Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ett FACS-baserat protokoll för att isolera RNA från de sekundära cellerna i Drosophila manliga tillbehörs körtlar

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/60218
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att separera och sortera en specifik cellpopulation från Drosophila manliga tillbehörs körtlar (sekundära celler) för RNA-SEKVENSERING och RT-qPCR. Cell isolering åstadkoms genom FACS rening av GFP-uttrycker sekundära celler efter en multistep-dissociation process som kräver dissektion, proteaser matsmältning och mekanisk dispersion.

Abstract

För att förstå funktionen hos ett organ, är det ofta bra att förstå den roll som dess konstituerande cellpopulationer. Tyvärr, den sällsynthet enskilda cellpopulationer gör ofta det svårt att få tillräckligt med material för molekylära studier. Till exempel, tillbehöret körtel i Drosophila manliga reproduktionssystemet innehåller två distinkta sekretoriska celltyper. De viktigaste cellerna utgör 96% av de sekretoriska cellerna i körteln, medan de sekundära cellerna (SC) utgör resterande 4% av cellerna (om 80 celler per hane). Även om båda celltyperna producerar viktiga komponenter i säden vätskan, är det bara några få gener som är kända för att vara specifika för SCs. Den sällsynthet SCs har hittills hindrat transcriptomic analys studie av denna viktiga celltyp. Här presenteras en metod som möjliggör rening av SCs för RNA-extraktion och sekvensering. Protokollet består i första dissekera körtlar från flugor som uttrycker en SC-specifik GFP reporter och sedan utsätta dessa körtlar till proteas matsmältning och mekanisk dissociation att få enskilda celler. Efter dessa steg sorteras enskilda, levande, GFP-märkta celler med hjälp av en fluorescerande aktiverad cell sorterare (FACS) för RNA-rening. Denna procedur ger SC-specifika RNAs från ~ 40 hanar per villkor för nedströms RT-qPCR och/eller RNA-sekvensering under loppet av en dag. Den snabbhet och enkelhet i förfarandet möjliggör transkriptom av många olika flugor, från olika genotyper eller miljöförhållanden, som skall bestämmas på kort tid.

Introduction

Organ består av flera celltyper, var och en med diskreta funktioner och ibland uttrycker väldigt olika uppsättningar av gener. För att få en exakt förståelse för hur ett organ fungerar, är det ofta kritiskt att studera varje distinkt celltyp som utgör detta organ. En av de primära metoder som används för att utforska möjlig funktion är transkriptome analys. Denna kraftfulla metod ger en ögonblicksbild av genuttrycket i en cell, för att avslöja aktiva processer och vägar. Emellertid, denna typ av analys är ofta svårt för sällsynta cellpopulationer som måste renas från mycket mer-riklig angränsande celler. Till exempel är Drosophila manliga tillbehörs körtel ett organ som består främst av två sekretoriska celltyper. Eftersom ovanligare av de två celltyperna består av endast 4% av cellerna i denna körtel, användning av en cell-typ specifik transkriptome analys hade inte använts för att avgöra funktionen av dessa celler.

Tillbehörs körtlar (AGs) är organ i de manliga reproduktionsorganen i insekter. De är ansvariga för produktionen av mest av proteinerna av den nyskapande vätskan (seminalvätskeproteiner (sfps) och tillbehör körtel proteiner (acps)). Några av dessa SFPs är kända för att inducera fysiologiska och beteendemässiga svar hos parade honor, vanligen kallad efter parning svar (PMR). Några av de PMRS inkluderar: en ökad ägglossning och äggläggning hastighet, lagring och frisättning av spermier, en förändring i kvinnlig kost, och en minskning av kvinnlig mottaglighet för sekundär uppvaktning män1,2. Som insekter påverkar många stora samhälleliga frågor från människors hälsa (som vektorer för dödliga sjukdomar) till jordbruket (insekter kan vara skadedjur, men är kritiska för pollinering och markens kvalitet), förstå insekt reproduktion är ett viktigt forskningsområde. Studiet av AGs och ACPs har avancerat betydligt med modellorganismen Drosophila melanogaster. Dessa studier har belyst den roll som AGS och några av de enskilda proteiner som de producerar för att skapa PMR, påverkar arbetet i andra arter som sjukdomen vektor Aedes aegypti3,4, och andra insekter1 ,5. Dessutom, som AGS utsöndrar beståndsdelarna i sädesvätskan1,6 de är ofta betraktas som funktionell analog av däggdjur prostatakörteln och sädesvesikel. Denna funktion likhet i kombination med molekylära likheter mellan de två vävnads-typer, har gjort AGs en modell för prostatakörteln i flugor7.

Inom Drosophila manliga, det finns två lober av tillbehör körtlar. Varje lob kan ses som en SAC-liknande struktur som består av en enskiktslager av sekretoriska celler som omger en central lumen, och insvept av glatt muskulaturen. Som nämnts ovan, det finns två morfologiskt, utvecklingsstörda och funktionellt distinkta sekretoriska celltyper som utgör denna körtel: den månghörniga-formade huvud celler (som utgör ~ 96% av cellerna), och de större, runda sekundära celler (SC) (som utgör resterande 4% av cellerna, eller cirka 40 celler per LOB). Det har visats att båda celltyperna producerar distinkta uppsättningar av ACPs för att inducera och bibehålla PMR. De flesta av de uppgifter som erhållits hittills belysa rollen av ett enda protein i utlöser de flesta av de karakteristiska beteenden av PMR. Detta protein, kön peptid, är en liten, 36 Amino Acid peptid som utsöndras av de viktigaste cellerna8,9,10. Även om kön peptid verkar spela en viktig roll i PMR, andra acps, som produceras av både de viktigaste och sekundära celler, har också visat sig påverka olika aspekter av PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Till exempel, baserat på vår nuvarande kunskap, SCs, via de proteiner som de producerar, verkar krävas för förevigning av SP signalering efter den första dagen18.

Med tanke på den sällsynthet SCs (endast 80 celler per hane), all vår kunskap om dessa celler och de proteiner som de producerar kommer från genetik och kandidat strategier. Hittills har endast en relativt liten lista över gener visats vara SC-specifik. Denna förteckning omfattar homeodomain protein defekt proventriculus (DVE)19, den lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 och 1921, CG1656 och CG1757511, 15,21 och Hedgehog transkription faktorn buk-b (Abd-b)18. Tidigare har vi visat att en mutant bristfällig för både uttrycket av Abd-B och lncRNA MSA i sekundära celler (IAB-6cocuD1 Mutant) förkortar längden på PMR från ~ 10 dagar till endast en dag12 , 18 , 20. denna fenotyp verkar bero på felaktig lagring av SP i reproduktionsorganen i honor12,18,20. På cellnivå, de sekundära cellerna i denna Mutant uppvisar onormal morfologi, förlorar sin karakteristiska vacuole-liknande strukturer18,20,21. Med denna Mutant linje, vi försökte tidigare att identifiera gener inblandade i SC funktion genom att jämföra transkriptionella profiler av hela AGs från antingen Wild Type eller mutant tillbehör körtlar12. Också, andra laboratorier visade att SC-nummer, morfologi och vakuolär innehåll beror på manlig diet, parnings status och ålder21,25,26.

Även om positiva framsteg gjordes med dessa metoder, en fullständig SC transkriptome var långt ifrån uppnåtts. Den rvinklighet av dessa celler i detta organ gjorde det svårt att utvecklas ytterligare även från vilda typ celler. För att testa genuttryck, förändringar i dessa celler efter särskilda miljömässiga stimuli skulle vara ännu svårare. Således behövdes en metod för att isolera och renodla SC-RNA som var snabbt och enkelt nog att prestera under olika genetiska bakgrunder och miljöförhållanden.

Både Abd-B och MSA gener kräver en specifik 1,1 KB förstärkare från Drosophila bithorax Complex (kallas D1 Enhancer) för deras uttryck i SCs18,20. Denna förstärkare har tidigare använts för att skapa en GAL4 drivrutin som, när den är associerad med en UAS-GFP, kan köra starka GFP uttryck specifikt i SCs. Således använde vi denna linje som grund för ett FACS-protokoll för att isolera dessa celler från både vildtyp och IAB-6cocuD1 AGS). Som IAB-6CocuD1 Mutant SCs Visa en annan cellulär morfologi, visar vi att detta protokoll kan användas för att isolera celler för bestämning av deras transkriptome från denna sällsynta celltyp under väldigt olika förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Drosophila linjer som används och insamling av män

  1. För detta protokoll använder män uttrycker GFP i SCs och inte de viktigaste cellerna. Här används en Abdb-GAL4- drivrutin (beskrivs i referens18), rekombinerat med UAS-GFP (på kromosom 2). Andra lämpliga drivrutiner kan också användas. För isolering av SCs under olika muterade förhållanden, korsa mutationen i linjer som innehåller den SC-specifika GFP-linjen.
  2. Samla två partier av cirka 25 friska, Virgin hanar för varje genotyp och ålder dem vid 25 ° c för 3-4 dagar i flaskor med nybakade Drosophila mat.
    Anmärkning: Som ålder, parnings status, näring och social miljö varje påverkar reproduktionsbiologi, strikt protokoll måste följas för att kontrollera för dessa parametrar. Virgin hanar är i åldern 3-4 dagar efter Pupp eclosion vid 25 ° c med en 12 h/12 h ljus/mörker cykel, på standard majsmjöl-agar-jäst mat, i grupper om 20-25 hanar per flaska.

2. lösningar och material beredning

  1. Förbered följande lösningar.
    1. Förbered serum kompletterat medium (SSM): Schneiders Drosophila medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin.
    2. Bered alikvoter av 1x trypsinenzym (t. ex. TrypLE Express enzym) och förvara i rumstemperatur.
    3. Bered alikvoter av papain [50 U/mL] (lagrad vid-20 ° c och upptinad endast en gång).
    4. Bered 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS, förvaras vid rumstemperatur).
  2. Förbered flera Flame-rundade Pipettera tips för fysisk dissociation av tillbehör körtlar.
    Obs:     Använd låg retention tips för hantering av tillbehör körtlar som de tenderar att följa obehandlad plast. Processen med Flam avrundning minskar spets öppningen och jämnar ut spetsens kanter. Detta säkerställer en effektiv dissociation efter dipeptidylpeptidas matsmältning utan klippning cellmembranen.
    1. Skär 1 200 μL spets med ett vasst blad och försiktigt passera den över en flamma för att runda ut sin spets så att öppningen är bredare men smidig för hantering under steg 3,7.
    2. Begränsa öppnandet av flera 1 000 μL tips genom att passera spetsen öppningen nära en flamma för mindre än en sekund. Rotera spetsen något för att undvika översmältning eller igensättning. Sortera tipsen gjorda av smalare till bredare. Detta kan göras genom timing hastigheten på aspiration. Försök att separera en liten skala prov av AGs att testa effektiviteten i den smalaste tips.
      Anmärkning: Dessa tips är kritiska för mekanisk agitation (steg 5,2 och 5,3). Kvalitet Flame-rundade Pipettera tips möjliggör fullständig dissociation samtidigt bevara cellernas lönsamhet. Som sådan, dessa tips tvättas grundligt med vatten i slutet av förfarandet för återanvändning. Detta gör det möjligt för dag till dag reproducerbara dissociation.

3. dissektion av tillbehörs körtlar

  1. Sätt 20 till 25 manliga Drosophila i en glasskål på is.
  2. Dissekera 1 hane i SSM. Ta av sig reproduktionsorganen och rensa tillbehöret körtel par från alla andra vävnader bortsett från utlösnings kanalen.
    Anmärkning: Ta bort testiklarna eftersom den utgivna spermier kan skapa klumpar och störa dissociation processen. Ta bort ejakulation glödlampa, vilket gör hanteringen svårt när den flyter.
  3. Med tång, överföra tillbehörs körtlar till en glasskiva fylld med SSM vid rumstemperatur. Upprepa steg 3.2-3.3 20 gånger för att få en bunt med 20 par körtlar i SSM.
    Anmärkning: Dessa steg kommer att uppnås i 15 till 20 min. AGs bör se frisk, och peristaltiska rörelser av muskellagret runt körtlar bör vara synlig. GFP kan övervakas med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop.
  4. Överför tillbehörs körtlar till 1x PBS för en 1-2 min tvätt i rumstemperatur.
    Anmärkning: För bättre dissociation, är det absolut nödvändigt att skölja körtlar med PBS. Varaktigheten av detta steg, dock, bör begränsas eftersom cellerna visar tecken på stress i PBS; dissocierade sekundära celler i PBS snabbt sväller och dör.
  5. Späd ut 20 μL papain [50 U/mL] till 180 μL 1x trypsinenzym för att erhålla dissociationslösningen (för att skala upp eller ned Behåll 9 μL trypsinenzym och 1 μL papain för varje hane). Med tång, överför tillbehörs körtlar till denna lösning.
  6. Isolera spetsen på tillbehörs körtlar (som innehåller sekundära celler) från den proximala delen. Använd fina pinpett att nypa fast mitten av en körtel LOB och skär med den vassa spetsen av en andra pinpett. Ta bort den proximala delen av tillbehörs körtlar och utlösnings kanalen för att förbättra dissociation och minska cell sortering tid.
    Anmärkning: Dissekera den distala delen från 20 par av körtlar kommer att ta 15 till 20 min och matsmältningen av peptidaser kommer således att starta vid rumstemperatur.
  7. Efter alla körtel tips har dissekeras, överföra dem till en 1,5 mL tub med hjälp av en speciell 200 μL Pipettera spets beredd i steg 2.2.1. Det bör vara bred, rundad och våt före hantering av körtlar.
    Anmärkning: Till Pipettera tillbehörs körtelvävnad, bör tips alltid vara pre-våt med lämplig lösning (trypsin enzym eller SSM, hålla en tub av varje för detta ändamål). Skölj försiktigt av spetsarna mellan proverna för att undvika kontaminering.

4. vävnadsnedbrytning

  1. Placera mikroröret i en shaker på 37 ° c för 60 min, gunga vid 1 000 RPM.
    Anmärkning: Både agitation och digestionstid är avgörande för lyckad dissociation. Kortare eller orörlig matsmältning kommer att ge dålig dissociation, förmodligen för att det yttre muskellagret och inre viskös nyskapande vätska skydda tillbehörs körtelceller från peptidases.
  2. Tillsätt 1 mL SSM i rumstemperatur för att stoppa matsmältningen och fortsätt omedelbart till steg 5.

5. mekanisk dissociation av cellerna

  1. Med en bred rundad 1 000 μL spets, pre-våt med SSM, överför provet till en 24-brunn tallrik. Övervaka GFP fluorescens under Mikroskop: de flesta körtel tips bör se intakt och några SC bör lossna.
  2. Med hjälp av en rundad smal Pipettera spets som genereras i steg 2.2.2, Pipettera upp och ner 3 till 5 gånger för att störa tillbehörs körtelvävnad.
    Anmärkning: Övervaka fluorescensen för att se till att stora vävnads fläckar har brutits upp. Upprepa steg 5,2 om så inte är fallet.
  3. Med en mycket smal rundad Pipettera spets (genereras i steg 2.2.2), Pipettera upp och ner 1-2 gånger.
    Anmärkning: Endast enskilda celler ska synas efter steg 5,3. Använda 24-well plattor rekommenderas eftersom de möjliggör en enkel övervakning av processen. När några prover behandlades och gav tillfredsställande resultat (friska söker sekundära celler perfekt separerade), pipettering steg kommer att utföras i MicroTube.
  4. Vänta minst 15 min för att låta cellerna bosätta sig längst ner i brunnen och ta bort överskottet SSM för att minska sorterings tiden.
    Anmärkning: Låta celler sedimentera visade sig överlägsen alternativa metoder som centrifugering, och tillåter en sista visuell inspektion av celler strax före FACS.
  5. Pipet cellerna i en ren 1,5 mL rör och pool identiska prover (två partier av 20 hanar för varje tillstånd). Skölj brunnar med SSM för att återvinna sista celler, och Pipettera dem i röret (Använd en liten volym).
  6. I 1,5 mL mikrotuber, tillsätt 300 μL cell Lys lösning och 1 μL Proteinase K [50 μg/μL] (lösningar som tillhandahålls i RNA-renings satsen, se steg 7). Förbered två rör för varje prov (en för MCs och en för SCs).

6. FACS (fluorescens-aktiverad cell sortering)

  1. Lägg till lönsamhets markören i varje prov som ska sorteras några minuter före sortering (0,3 mM Draq7).
    Försiktighet: Draq7 ska hanteras med försiktighet.
  2. Sortera en homogen population av levande sekundära celler (GFP-positiva, Draq7-negativa celler). I en annan MicroTube, sortera en population av huvud celler (mindre, GFP-negativa, Draq7-negativa celler). Använd följande FACS gating strategi:
    Notera:     Ställ in cell sorteringstrycket på 25 psi och passera celler genom ett 100 μm munstycke. Sorterings graden är runt 2 000 celler/s.
    1. Utesluta skräp och välj totalt antal celler baserade på FSC-SSC (figur 2E) för att utesluta skräp.
    2. Utesluta döda celler. Excite Draq7 med en 640 Nm laser och samla ut fluorescens med ett 795/70 band-pass filter. Gate Draq7-positiva celler ut (figur 2F).
    3. Ta bort dubbletter med en dubbel gating på SSC-H vs SSC-W och FSC-A vs FSC-H (figur 2h).
      Anmärkning: Utesluta cell dubletter strikt med hjälp av dubbel gating, att minska huvudsakliga cell förorening.
    4. Sortera ~ 550 GFP-positiva celler till en 1,5 ml mikrorör med lysis buffert och proteinas K. Denna population betraktas som sekundära celler (SC, figur 2G). Excitera GFP vid 488 nm och samla upp utsänd fluorescens med ett 526/52 band-pass filter.
    5. Sortera ~ 1 000 GFP-negativa celler, homogena och små i storlek, till en 1,5 ml mikrorör med lysis buffert och proteinas K. Denna population anses vara huvud celler (MC, figur 2G).
    6. Vortex alla prover.
      Anmärkning: Från 40 hanar (~ 40 x 80 SC = 3 200 sekundära celler), 600 till 800 levande linne sekundära celler erhålls (ca 20-25% hämtning). Sluta sortera runt 550 SC och 1 000 MC för att normalisera prover.

7. RNA-extraktion

Anmärkning: Vi använde Epicentre MasterPure RNA rening kit för RNA-extraktion, med följande anpassningar. Andra kit kan användas så länge avkastningen är tillräckligt hög för att förbereda ett bibliotek för sekvensering från ~ 500 celler (2 ng RNAs användes här).

  1. Värmeprover vid 65 ° c i 15 min och skaka varje 5 min för att slutföra cell lysis.
  2. Placera proverna på isen i 5 min. Följ tillverkarens rekommendationer för nukleinsyror nederbörd (delar "utfällning av totala nukleinsyror" och "avlägsnande av förorenande DNA från totala nukleinsyra preparat").
  3. Suspendera RNA-pelleten i 10 μL av RNase-fri TE-buffert.
  4. Lägg till RNase inhibitor (valfritt).
  5. Förvara proverna vid-80 ° c.

8. kvalitetskontroller av RNA-kvantitet, kvalitet och specificitet

  1. Uppskatta RNA kvalitet och koncentration. På grund av den lilla volymen och koncentration, använda RNA 6000 Pico chips här. God kvalitet RNA definieras som icke-degraderad, synlig som en låg baslinje med skarpa toppar som motsvarar rRNAs.
  2. RT-qPCR för att kontrollera identiteten på sorterade celler
    1. Utför omvänd Transkription med 2 ng av total rnas med slumpmässiga multihexamererna som primers. Utför RT på sekundära cell RNA och main cell RNA.
      Obs: cDNAs kan spädas, aliciteras och förvaras fryst för senare användning.
    2. Utför realtids kvantitativ PCR med hjälp av lämpliga primer par för att kvantifiera hushållning gener (alfa-tubulin, 18S rRNA), sekundära cellspecifika gener (MSA, Rab19, Abd-B) och main cell specific gene (kön peptid).

9. sekvensering (cDNA-biblioteksberedning, sekvensering och data analys)

  1. Använd 2 ng av totala RNAs för att syntetisera cDNAs med polydT primers. Använd smartare teknik för att förstärka dem för förstärkning.
  2. Använd ett NextEra XT-kit för att förbereda biblioteket.
  3. Sekvens med Multiplexed, 100 nukleotider enda läsningar sekvensering (även om 50 nukleotider läsningar är lämpliga för de flesta ändamål) att ge omkring 30 000 000 läsningar för varje prov.

10. analys av data

  1. Kör FastQC.
  2. Använd stjärnan Aligner att kartlägga läsningar på UCSC Dm6 Drosophila referens arvsmassan och generera. BAM-filer. Använd Integrative Genomics Viewer (IGV) för att visualisera läsningar på genomets webbläsare.
  3. Använd HTSeq för att utföra gen räkningar.
  4. Använd det trimmade medelvärdet av M-Values (TMM)-metoden för att normalisera gen antalet22. Använda kantskärare för att utföra statistisk analys av differential uttryck, MA tomter och PCA.
  5. För gen uttrycks analys och statistik, Använd allmän linjär modell, kvasi-sannolikhet F-test med falsk detektions frekvens (FDR) och benjamini & Hochberg korrigering (BH).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det protokoll som presenteras här gör det möjligt för en försöksledaren att isolera sekundära celler från Drosophila manliga tillbehör körtlar och att EXTRAHERA deras RNA under loppet av en enda dag (figur 1).

Vi använder Abd-B-GAL4 konstruera18 för att märka sekundära celler (SC) men inte huvud celler (MC) med GFP (figur 2a). Ett mål med detta förfarande är att få den vilda typen transkriptome av SCs (Wild Type är skriven med inverterade kommatecken eftersom de erhålls från transgena flugor som uttrycker GFP och GAL4). Ett annat mål är att få SC RNA genom en snabb och enkel procedur som gör det möjligt att studera deras genuttryck under olika förhållanden. Sålunda, vi utfört den här procedur användande vild skriva på rad och "IAB-6cocuD1" mutanter så pass bära en 1,1 KB strykningen flyttande den Enhancer av Abd-B ansvarig för SC yttranden. Denna radering tar också bort promotorn för MSA, en viktig avskrift för sekundära celler utveckling, morfologi och funktion18,20 (figur 2B, C). Detta protokoll upprepades tre gånger med två genotyper varje gång för att erhålla biologiska tripletter (hädanefter benämn WT-1,-2,-3 för den vilda typen och D1-1,-2 och-3 för IAB-6cocuD1).

Detta protokoll tillåter MC och SC dissociation från Drosophila tillbehör körtlar i några timmar (figur 2D). Båda cellpopulationer sorteras sedan i två olika rör för att isolera MCs och SCs. Den gating strategi för FACS är utställning i bild 2virker-2g. Draq7 gör det möjligt att uppskatta cellernas lönsamhet runt 70% för hela provet (figur 2F). Undertröjor representerar över 90% av SC befolkningen, och över 80% av MC befolkningen, som uppskattas av FSC-A vs FSC-h och SSC-h vs SSC-W. (se figur 2H). Detta återspeglar en effektiv dissociation. Omkring 10% av sorterings händelserna avbröts eftersom en annan cell eller ett annat skräp fanns i samma FACS-droplet. Från 40 hanar samlar vi vanligtvis in 550 SCs och 1 000 MCs och avbryter sedan sorteringen. Från 1 prov (av 6), kunde vi inte nå 550 sekundära celler. WT-1-provet erhölls således från endast 427 SC men tillhandahöll RNA av liknande kvalitet och kvantitet som andra.

Celler sorteras i lyseringsbuffert (innehållande proteinas K). Så snart alla prover är klara extraheras RNAs från varje cellprov för att få RNA-pellets i slutet av dagen. Kvalitet och kvantitet av RNAs uppskattas med hjälp av en Bioanalyzer med en lämplig chip för att hantera låga koncentrationer och små volymer. Eftersom uppskattade koncentrationer var variabla mellan proverna (från över 1 300 pg/μL ner till 344 PG/μL, se figur 3A), justerade vi utgångsmaterialet för både RT-qPCR-och cDNA-bibliotekssyntesen till ungefär 2 ng (mätt med koncentrationer inte är mycket noggranna). Vi kvantifierar uttrycket av specifika gener i realtid qPCR på Wild typ MC och SC extrakt för att kontrollera identiteten hos de cellpopulationer vi sorterat. Figur 3 B visar genuttryck som relativa kvantifieringar normaliserade till alfa-tubulin uttryck. Hushållning gener som 18s rRNA och alfa-tubulin upptäcks i alla prover, som förväntat. Tvärtom, SC genen Rab19 detekteras endast från SC extrakt, och MC gen kön peptid upptäcks endast från MC. Vi noterar att Rab19 uttryck i IAB-6cocuD1 Mutant SC är låg i förhållande till Wild typ SC, vilket tyder på att uttrycket av denna gen påverkas av förlusten av Abd-B och MSA (konsekvent, den stora Rab19-märkta vakuoler försvinner i IAB-6cocuD1 Mutant21). Den sekundära cell-specifika avskriften MSA upptäcks endast från Wild typ SC och inte från MC, inte heller från IAB-6cocuD1 SCs, som förväntades eftersom MSA promotorn tas bort i denna Mutant. Sammantaget visar de QCs som visas i figur 3 att de rnas som erhålls genom detta protokoll inte bryts ned, och att både cellpopulationer (SC och MC) framgångsrikt sorteras från tillbehörs körtlar, både i vildtyp och muterade tillstånd. Endast sekundära celler RNAs var sekvenserade här, men Observera att denna procedur möjliggör samtidig transkriptome profilering av både SCs och MCs.

RNA-sekvensering realiserades med hjälp av standardprocedurer. Här kommer vi endast att diskutera de kvalitetskontroll analyser som är relevanta för den här metodens ändamål. När sekvenser erhålls mappas läsningar till referensen Drosophila genom, tillskrivs gener, och normaliserade. PCA (huvudsaklig komponent analys) utfördes på 6 prover (3 vildtyp och 3 IAB-6cocuD1 replikat). Så mycket av variationen i data som möjligt redovisas i PC1, och så mycket av den återstående variationen redovisas i PC2. Som visas i figur 4Areplikerar Wild-typen kluster tätt tillsammans, och långt från IAB-6cocuD1 prover. Detta visar att WT -prover är mer lika varandra än de är från muterade. Detta illustrerar metodens reproducerbarhet och dess förmåga att detektera onormala genetiska program från mutanta sekundära celler. Medan D1-2 och D1-3 prov kluster tillsammans, vi noterar att D1-1 provet är ganska avvikande. Eftersom alla QCs för denna replikat är bra och jämförbara med alla andra replikat, kan vi utesluta ett provberedning problem (29 000 000 läser totalt, > 76% som är unikt för referensgenomet. Bland dessa tillskrivs > 77% en gen, > 90% är mRNAs och < 3% är rRNA). Denna avvikelse kan återspegla att genuttrycket i SC är instabilt i IAB-6Cocud, även om testning av denna hypotes skulle kräva mer replikat.

Visualisering av läsningar som anpassats till vissa gener på genomet möjliggör en visuell uppskattning av datakvaliteten. Figur 4 visar ett urval av gener, med läsningar från 1 representativ replikat för varje genotyp. Föga förvånande är städning gener som Act5C uttrycks i båda genotyper (figur 4B), samt SC-specifika gener Rab19 och DVE (figur 4C, D). Avsaknaden av intronic läsningar bekräftar att polydT selektivt med omvänd Transkription från mogen skarvade mRNAs för cDNA bibliotek beredning. I synnerhet kan vi se viktiga och betydelsefulla variationer i uttrycket av specifika gener mellan vildtyp och IAB-6cocuD1 SC. Detta exemplifieras i figur 4E av MSA -genen vars starka uttryck i vildtyp förloras i IAB-6cocuD1. MSA presenteras som ett princip bevis att denna metod möjliggör identifiering av gener som är vilseledande reglerade i mutanta förhållanden. Detta kommer att bidra till förståelsen av fenotyper som observerats i denna Mutant, och kan ge nya insikter i normala sekundära celler funktioner.

Figure 1
Figur 1: översikt över protokollet. Viktiga steg i protokollet visas, med tidslinjen på höger sida. Detta förfarande tillåter en börjar med levande Drosophila på morgonen för att ha dissocierade tillbehörs körtelceller vid middagstid, sortera dem baserat på GFP uttryck, och få sina rnas extraheras i slutet av arbetsdagen. RNA-sekvensering och dataanalys tar vanligtvis några veckor. Denna siffra har modifierats från referens27. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: isolera och sortera GFP-uttryckande sekundära celler. A) konfokalbild av Abd-b: GAL4 UAS-GFP- tillbehörs körtel som uttrycker GFP i sekundära celler (SC), men inte i huvud celler (MC). Kärnor färgas med DAPI (blå). Prickig vit linje avgränsar AG lobes. ED är ejaculatory kanal. Vita staplar i det övre vänstra hörnet är 50 μm skalor. (B,C) Förstorade vyer av tillbehörs körtel distala delen med SC uttrycker GFP, i vildtyp (B) och IAB-6cocuD1 (C) bakgrund. (D) separerade celler vid låg förstoring under GFP kikare. (E-H) FACS gating strategi för att rena SC och MC. röda prickar på alla paneler som visas SCs enligt definition i panel (G). Först är skräpet uteslutna (E, steg 6.2.1) as well as de draq-7 realitet döda cellerna (F, kliva 6.2.2). GFP-positiva celler väljs (SC) samt en homogen population av GFP-negativa celler (MC) (G, steg 6.2.4 och 6.2.5). Dubbletterna är exkluderade från både MC-och SC-populationen (steg 6.2.3, endast SSC-H vs SSC-W gating för SC visas på 2H som exempel). Denna siffra har modifierats från referens27. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: QC på RNAs: kvalitet, kvantitet och celltyp specificitet. (A) kontroll av RNA-kvalitet och koncentrations uppskattning på picochip. Toppen på 25 NT är kontrollen för kvantifiering. Låg baslinje indikerar låg nedbrytning och de 2 stora topparna är den ribosomala RNAs. De 3 prover som används för RT-qPCR visas, deras kvalitet är representativ för alla RNA-prover som används i denna studie, och deras uppskattade koncentrationer återspeglar variationen i totalt RNA vi fick mellan proverna. B) RT-qPCR uppvisar specificiteten hos sorteringen av sekundära celler (SC) och huvud celler (MC). Kvantifiering av genuttryck görs med hjälp av q = 2(40-CQ) formel. Varje tre exemplar av varje gen i varje tillstånd normaliseras till medelvärdet av mängden alfa-tubulin RNA för att kompensera för total RNA variation. Felstaplar visar standardavvikelse. WT betyder Wild Type och D1 hänvisar till IAB-6cocuD1 Mutant. Denna siffra har modifierats från referens27. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: QC på RNA sekvenserings data. (A) huvudkomponenter analys (PCA) på WT-1,-2,-3 (gröna prickar) och D1-1,-2,-3 (blå prickar) RNA sekvensering DataSet. (B-E) Sekvensering läsningar mappas till Drosophila referens arvsmassan med hjälp av IGV programvara. Endast ett representativt prov av varje genotyp visas för tydlighetens skull (WT-1 och D1-2), och endast ett fåtal specifika loci visas. Gen namn skrivs ovanpå varje panel, > och < symboler hänvisar till deras orientering. Siffror inom parentes representerar för varje spår skalan för antalet läsningar per DNA-baspar. Denna skala är densamma för båda förutsättningarna för en given gen, men varierar mellan gener för bättre visualisering. Blå staplar längst ned på varje panel visar genernas introner (tunna linjer), exoner (bred linje) och ORF (rektanglar med > >). Observera att Rab19 och Arl5 överlappar varandra, konvergent gener (C). Denna siffra har modifierats från referens27. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Primers som används för RT-qPCR i denna studie:
Målgen Framåt primer Omvänd primer
Alfa-tubulin TTTTCCTTGTCGCGTGTGAA CCAGCCTGACCAACATGGAT
18S rRNA Mer från CTGAGAAACGGCTACCACATC ACCAGACTTGCCCTCCAAT
Rab19 CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC TTGGAAAAGGAAGACCGCTTG
Sex peptid Mer från GGAATGGCCGTGGAATAGGA TAACATCTTCCACCCCAGGC
Msa CTCATCTGCGTCTTCGCGTG CAGCTCCGTTTGTAATCTCTCGAGC

Tabell 1: primers sekvens

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder för cell dissociation från Drosophila vävnad som imaginal skivor är redan beskrivna23. Våra försök att helt enkelt använda dessa förfaranden på tillbehör körtlar misslyckats, uppmuntra oss att utveckla detta nya protokoll. Proteas matsmältning och mekanisk sönderdelning var kritiska steg vi Felsökte för framgången av förfarandet, och vi placerade därför många anteckningar i avsnitten 2 till 5 för att hjälpa experimenterare att få tillfredsställande resultat. För dissociation vara framgångsrik, peptidaser måste nå de tillbehör körtelceller, som skyddas av trögflytande sädesvätskan i lumen och muskellagret runt körteln. Dissekera körtlar ' distala delen var således kritisk (steg 3,6). Också, smälta för 60 min åtminstone med kraftig skakning (steg 4,1) var nödvändigt. Mild dissociation med trypsin lösning (t. ex. TrypLE) bevarade körtel integritet och cellernas lönsamhet tills mekanisk dissociation. Tillsatsen av antingen papain eller kollagenase i samband med trypsinlösning förbättrade dissociationen (perfekt dissociation erhölls med färre pipettering, vilket resulterade i bättre cellöverlevnad). Emellertid, ingen av dessa enzymer var tillräckliga för att separera cellerna på egen hand. Pipettering med rundade smala spetsar som genereras i del 2.2.2 är ett avgörande steg för denna metod. Detta sönderdelning (steg 5.2-5.3) bör därför optimeras i småskaliga experiment för att välja den bästa kombinationen av tips (se anmärkning i steg 5,3).

Med hjälp av detta protokoll, kommer man att kunna isolera 500 till 800 levande sekundära celler från 40 män. Detta motsvarar ~ 20% (± 5%) återhämtning med tanke på 3 200 SC som utgångsmaterial (40 hanar x 80 SC). 20% effektivitet var tillräckligt hög för RNA-sekvensering eftersom vi kunde bearbeta flera prover på en dag. Detta kan dock förbättras genom flera metoder, bland annat: att arbeta i större partier; gör sönderdelning i rötnings röret och hoppa över steg 5,4 för att minska överföringar; triturating mycket försiktigt (vissa dissocierade GFP + celler dör strax efter steg 5,3); förkorta perioden mellan dissociation och FACS; minska digestionstiden genom att använda trypsin lösning vid högre koncentration; använda mindre stränga parametrar för val av linne (steg 6.2.3) och avbrutna sortering. En begränsning av detta protokoll är att det tar flera timmar att isolera celler. Därför är det inte lämpligt att studera mycket övergående gen uttrycks förändringar. Med detta protokoll, 4 x 20 hanar kan bearbetas av en enda person (med utbildning) på en morgon, så att RNA extraktion från SC av två olika villkor i 1 dag (figur 1). Särskilt, fler praktiker kan delta i tillbehörs körtlar samling (steg 3.1-3.3) för att bearbeta flera prover på samma dag. Steg 3,4 och framåt kommer dock företrädesvis att utföras av samma person för att maximera reproducerbarheten.

Sekundära celler utför viktiga funktioner för manlig Fecundity12,20,24, men den fullständiga bilden av de gener de uttrycker för att uppfylla denna roll saknas fortfarande. Här beskriver vi hur man erhåller transkriptome av dessa celler från ett relativt litet antal flugor, vilket möjliggör en jämförelse av genuttryck i SC under olika förhållanden. Här, en muterad som påverkar SC funktion och morfologi användes, och viktiga förändringar i dess transkriptome är synliga. Denna metod kan således bidra till att identifiera nya SC-gener som är nödvändiga för deras funktion. Till vår kännedom, den enda alternativa metoden för att få SC transkriptome utfördes i vårt labb genom manuell plockning av SCs. god kvalitet RNA sekvensering data erhölls, men förfarandet var för arbetsintensiva att utföras i flera villkor. Vi kommer att jämföra våra SC RNAseq datauppsättningar och analysera deras biologiska innebörd om SC biologi i ett tydligt papper (under utarbetande).

I framtiden kommer denna teknik inte bara belysa vilda typ SC transkriptome, men också göra det möjligt att studera effekterna av miljö eller genförändring på tillbehör körtelceller transkriptome. SC nummer, morfologi och vakuolär innehåll har visat sig bero på manlig kost, parnings status och ålder21,25,26. Vi har fortfarande en begränsad förståelse för de genetiska vägarna inblandade och jämföra SC transkriptom i olika förhållanden skulle vara insiktsfulla. Detta snabba och relativt enkla protokoll kommer att möjliggöra sådana studier. Viktigt, denna metod tillåter isolera huvud celler från samma individer, och kan därför användas som det är att avgöra om genetiska och miljömässiga parametrar påverkar både tillbehörs körtel celltyper samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget avslöjande.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot medlemmarna i Karch Lab, till iGE3 Genomics plateform, till Flow Cytometry Core Facility vid universitetet i Genève, och till Dr Jean-Pierre Aubry-Lachainaye som sätter protokollet för FACS. Vi tackar Luca Stickley för hans hjälp med att visualisera läsningar på IGV. Vi tackar oss för ett skonsamt tillstånd att återanvända siffror och redaktörerna för att vi ska vara kreativa med att skriva.

Denna forskning finansierades av staten Genève (CI, RKM, FK), den schweiziska nationella fonden för forskning (www.snf.ch) (FK och RKM) och donationer från Claraz Foundation (FK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-wells Tissue Culture plate VWR 734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM BioStatus DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL Eppendorf
FACS Beckman Coulter MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum Gibco 10270-106 heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
MasterPure RNA Purification Kit Epicentre MCR85102
Nextera XT kit illumina https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000 Gilson
P20 Gilson
P200 Gilson
Papain 50U/mL stock
PBS home made
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit Agilent
Schneider’s Drosophila medium Gibco 21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit Takara https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX applied biosystems 4472942
Thermo Shaker Hangzhou Allsheng intruments MS-100
Tipone 1250 μL graduated tip Starlab S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip Starlab S1161-1800
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604013
Vortex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
  2. Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
  3. League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
  4. Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
  5. Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
  6. Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
  7. Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
  8. Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
  9. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
  10. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  11. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
  12. Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
  13. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
  14. Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
  15. Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
  16. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
  17. Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
  18. Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
  19. Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
  20. Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
  21. Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
  22. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  23. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  24. Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
  25. Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
  26. Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
  27. Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).

Tags

Genetik FACS cell dissociation celltyp specifikt RNA RNA-sekvensering Transkriptome sekundära celler tillbehörs körtel Drosophila reproduktion post parning svar huvudsakliga celler
Ett FACS-baserat protokoll för att isolera RNA från de sekundära cellerna i <em>Drosophila</em> manliga tillbehörs körtlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. … More

Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (151), e60218, doi:10.3791/60218 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter