Summary
Her præsenterer vi en protokol for at adskille og sortere en bestemt cellepopulation fra Drosophila mandlige tilbehørs kirtler (sekundære celler) til RNA-SEKVENSERING og RT-qPCR. Celle isolation opnås gennem FACS rensning af GFP-udtrykker sekundære celler efter en flertrinsdissociation proces, der kræver dissektion, proteaser fordøjelse og mekanisk dispersion.
Abstract
For at forstå funktionen af et organ, er det ofte nyttigt at forstå rollen af dets konstituerende cellepopulationer. Desværre, sjældenhed af individuelle cellepopulationer ofte gør det vanskeligt at opnå nok materiale til molekylære undersøgelser. For eksempel, tilbehørs kirtel af Drosophila mandlige reproduktive system indeholder to særskilte sekretoriske celletyper. De vigtigste celler udgør 96% af de sekretoriske celler i kirtel, mens de sekundære celler (SC) udgør de resterende 4% af cellerne (ca. 80 celler pr. mand). Selv om begge celletyper producerer vigtige komponenter i sædvæsken, er det kun nogle få gener, der vides at være specifikke for SCs. Raritet af SCs har hidtil hindret transkriptomic analyse undersøgelse af denne vigtige celletype. Her præsenteres en metode, der giver mulighed for rensning af SCs til RNA-ekstraktion og sekvensering. Protokollen består i første dissekere kirtler fra fluer udtrykker en SC-specifik gfp reporter og derefter udsætte disse kirtler til proteasefordøjelse og mekanisk dissociation for at opnå individuelle celler. Efter disse trin sorteres individuelle, levende, GFP-mærkede celler ved hjælp af en fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) til RNA-rensning. Denne procedure giver SC-specifikke RNAs fra ~ 40 hanner pr. betingelse for downstream RT-qPCR og/eller RNA-sekvensering i løbet af en dag. Procedurens hurtighed og enkelhed gør det muligt at bestemme transkriptomerne for mange forskellige fluer, fra forskellige genotyper eller miljøforhold, inden for en kort tidsperiode.
Introduction
Organer består af flere celletyper, hver med diskrete funktioner og undertiden udtrykker meget forskellige sæt af gener. For at få en præcis forståelse af, hvordan et organ fungerer, er det ofte vigtigt at studere hver enkelt celletype, der udgør dette organ. En af de primære metoder, der anvendes til at udforske mulige funktion er transkriptomanalyse. Denne kraftfulde metode giver et øjebliksbillede af genekspression i en celle, for at afsløre aktive processer og veje. Men, denne type analyse er ofte vanskeligt for sjældne cellepopulationer, der skal renses fra langt mere-rigelige tilstødende celler. For eksempel er Drosophila mandlig tilbehørs kirtel et organ, der primært består af to sekretoriske celletyper. Da sjældnere af de to celletyper kun består af 4% af cellerne i denne kirtel, var brugen af en celletype specifik transkriptomanalyse ikke blevet brugt til at bestemme funktionen af disse celler.
Tilbehørs kirtler (AGs) er organer i den mandlige reproduktive tarmkanal i insekter. De er ansvarlige for produktionen af de fleste af proteinerne i sædvæsken (sædvæske proteiner (Sfp'er) og tilbehørs kirtel proteiner (Acp'er)). Nogle af disse sfp'er er kendt for at inducere den fysiologiske og adfærdsmæssige respons hos parret hunner, almindeligvis kaldet post-parring respons (PMR). Nogle af PMRs omfatter: en øget ægløsning og æglægnings hastighed, opbevaring og frigivelse af sperm, en ændring i kvindelig kost, og et fald i kvindelig modtagelighed til sekundære kurere mænd1,2. Som insekter påvirker mange store samfundsmæssige spørgsmål fra menneskers sundhed (som vektorer for dødelige sygdomme) til landbruget (insekter kan være skadedyr, men er afgørende for bestøvning og jordkvalitet), forståelse insekt reproduktion er et vigtigt forskningsområde. Undersøgelsen af AGs og ACPs er blevet fremskreden betydeligt med den model organisme Drosophila melanogaster. Disse undersøgelser har fremhævet den rolle, som AGS og nogle af de individuelle proteiner, de producerer i skabelsen af PMR, påvirker arbejdet i andre arter som sygdommen vektor Aedes aegypti3,4og andre insekter1 ,5. Endvidere, som AGS udskiller bestanddele af sædvæsken1,6de er ofte tænkt som den funktionelle analog af pattedyrs prostata og Sædblærer. Denne funktion lighed kombineret med molekylære ligheder mellem de to væv-typer, har gjort den AGs en model for prostata kirtel i fluer7.
Inden for Drosophila mandlige, der er to lapper af tilbehørs kirtler. Hver lap kan ses som en SAC-lignende struktur, der består af en enkeltlags af sekretoriske celler omkring et centralt lumen, og indpakket af glatte muskler. Som nævnt ovenfor, der er to morfologisk, udviklingsmæssigt og funktionelt adskilte sekretoriske celletyper udgør denne kirtel: de polygonal-formede hoved celler (udgør ~ 96% af cellerne), og de større, runde sekundære celler (SC) (udgør den resterende 4% af cellerne eller ca. 40 celler pr. lap). Det har vist sig, at begge celletyper producerer særskilte sæt af Acp'er for at fremkalde og vedligeholde PMR. De fleste af de data, der er opnået til dato fremhæver rollen som et enkelt protein i at udløse de fleste af de karakteristiske adfærd af PMR. Dette protein, sex peptid, er en lille, 36 aminosyre peptid, der er udskillet af de vigtigste celler8,9,10. Selv om sex peptid synes at spille en stor rolle i PMR, andre acp'er, der produceres af både de vigtigste og sekundære celler, har også vist sig at påvirke forskellige aspekter af PMR11,12,13,14 ,15,16,17. For eksempel, baseret på vores nuværende viden, SCs, via de proteiner, de producerer, synes at være påkrævet for fastholdelse af SP signalering efter den første dag18.
I betragtning af den sjældenhed af SCs (kun 80 celler pr. mand), al vores viden om disse celler og de proteiner, de producerer kommer fra genetik og kandidat tilgange. Hidtil har kun en relativt lille liste over gener vist sig at være SC-specifik. Denne liste omfatter homeodomain protein defekt proventriculus (DVE)19, lncrna MSA20, Rab6, 7, 11 og 1921, CG1656 og CG1757511, 15,21 og homeoboxtranskriptionsfaktoren abdominal-b (Abd-b)18. Tidligere har vi vist, at en mutant mangelfuld for både udtrykket Abd-B og lncRNA MSA i sekundære celler (IAB-6cocuD1 mutant) forkorter længden af PMR fra ~ 10 dage til kun en dag12 , 18 , 20. denne fænotype synes at være forårsaget af forkert opbevaring af SP i den kvindelige reproduktive kanal12,18,20. På cellulær niveau, de sekundære celler i denne mutant viser unormal morfologi, mister deres karakteristiske vakuole-lignende strukturer18,20,21. Ved hjælp af denne mutant linje har vi tidligere forsøgt at identificere gener, der er involveret i SC-funktionen, ved at sammenligne transkriptionelle profiler af hele AGs fra enten vildtype eller mutant tilbehørs kirtler12. Også, andre laboratorier viste, at SC-nummer, morfologi og vakuolær indhold afhænger af mandlig kost, parring status og alder21,25,26.
Selv om der blev gjort positive fremskridt ved hjælp af disse tilgange, var der langt fra opnået en fuld SC transkriptom. RARENESS af disse celler i dette organ gjorde det vanskeligt at fremskridt yderligere selv fra vilde type celler. For at teste Gen ekspression, ændringer i disse celler efter særlige miljømæssige stimuli ville være endnu sværere. Der var således behov for en metode til isolering og rensning af SC RNA, som var hurtig og enkel at udføre under forskellige genetiske baggrunde og miljøforhold.
Både Abd-B og MSA gener kræver en specifik 1,1 kb forstærker fra Drosophila bithorax kompleks (kaldet D1 forstærker) for deres udtryk i SCS18,20. Denne forstærker har tidligere været brugt til at oprette en GAL4 -driver, der, når den er forbundet med en UAS-gfp, er i stand til at drive et stærkt gfp-udtryk specifikt i SCS. Således brugte vi denne linje som grundlag for en FACS protokol til at isolere disse celler fra både vildtype og IAB-6cocuD1 AGS). Da IAB-6CocuD1 mutant SCS viser en anden cellulær morfologi, viser vi, at denne protokol kan bruges til at isolere celler til bestemmelse af deres transkriptomer fra denne sjældne celletype under meget forskellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila linjer anvendes og indsamling af mænd
- For denne protokol, bruge mænd udtrykker GFP i SCs og ikke de vigtigste celler. Her anvendes en Abdb-GAL4 -driver (beskrevet i reference18), rekombineret med UAS-gfp (på kromosom 2). Andre passende drivere kan også anvendes. For isolering af SCs under forskellige mutante forhold, krydser mutationen til linjer, der indeholder den SC-specifikke GFP-linje.
- Saml to partier på omkring 25 raske, jomfruelige mænd for hver genotype og alder dem ved 25 °C i 3-4 dage i hætteglas med frisklavet Drosophila mad.
Bemærk: Som alder, parring status, ernæring og sociale miljø hver påvirker reproduktiv biologi, strenge protokoller skal følges for at kontrollere for disse parametre. Virgin mænd er alderen for 3-4 dage efter før eclosion ved 25 °c med en 12 h/12 h lys/mørk cyklus, på standard majs måltid-agar-gær mad, i grupper af 20-25 mænd per hætteglas.
2. løsninger og materiale forberedelse
-
Forbered følgende løsninger.
- Forbered serum suppleret medium (SSM): Schneiders Drosophila medium suppleret med 10% varme inaktiveret føtal kvæg serum og 1% penicillin-streptomycin.
- Forbered aliquoter af 1x trypsin enzym (f. eks. TrypLE Express enzym) og opbevar ved stuetemperatur.
- Forbered aliquoter af papain [50 U/mL] (opbevares ved-20 °C og optøet kun én gang).
- Forbered 1x fosfatbuffer saltvand (PBS, opbevaret ved stuetemperatur).
-
Forbered flere flamme afrundede pipet spidser til den fysiske dissociation af tilbehørs kirtler.
Bemærk: brug lav retention tips til håndtering af tilbehørs kirtler, da de har tendens til at overholde ubehandlet plast. Processen med flamme afrunding reducerer spids åbningen og udjævner kanterne af spidsen. Dette sikrer en effektiv dissociation efter peptidase fordøjelse uden at skære cellemembraner.- Skær 1 200 μL spids med en skarp klinge og passere den forsigtigt over en flamme for at afrunde spidsen, så åbningen er bredere, men jævn til håndtering under trin 3,7.
- Smal åbningen af flere 1.000 μL spidser ved at passere spidsen åbning nær en flamme i mindre end et sekund. Drej spidsen lidt for at undgå over smeltning eller tilstopning. Sortér de tip, der er lavet fra smallere til bredere. Dette kan gøres ved at timing hastigheden af aspiration. Prøv at adskille en lille skala prøve af AGs for at teste effektiviteten af de smalleste tips.
Bemærk: Disse spidser er afgørende for mekanisk agitation (trin 5,2 og 5,3). Kvalitet flamme-afrundet pipet spidser giver mulighed for fuldstændig dissociation samtidig bevare cellelevedygtighed. Som sådan vaskes disse tips grundigt med vand ved afslutningen af proceduren for genbrug. Dette giver mulighed for dag-til-dag reproducerbar dissociation.
3. dissektion af tilbehørs kirtler
- Sæt 20 til 25 mandlige Drosophila i en glas skål på is.
- Dissekere 1 mand i SSM. Tag sin reproduktive tarmkanal og rydde tilbehøret kirtel par fra alle andre væv bortset fra ejakulatorisk kanalen.
Bemærk: Fjern testiklerne, fordi den frigivne sperm kan skabe klumper og forstyrre dissociations processen. Fjern ejakulatorisk pære, som gør håndteringen vanskelig, når den flyder. - Med pincet, Overfør tilbehørs kirtler til en glasplade fyldt med SSM ved stuetemperatur. Gentag trin 3.2-3,3 20 gange for at få et parti på 20 par kirtler i SSM.
Bemærk: Disse trin vil blive opnået i 15 til 20 min. AGs bør se sundt, og de peristaltiske bevægelser af muskellag omkring kirtler bør være synlige. GFP kan overvåges ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. - Overfør tilbehørs kirtler til 1x PBS for en 1-2 min vask ved stuetemperatur.
Bemærk: For bedre dissociation er det bydende nødvendigt at skylle kirtlerne med PBS. Varigheden af dette trin bør dog begrænses, da cellerne viser tegn på stress i PBS; dissocierede sekundære celler i PBS svulmer hurtigt og dør. - 20 μL papain (50 U/mL) fortyndes til 180 μL 1x trypsin enzym for at opnå dissociations opløsningen (for at opskalere op eller ned, skal du holde 9 μL trypsin-enzym og 1 μL papain for hver mand). Med pincet, Overfør tilbehørs kirtler til denne løsning.
- Isoler spidsen af tilbehørs kirtler (indeholdende sekundære celler) fra den proksimale del. Brug fine pincet til at knibe fast midt i en glandulær lap og skær med den skarpe spids af en anden tang. Fjern den proksimale del af tilbehørs kirtler og ejakulations kanalen for at forbedre dissociationen og reducere cellernes sorterings tidspunkt.
Bemærk: Dissekting den distale del fra 20 par kirtler vil tage 15 til 20 min og fordøjelse af peptidaser vil således starte ved stuetemperatur. - Når alle kirtel spidser er blevet dissekeret, skal de overføres til et 1,5 mL rør ved hjælp af et særligt 200 μL pipet spids, der er fremstillet ved trin 2.2.1. Det skal være bred, afrundet og våd før håndtering af kirtler.
Bemærk: For at pipet tilbehør kirtel væv, bør tips altid være præ-våd med passende opløsning (trypsin enzym eller SSM, holde en tube af hver til dette formål). Skyl forsigtigt spidserne mellem prøverne for at undgå kontaminering.
4. vævs nedbrydning
- Placer mikrorøret i en 37 °C shaker i 60 min, Rocking ved 1.000 rpm.
Bemærk: Både agitation og fordøjelsestid er afgørende for en vellykket dissociation. Kortere eller bevægelig fordøjelse vil give dårlig dissociation, sandsynligvis fordi den ydre muskellag og indre viskøs sædvæske beskytte tilbehør kirtelceller fra peptidaser. - Tilsæt 1 mL SSM ved stuetemperatur for at standse fordøjelsen, og Fortsæt straks til trin 5.
5. mekanisk dissociation af cellerne
- Ved hjælp af en bred afrundet 1.000 μL spids, præ-våd med SSM, overføre prøven til en 24-brønd plade. Monitor GFP fluorescens under mikroskopet: de fleste kirtel spidser bør se intakt og et par SC skal løsnes.
- Ved hjælp af en afrundet smal pipet spids genereret i trin 2.2.2, pipet op og ned 3 til 5 gange for at forstyrre tilbehøret kirtel væv.
Bemærk: Overvåg fluorescens for at sikre, at store vævs pletter er blevet brudt op. Gentag trin 5,2, hvis dette ikke er tilfældet. - Ved hjælp af et meget snævert afrundet pipet spids (genereret ved trin 2.2.2), pipet op og ned 1-2 gange.
Bemærk: Kun individuelle celler skal være synlige efter trin 5,3. Brug af 24-brønd plader anbefales, fordi de muliggør en nem overvågning af processen. Når et par prøver blev behandlet og gav tilfredsstillende resultat (sundt udseende sekundære celler perfekt dissocieret), vil pipette Rings trinene blive udført i mikrorøret. - Vent mindst 15 minutter for at lade cellerne bosætte sig i bunden af brønden og fjerne den overskydende SSM for at reducere sorterings tiden.
Bemærk: At lade cellerne bosætte sig vist bedre end alternative metoder som centrifugering, og giver mulighed for en sidste visuel inspektion af celler lige før FACS. - Pipet cellerne i et rent 1,5 mL rør og samle identiske prøver (to partier af 20 hanner for hver betingelse). Skyl brønde med SSM for at genvinde de sidste celler, og pipet dem ind i røret (brug en lille volumen).
- I 1,5 mL-mikrorør tilsættes 300 μL Cellelyse opløsning og 1 μL proteinase K [50 μg/μL] (opløsninger, der findes i RNA-rensnings sættet, se trin 7). Forbered to rør til hver prøve (en til MCs og en til SCs).
6. FACER (Fluorescens-aktiveret celle sortering)
- Tilføj levedygtighed markør til hver prøve, der skal sorteres et par minutter før sortering (0,3 mM Draq7).
Forsigtig: Draq7 skal håndteres med forsigtighed. -
Sortere en homogen population af levende sekundære celler (GFP-positive, Draq7-negative celler). I et andet mikrorør, sortere en population af hoved celler (mindre, GFP-negative, Draq7-negative celler). Brug følgende FACS gating strategi:
Bemærk: Indstil celle sorterings trykket ved 25 psi, og pass cellerne gennem en 100 μm dyse. Sorteringshastigheden er omkring 2.000 celler/s.- Udelad snavs, og vælg samlede celler baseret på FSC-SSC (figur 2E) for at udelukke snavs.
- Udeluk døde celler. Excite Draq7 med en 640 nm laser og indsamle udsendte fluorescens med en 795/70 band-pass filter. Gate Draq7-positive celler ud (figur 2F).
- Fjern form ved hjælp af en dobbelt gating på SSC-H vs SSC-W og FSC-a vs FSC-h (figur 2h).
Bemærk: Udeluk celle form stringent ved hjælp af dobbelt gating, for at reducere hoved celle kontaminering. - Sorter ~ 550 GFP-positive celler i en 1,5 mL Micro tube med lysis buffer og proteinase K. Denne population betragtes som sekundære celler (SC, figur 2G). Excite GFP ved 488 nm og Indsaml udledt fluorescens med et 526/52 band-pass filter.
- Sorter ~ 1.000 GFP-negative celler, homogene og små i størrelse, i en 1,5 mL mikrorør med lysis buffer og proteinase K. Denne population betragtes som hoved celler (MC, figur 2G).
- Vortex alle prøver.
Bemærk: Fra 40 mænd (~ 40 x 80 SC = 3.200 sekundære celler), 600 til 800 levende singlet sekundære celler opnås (omkring 20-25% hentning). Stop sortering omkring 550 SC og 1.000 MC for at normalisere prøverne.
7. RNA-ekstraktion
Bemærk: Vi brugte epicentre MasterPure RNA rensning kit til RNA ekstraktion, med følgende tilpasninger. Andre kits kan bruges, så længe udbyttet er høj nok til at forberede et bibliotek til sekvensering fra ~ 500 celler (2 ng RNAs blev brugt her).
- Varme prøver ved 65 °C i 15 min og vortex hver 5 min for at fuldføre cellelyse.
- Placer prøver på is i 5 min. Følg producentens anbefalinger til udfældning af nukleinsyrer (dele "nedbør af totale nukleinsyrer" og "fjernelse af kontaminerende DNA fra totale nukleinsyre præparater").
- Stop RNA-pellet i 10 μL RNase-fri TE-buffer.
- Tilføj RNase-hæmmer (valgfrit).
- Opbevar prøverne ved-80 °C.
8. kvalitetskontrol af RNA-kvantitet,-kvalitet og-specificitet
- Vurder RNA-kvalitet og-koncentration. På grund af den lille mængde og koncentration, brug RNA 6000 Pico chips her. God kvalitet RNA er defineret som ikke-forringet, synlig som en lav baseline med skarpe toppe svarende til rRNAs.
-
RT-qPCR til at styre identiteten af sorterede celler
- Udfør reverse transskription med 2 ng af total RNAs ved hjælp af tilfældige hexamerer som Primers. Udfør RT på sekundær celle-RNA og hoved celle-RNA.
Bemærk: cDNAs kan fortyndes, aliciteres og opbevares frosset til senere brug. - Udfør kvantitativ PCR i realtid ved hjælp af passende primer-par for at kvantificere husholdnings gener (Alpha-Tubulin, 18S rRNA), sekundære celle specifikke gener (MSA, Rab19, Abd-B) og hoved celle specifikt gen (sexpeptid).
- Udfør reverse transskription med 2 ng af total RNAs ved hjælp af tilfældige hexamerer som Primers. Udfør RT på sekundær celle-RNA og hoved celle-RNA.
9. sekvens rækkefølge (cDNA-Biblioteks forberedelse, sekvensering og data analyse)
- Brug 2 ng af total RNAs til at syntetisere cDNAs med polydT Primers. Brug smartere teknologi til at forstærke dem til forstærkning.
- Brug et Nextera XT-sæt til at forberede biblioteket.
- Sekvens ved hjælp af multiplexed, 100 nukleotider enkelt læser sekvensering (selv om 50 nukleotider læsninger er passende til de fleste formål) at give omkring 30.000.000 læser for hver prøve.
10. data analyse
- Kør FastQC.
- Brug STJERNEN aligner til at kort læse læsninger på UCSC dm6 Drosophila reference genom og generere. bam filer. Brug Integrative Genomics Viewer (igv) til at visualisere læsninger på genom browser.
- Brug HTSeq til at udføre genoptællinger.
- Brug den trimmede middelværdi af M-værdier (TMM) metode til at normalisere genet tæller22. Brug edgeR til at udføre statistisk analyse af differentialekspression, MA-plots og PCA.
- For genekspression analyse og statistik, brug generel lineær model, kvasisandsynlighed F-test med falsk opdagelse sats (FDR) og Benjamini & Hochberg korrektion (BH).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der præsenteres her, gør det muligt for en eksperimententer at isolere sekundære celler fra Drosophila mandlige tilbehørs kirtler og at UDTRÆKKE deres RNA i løbet af en enkelt dag (figur 1).
Vi bruger Abd-B-GAL4 konstruere18 til at mærke sekundære celler (SC), men ikke hoved celler (MC) med gfp (figur 2A). Et af formålet med denne procedure er at opnå Wild type transkriptomet af SCs (Wild type er skrevet med inverterede kommaer, da de er fremstillet af transgene fluer, der udtrykker GFP og GAL4). Et andet mål er at opnå SC RNA gennem en hurtig og nem procedure, der gør det muligt at studere deres genekspression under forskellige forhold. Således udførte vi denne procedure ved hjælp af Wild type og "IAB-6cocuD1" mutanter, der bærer en 1,1 kb sletning fjerne forstærker af Abd-B ansvarlig for SC udtryk. Denne sletning fjerner også arrangøren af MSA, en vigtig udskrift for udvikling af sekundære celler, morfologi og funktion18,20 (figur 2B, C). Denne protokol blev gentaget tre gange med 2 genotyper hver gang for at opnå biologiske triplicater (i det følgende benævnt WT-1,-2,-3 for vildtype og D1-1,-2 og-3 for IAB-6cocuD1).
Denne protokol tillader MC og SC dissociation fra Drosophila tilbehørs kirtler i et par timer (figur 2D). Begge cellepopulationer sorteres derefter i to forskellige rør for at isolere MCs og SCs. Gating-strategien for FACS er vist i figur 2E-2g. Draq7 giver mulighed for at anslå cellelevedygtighed omkring 70% for hele prøven (figur 2F). Undertrøjer repræsenterer over 90% af SC-populationen, og over 80% af MC-populationen, som anslået af FSC-A vs FSC-h og SSC-h vs SSC-W. (Se figur 2H). Dette afspejler en effektiv dissociation. Omkring 10% af sorterings begivenhederne blev afbrudt, fordi en anden celle eller snavs var til stede i samme FACS dråbe. Fra 40 mænd indsamler vi typisk 550 SCs og 1.000 MCs og afbryder derefter sortering. Fra 1 prøve (ud af 6), kunne vi ikke nå 550 sekundære celler. WT-1 prøven blev således fremstillet fra kun 427 SC, men leverede RNA af samme kvalitet og kvantitet som andre.
Celler sorteres i lyse buffer (indeholdende proteinase K). Så snart alle prøver er klar, ekstraheres RNAs fra hver celleprøve for at have RNA-pellets i slutningen af dagen. Kvalitet og mængde af RNAs anslås ved hjælp af en Bioanalysator med en passende chip til at håndtere lave koncentrationer og små volumener. Da de estimerede koncentrationer var variable mellem prøverne (fra over 1.300 PG/μL ned til 344 PG/μL, se figur 3A), justerede vi udgangsmaterialet for både rt-qPCR-og cDNA-bibliotekets syntese til ca. 2 ng (målt koncentrationer er ikke meget nøjagtige). Vi kvantificerede udtrykket af specifikke gener i realtid qPCR på Wild type MC og SC ekstrakter til kontrol for identiteten af de cellepopulationer, vi sorteret. Figur 3 B viser genekspression som relative kvantifikationer normaliseret til Alpha-Tubulin udtryk. Husholdning gener som 18s rRNA og Alpha-Tubulin detekteres i alle prøver, som forventet. Tværtimod detekteres SC-genet Rab19 kun fra SC ekstrakter, og MC gene sex peptid detekteres kun fra MC. Vi bemærker, at Rab19 ekspression i IAB-6cocuD1 mutant SC er lav i forhold til Wild type SC, hvilket tyder på, at ekspression af dette gen påvirkes af tabet af Abd-B og MSA (konsekvent, den store Rab19-mærkede vakuoler går tabt i IAB-6cocuD1 mutant21). Den sekundære celle specifikke transskriptionen MSA detekteres kun fra Wild type SC og ikke fra MC eller fra IAB-6cocuD1 SCS, hvilket var forventet, da MSA Promoter blev slettet i denne mutant. I alt viser de QCs, der er vist i figur 3 , at RNAs opnået gennem denne protokol ikke nedbrydes, og at begge cellepopulationer (SC og MC) med succes sorteres fra tilbehørs kirtler i både vildtype og mutant betingelser. Kun sekundære cellernes RNAs blev sekvenserede her, men Bemærk, at denne procedure muliggør samtidig transkriptomprofilering af både SCs og MCs.
RNA-sekvensering blev realiseret ved hjælp af standardprocedurer. Her vil vi kun diskutere kvalitetskontrolanalyser, der er relevante i forbindelse med denne metode. Når sekvenser er opnået, er de læsninger, der er knyttet til referencen Drosophila Genome, tilskrives gener, og normaliseret. PCA (hovedkomponent analyse) blev udført på de 6 prøver (3 vildtype og 3 IAB-6cocuD1 replikater). Så meget af variabiliteten i data som muligt er tegnede sig for i PC1, og så meget af den resterende variabilitet er tegnede sig for i PC2. Som vist i figur 4A, replikater Wild type klynge tæt sammen, og langt fra IAB-6cocuD1 prøver. Dette viser, at WT prøver er mere ligner hinanden, end de er fra mutant dem. Dette illustrerer metoden reproducerbarhed og dens evne til at opdage unormale genetiske program fra mutant sekundære celler. Mens D1-2-og D1-3-prøverne klynge sammen, bemærker vi, at D1-1-prøven er ret divergerende. Da alle QCs for denne replik er gode og sammenlignelige med alle andre replikater, kan vi udelukke en prøveforberedelse problem (29.000.000 læser i alt, > 76% af dem, der tilpasser sig entydigt til reference genomet. Blandt disse tilskrives > 77% et gen, > 90% er mRNAs, og < 3% er rRNA). Denne divergens kunne afspejle, at genekspression i SC er ustabil i IAB-6Cocud, selv om testning af denne hypotese ville kræve flere replikater.
Visualisering af læsninger, der er justeret til bestemte gener på genomet, giver mulighed for et visuelt skøn over datakvaliteten. Figur 4 viser et udvalg af gener, med læsninger fra 1 repræsentativ replikat for hver genotype. Det er ikke overraskende, at husholdnings gener som Act5C udtrykkes i begge genotyper (figur 4B) samt de SC-specifikke gener Rab19 og DVE (figur 4C, D). Manglen på intronic læser bekræfter, at polydt selektivt primet reverse transkription fra modne splejset mRNAs til cDNA bibliotek forberedelse. Vi kan især se vigtige og betydningsfulde variationer i ekspression af specifikke gener mellem Wild type og IAB-6cocuD1 SC. Dette er eksemplificeret i figur 4E ved MSA -genet, hvis stærke udtryk i vildtype går tabt i IAB-6cocuD1. MSA præsenteres som et bevis på princippet om, at denne metode gør det muligt at identificere gener, der er mis-reguleret under mutant forhold. Dette vil hjælpe med at forstå de fænotyper observeret i denne mutant, og kan give ny indsigt i normale sekundære celler funktioner.
Figur 1: oversigt over protokollen. De vigtigste trin i protokollen er vist, med tidslinjen på højre side. Denne procedure gør det muligt at starte med Live Drosophila om morgenen at have dissocieret tilbehør kirtelceller ved middagstid, sortere dem baseret på gfp udtryk, og få deres RNAs udvindes ved udgangen af arbejdsdagen. RNA-sekvensering og dataanalyse vil typisk tage et par uger. Dette tal er blevet ændret fra reference27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: isolering og sortering af GFP-udtrykker sekundære celler. (A) Konfokal billede af Abd-B:GAL4 UAS-gfp- tilbehørs kirtel, der udtrykker gfp i sekundære celler (SC), men ikke i hoved cellerne (MC). Kerner farves med DAPI (blå). Punkteret hvid linje afgræner AG lapper. ED er Ejakulatorisk kanal. Hvide bjælker i øverste venstre hjørne er 50 μm skalaer. (B,C) Udvidet visning af tilbehørs kirtel distale del med SC udtrykker gfp, i Wild type (B) og IAB-6cocuD1 (C) baggrund. D) dissocierede celler ved lav forstørrelse under gfp-binokulær. (E-H) FACS gating strategi til at rense SC og MC. røde prikker på alle paneler vist SCs som defineret i panel (G). Først er resterne udelukket (E, Step 6.2.1) samt draq-7 positive døde celler (F, trin 6.2.2). GFP-positive celler vælges (SC) samt en homogen population af GFP-negative celler (MC) (G, trin 6.2.4 og 6.2.5). Doublets er udelukket fra både MC og SC population (trin 6.2.3, kun SSC-H vs SSC-W gating for SC er vist på 2H som et eksempel). Dette tal er blevet ændret fra reference27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: QC på RNAs: kvalitet, kvantitet og celletype specificitet. A) kontrol af RNA-kvalitet og vurdering af koncentrationen på PicoChip. 25 NT peak er kontrol for kvantificering. Lav baseline indikerer lav nedbrydning og de 2 store toppe er ribosomale RNAs. De 3 prøver, der anvendes til RT-qPCR, er vist, deres kvalitet er repræsentativ for alle RNA-prøver, der anvendes i dette studie, og deres estimerede koncentrationer afspejler variationen i total RNA, som vi opnåede mellem prøverne. B) rt-qPCR påviser specificiteten af sortering af sekundære celler (SC) og hoved celler (MC). Beregning af genekspression sker ved hjælp af q = 2(40-CQ) formlen. Hver triplicat af hvert gen i hver tilstand normaliseret til den gennemsnitlige mængde af Alpha-Tubulin RNA for at kompensere for den totale RNA-variation. Fejllinjer viser standardafvigelse. WT betyder vildtype og D1 refererer til IAB-6cocuD1 mutant. Dette tal er blevet ændret fra reference27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: QC på RNA-sekvensering af data. (A) hovedkomponenter analyse (PCA) på WT-1,-2,-3 (grønne prikker) og D1-1,-2,-3 (blå PRIKKER) RNA-sekvensering datasæt. (B-E) Sekvensering læser knyttet til Drosophila reference genom ved hjælp af IGV-softwaren. Der vises kun et repræsentativt udsnit af hver genotype for klarheds skyld (WT-1 og D1-2), og kun få specifikke loci vises. Gennavnene skrives oven på hvert panel, > og < symboler refererer til deres orientering. Tal i parentes repræsenterer for hvert spor skalaen for antallet af læsninger pr. DNA-basis par. Denne skala er den samme for begge betingelser for et givet gen, men varierer mellem gener for bedre visualisering. Blå bjælker i bunden af hvert panel viser gener ' introns (tynd linje), exoner (bred linje) og ORF (rektangler med > >). Bemærk, at Rab19 og Arl5 er overlappende, konvergerende gener (C). Dette tal er blevet ændret fra reference27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primere anvendt til RT-qPCR i dette studie: | ||
| Målgenet | Fremad primer | Omvendt primer |
| Alpha-Tubulin | TTTTCCTTGTCGCGTGTGAA | CCAGCCTGACCAACATGGAT |
| 18S rRNA | CTGAGAAACGGCTACCACATC | ACCAGACTTGCCCTCCAAT |
| Rab19 | CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC | TTGGAAAAGGAAGACCGCTTG |
| Sex peptid | GGAATGGCCGTGGAATAGGA | TAACATCTTCCACCCCAGGC |
| Msa | CTCATCTGCGTCTTCGCGTG | CAGCTCCGTTTGTAATCTCTCGAGC |
Tabel 1: grundere sekvens
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder til celle dissociation fra Drosophila væv som imaginal discs er allerede beskrevet23. Vores forsøg på at blot bruge disse procedurer på tilbehørs kirtler mislykkedes, tilskynde os til at udvikle denne nye protokol. Proteasefordøjelse og mekanisk formalings var kritiske skridt, som vi gjorde for at gøre proceduren vellykket, og vi placerede således mange noter i afsnit 2-5 for at hjælpe eksperimenterne med at opnå tilfredsstillende resultater. For at dissociation skal lykkes, skal peptidaser nå tilbehøret kirtelceller, som er beskyttet af den viskøse sædvæske i lumen og muskellag omkring kirtel. Dissekting kirtlernes distale del var således kritisk (trin 3,6). Også, fordøje for 60 min mindst med kraftig rystning (trin 4,1) var nødvendig. Blid dissociation med trypsin opløsning (f. eks. TrypLE) bevarede kirtel integriteten og cellens levedygtighed indtil mekanisk dissociation. Tilføjelsen af enten papain eller kollagenase i forbindelse med trypsin-opløsningen forbedrede dissociationen (perfekt dissociation blev opnået med færre pipettering, hvilket resulterede i bedre celle overlevelse). Ingen af disse enzymer var imidlertid tilstrækkelige til at adskille cellerne på egen hånd. Pipettering med afrundede smalle spidser genereret i del 2.2.2 er et vigtigt skridt for denne metode. Derfor bør denne formalings (trin 5.2-5.3) optimeres i små skala forsøg for at vælge den bedste kombination af tips (se note i trin 5,3).
Ved hjælp af denne protokol, vil man være i stand til at isolere 500 til 800 levende sekundære celler fra 40 mænd. Dette udgør ~ 20% (± 5%) Recovery overvejer 3.200 SC som udgangsmateriale (40 mænd x 80 SC). 20% effektivitet var høj nok til RNA-sekvensering, da vi kunne behandle flere prøver på en dag. Dette kan dog forbedres ved flere metoder, herunder: arbejde i større partier; gør formalings i fordøjelses røret og springer trin 5,4 for at reducere overførsler; triturating meget forsigtigt (nogle dissocierede GFP + celler dør kort efter trin 5,3); afkortning af perioden mellem dissociation og FACS at nedsætte fordøjelses tiden ved at anvende trypsin-opløsning ved højere koncentration Brug af mindre strenge parametre for singlet-valg (trin 6.2.3) og afbrudt sortering. En begrænsning af denne protokol er, at det tager flere timer at isolere celler; Derfor er det ikke egnet til at studere meget forbigående genekspression ændringer. Med denne protokol, 4 x 20 hanner kan behandles af en enkelt person (med træning) i en morgen, tillader RNA ekstraktion fra SC af to forskellige tilstande i 1 dag (figur 1). Især kan flere eksperimenters deltage i tilbehørs kirtler samling (trin 3.1-3.3) for at behandle flere prøver på samme dag. Men trin 3,4 og fremefter vil fortrinsvis blive udført af den samme person for at maksimere reproducerbarhed.
Sekundære celler udføre væsentlige funktioner for mandlig fægtsomhed12,20,24, men det komplette billede af de gener, de udtrykker at opfylde denne rolle er stadig mangler. Her beskriver vi, hvordan man får transkriptomet af disse celler fra et relativt lille antal fluer, hvilket gør det muligt at sammenligne genekspression i SC under forskellige forhold. Her blev der anvendt en mutant, som påvirkede SC-funktionen og morfologien, og vigtige ændringer i transkriptomet er synlige. Denne metode kan således hjælpe med at identificere nye SC-gener, der er nødvendige for deres funktion. Til vores viden, den eneste alternative metode til at opnå SC transcriptome blev udført i vores laboratorium ved manuel plukning af SCs. god kvalitet RNA sekvensering data blev opnået, men proceduren var for arbejdskrævende at blive udført i flere betingelser. Vi vil sammenligne vores SC RNAseq datasæt og analysere deres biologiske betydning om SC biologi i et særskilt papir (under udarbejdelse).
I fremtiden vil denne teknik ikke kun kaste lys over vildtype SC transkriptomet, men også gøre det muligt at studere virkningen af miljøet eller genmodifikation på tilbehørs kirtelceller transkriptomet. SC-nummer, morfologi og vakuolært indhold har vist sig at afhænge af mandlig kost, parring status og alder21,25,26. Vi har stadig en begrænset forståelse af de involverede genetiske veje og sammenligning af SC transkriptomer under forskellige forhold ville være indsigtsfulde. Denne hurtige og relativt enkle protokol vil gøre det muligt at foretage sådanne undersøgelser. Det er vigtigt, at denne metode gør det muligt at isolere hoved celler fra de samme individer og derfor kunne anvendes som det er at afgøre, om genetiske og miljømæssige parametre påvirker både tilbehørs kirtel celletyper samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen afsløring.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige over for medlemmerne af Karch Lab, til iGE3 genomforskning plateform, til flow cytometry kerne faciliteten ved universitetet i Genève, og til Dr. Jean-Pierre Aubry-lachainaye, der satte protokollen for FACS. Vi takker Luca Stickley for hans hjælp med at visualisere læsninger på IGV. Vi takker os selv for blid tilladelse til at genbruge tal, og redaktører for at tilskynde os til at være kreativ med at skrive.
Denne forskning blev finansieret af staten Genève (CI, RKM, FK), den schweiziske nationale fond for forskning (www.snf.ch) (FK og RKM) og donationer fra Claraz Foundation (FK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
