly6G y F4/80). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Validación del modelo murine ALI contra animales de control. (A) Expresión de TNF-o en el tejido pulmonar de los ratones hembra C57BL/6 24 h y 72 h tras la instillación intratraal de LPS (cambio de expresión de animales falsos). (B) Análisis FACS del recuento absoluto de granulocitos neutrófilos en el tejido pulmonar. (C) Expresión de MMP-9 en el tejido pulmonar (cambio de expresión de animales falsos). (D) Análisis FACS del recuento absoluto de granulocitos neutrófilos en el líquido de lavado broncoalveolar. (E) Contenido de albúmina en el líquido BAL [media: SD, n a 7, prueba Mann-Whitney U, *p < 0,05 (vs. control PBS)]. Esta cifra ha sido modificada de Ehrentraut et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del material/equipo | Volumen (ml) |
| Salina tamponada de fosfato de Dulbecco (PBS), sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, estéril | 1000 |
| Suero de ternera fetal (FCS) | 1 |
| Solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) | 1 |
| Azida sódica (NaN3) | 0.1 |
Tabla 1: Composición del búfer FACS.
| Nombre del material/equipo | Dilución sugerida | Mastermix para 10 muestras: añadir a un tampón FACS de 200 l (20 l por muestra): |
| APC anti-CD115 (c-fms) | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | 0,5 l/100 l | 5 l |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | 0,5 l/100 l | 5 l |
Tabla 2: Preparación de la mezcla maestra para la tinción FACS. La tabla describe la preparación de mezcla maestra para 10 muestras.
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Discussion
La mínima invasividad, el manejo simple y la buena reproducibilidad son características clave del enfoque presentado para inducir ALI en un modelo de roedores pequeños. El uso de LPS en lugar de bacterias enteras en modelos animales tiene ventajas. Es un compuesto estable y puro y se puede almacenar en forma liofilizada hasta su uso. Es un potente estimulante para las respuestas inmunitarias innatas a través de la vía TLR4, y su actividad biológica puede cuantificarse fácilmente, facilitando la valoración de la gravedad de la enfermedad con buena reproducibilidad. Por otra parte, el uso de LPS se ha demostrado para servir como modelo seguro para inducir bronquitis aguda en voluntarios sanos humanos y por lo tanto permite la traducción de banco a la cabecera16. Rittirsch y otros han demostrado los desarrollos dependientes de la dosis y el tiempo de la fuga alveolo-capilar característica en un modelo murino de insinstación de LPS intratraqueal6. Esto permite que la valoración de la dosis logre ciertos efectos deseados, lo que puede ilustrar diferentes grados de gravedad de la ALI o la aparición temprana frente a la aparición tardía de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, si se deben abordar problemas infecciosos o farmacológicos distintos (por ejemplo, terapia antibiótica), la ALI inducida por la insitación estéril de LPS no es un modelo adecuado.
Además, en comparación con la administración intrapulmonar o intravenosa de bacterias, la interrupción de la barrera alveolo-capilar se describió como bastante leve3, cuestionando la idoneidad de este modelo y si la permeabilidad alterada debe ser investigado en particular. La colocación correcta del catéter para entregar el LPS bilateralmente en el tracto respiratorio inferior es el paso crítico del enfoque. Para garantizar una intubación intratraal adecuada, la visualización y la identificación de la laringe se facilitan mediante una fuente de luz fría externa. Los cambios en el patrón respiratorio (p. ej., tos o jadeo) verifican la correcta insferción intratraal del líquido.
Además, la elección de la cepa del ratón y el LPS son cruciales para la inducción de ALI y la generación de resultados reproducibles en este modelo y dependen de la cuestión científica abordada. Según la literatura, la dosis administrada para obtener un efecto máximo sin más aumento con dosis crecientes oscila entre 10 g/ratón (cuando LPS de Pseudomonas aeruginosa F-D tipo 1 se inyecta en ratones hembra BALB/c) a 50 g/ratón cuando inyectando E. coli (serotipo O111:B4) LPS (que también se utilizó en el protocolo) en ratones macho C57BL/66,9. En general, se supone que los ratones BALB/c reaccionan con sensibilidad cuando se les reta con LPS, mientras que los ratones C57BL/6 parecen ser más resistentes3. Por lo tanto, se recomiendan experimentos de valoración de dosis iniciales que respeten condiciones individuales. Esto también se aplica al momento de la sangre, BAL, y el muestreo de órganos. La gravedad de la ALI se puede determinar clínicamente mediante la observación regular de la temperatura corporal y los síntomas de dificultad respiratoria. Además, dado que los ratones sólo comparten aproximadamente el 50% de la homología del receptor TLR4 con los seres humanos, la interpretación cuidadosa de los resultados es obligatoria3.
Las alternativas al enfoque aquí presentado comprenden la vía de administración de endotoxinas a los pulmones. Según lo descrito por Szarka et al., LPS también puede administrarse a través de la insinsatación intranasal9. Liu et al. compararon la deposición intratraal directa con la inhalación de LPS5aerosolizado. Sobre la base de sus conclusiones, llegaron a la conclusión de que la vía inhalacional induce un tipo más uniforme de ALI. Sin embargo, sus experimentos se realizaron en ratas con una inhalación de solo nariz de flujo dirigido y, por lo tanto, no necesariamente pueden transferirse al enfoque aquí presentado. Por el contrario, los ratones a menudo están expuestos a LPS aerosolizado en una cámara10. El tamaño de la cámara, la concentración de LPS y el número de ratones tratados simultáneamente son variables que limitan la comparabilidad entre diferentes estudios y hacen que un modelo individual sea recomendable. Por último, la administración intravenosa o intraperitoneal de LPS se utiliza a menudo para inducir LA ALI remota17,18. Como sugieren los datos de Szarka y otros, la insitación intratraal parece ser superior a la vía i.v. o i.p. cuando se abordan efectos inflamatorios pulmonares específicos9. En conclusión, el protocolo representa un enfoque simple y reproducible para inducir ALI estéril en ratones para abordar problemas inmunológicos específicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Jan Kleiner y Susanne Schulz por proporcionar apoyo técnico. Los autores reconocen el excelente apoyo de la instalación central de citometría de flujo en la facultad de medicina de la Universidad de Bonn. Los autores no recibieron financiación de ninguna organización externa. Parte de los datos indicados en la sección de resultados y que se describen en la Figura 3 ya se han mostrado en una publicación anterior8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
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