Summary
Her presenterer vi en protokoll for å distansere og sortere en bestemt cellepopulasjon fra Drosophila mannlige tilbehør kjertler (sekundær celler) for RNA SEKVENSERING og RT-qPCR. Celle isolasjon oppnås gjennom FACS rensing av GFP-uttrykker sekundære celler etter en flertrinns-dissosiasjon prosess som krever disseksjon, proteaser fordøyelsen og mekanisk dispersjon.
Abstract
For å forstå funksjonen av et organ, er det ofte nyttig å forstå rollen til sine bestanddeler celle populasjoner. Dessverre gjør sjeldenhet av individuelle celle populasjoner ofte det vanskelig å få nok materiale for molekylær studier. For eksempel inneholder tilbehør kjertel av Drosophila mannlige reproduktive system to forskjellige sekretoriske celletyper. De viktigste cellene utgjør 96% av de sekretoriske cellene i kjertelen, mens de sekundære cellene (SC) utgjør de resterende 4% av cellene (ca 80 celler per hann). Selv om begge celletyper produserer viktige komponenter i sædvæsken, er det bare noen få gener som er kjent for å være spesifikke for SCs. Sjeldenhet av SCs har hittil hindret transcriptomic analyse studie av denne viktige celletypen. Her presenteres en metode som gjør det mulig å rense SCs for RNA-ekstraksjon og-sekvenser. Protokollen består i første dissekere kjertler fra fluer uttrykker en SC-spesifikk GFP reporter og deretter utsette disse kjertlene til protease fordøyelsen og mekaniske dissosiasjon å få individuelle celler. Etter disse trinnene, individuelle, levende, GFP-merkede celler sorteres ved hjelp av en fluorescerende aktivert celle Sorter (FACS) for RNA rensing. Denne prosedyren gir SC-spesifikke RNAs fra ~ 40 menn per betingelse for nedstrøms RT-qPCR og/eller RNA-sekvensering i løpet av en dag. Den hurtighet og enkelhet av prosedyren gjør det mulig for transcriptomes av mange forskjellige fluer, fra ulike genotyper eller miljømessige forhold, som skal fastsettes i løpet av kort tid.
Introduction
Organer består av flere celletyper, hver med diskrete funksjoner og noen ganger uttrykker svært forskjellige sett av gener. For å få en presis forståelse av hvordan et organ fungerer, er det ofte kritisk å studere hver distinkt celle type som utgjør dette organet. En av de viktigste metodene som brukes til å utforske mulige funksjonen er transcriptome analyse. Denne kraftige metoden gir et øyeblikksbilde av genuttrykket i en celle, for å avdekke aktive prosesser og trasé. Men denne typen analyser er ofte vanskelig for sjeldne celle populasjoner som må renses fra langt mer-rikelig nabokommunene celler. For eksempel er Drosophila mannlige tilbehør kjertel et organ bestående hovedsakelig av to sekretoriske celletyper. Som sjeldnere av de to celletyper består bare 4% av cellene i denne kjertel, bruk av en celle-type spesifikk transcriptome analyse ikke hadde blitt brukt til å bestemme funksjonen til disse cellene.
Tilbehør kjertler (AGs) er organer av den mannlige reproduktive tarmkanalen i insekter. De er ansvarlig for produksjon av de fleste proteiner av sædvæsken (SFP) og tilbehør kjertel proteiner (ACPs)). Noen av disse SFP er kjent for å indusere fysiologiske og atferdsmessige responser i paret kvinner, ofte kalt post-paring respons (PMR). Noen av PMR inkluderer: en økt eggløsning og egg-legging rente, lagring og frigjøring av sperm, en endring i kvinnelig diett, og en nedgang i kvinnelige mottakelighet til sekundære frieri menn1,2. Som insekter påvirker mange store samfunnsmessige spørsmål fra menneskers helse (som vektorer for dødelige sykdommer) til landbruk (insekter kan være skadevirkninger, men er avgjørende for pollinering og jord kvalitet), forståelse insekt reproduksjon er et viktig område for forskning. Studiet av AGs og ACPs har vært avansert betydelig med modellen organismen Drosophila melanogaster. Disse studiene har fremhevet rollen som AGS og noen av de enkelte proteiner som de produserer i å skape PMR, påvirker arbeidet i andre arter som sykdommen vektor Aedes aegypti3,4og andre insekter1 ,5. Videre, som AGS skiller bestanddelene av sædvæsken1,6 de er ofte tenkt på som funksjonell analog av pattedyr prostatakjertel og sæd vesicle. Denne funksjonen likheten kombinert med molekylære likheter mellom de to vev-typer, har gjort AGs en modell for prostatakjertel i fluer7.
Innenfor Drosophila hann, er det to fliker av tilbehør kjertler. Hver flik kan ses som en SAC-lignende struktur består av en monolag av sekretoriske celler rundt en sentral lumen, og innpakket av glatte muskler. Som nevnt ovenfor, er det to morfologisk, developmentally og funksjonelt distinkte sekretoriske celletyper som utgjør denne kjertel: de mangekantet-formede hoved cellene (utgjør ~ 96% av cellene), og de større, runde sekundære celler (SC) (gjør opp resterende 4% av celler, eller ca 40 celler per flik). Det har blitt vist at begge celletyper produsere distinkte sett med ACPs å indusere og vedlikeholde PMR. De fleste av dataene innhentet hittil markere rollen som et enkelt protein i utløser det meste av karakteristisk oppførsel av PMR. Dette proteinet, Sex peptid, er en liten, 36 amino acid peptid som skilles ut av de viktigste cellene8,9,10. Selv om sex peptid synes å spille en viktig rolle i PMR, andre ACPs, produsert av både de viktigste og sekundære celler, har også vist å påvirke ulike aspekter av PMR11,12,13,14 ,15,16,17. For eksempel, basert på vår nåværende kunnskap, SCs, via proteiner de produserer, synes å være nødvendig for opprettholdelse av SP signalering etter den første dagen18.
Gitt sjeldenhet av SCs (bare 80 celler per hann), all vår kunnskap om disse cellene og proteiner de produserer kommer fra genetikk og kandidat tilnærminger. Hittil har bare en relativt liten liste over gener blitt vist å være SC-spesifikk. Denne listen inneholder homeodomain protein defekt proventriculus (DVE)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 og 1921, CG1656 og CG1757511, 15,21 og homeobox transkripsjon faktor abdominal-b (Abd-b)18. Tidligere har vi vist at en mutant mangelfull for både uttrykk for Abd-B og lncRNA MSA i sekundære celler (IAB-6COCUD1 mutant) forkorter lengden på PMR fra ~ 10 dager til bare en dag12 , 18 av år , 20. dette fenotype synes å være forårsaket av feil lagring av SP i den kvinnelige reproduktive luftveiene12,18,20. På cellenivå, de sekundære cellene i denne mutant viser unormal morfologi, miste sine karakteristiske vacuole-lignende strukturer18,20,21. Ved å bruke denne mutant linjen, har vi tidligere forsøkt å identifisere gener involvert i SC funksjon ved å sammenligne transcriptional profilene til hele AGs fra enten vill type eller mutant tilbehør kjertler12. Også viste andre Labs at SC nummer, morfologi og vacuolar innhold avhengig av mannlig diett, mating status og alder21,25,26.
Selv om positiv fremgang ble gjort ved hjelp av disse tilnærmingene, en full SC transcriptome var langt fra oppnådd. Sjeldenhet av disse cellene i dette organet gjorde det vanskelig å utvikle seg videre selv fra ville type celler. For testing genuttrykk, endringer i disse cellene etter bestemte miljømessige stimuli ville bli enda vanskeligere. Således var det nødvendig med en metode for å isolere og rense SC RNA som var rask og enkel nok til å utføre under ulike genetiske bakgrunner og miljøforhold.
Både Abd-B og MSA gener krever en bestemt 1,1 kb Enhancer fra Drosophila Bithorax kompleks (kalt D1 Enhancer) for deres uttrykk i SCs18,20. Denne Enhancer har tidligere blitt brukt til å lage en GAL4 driver som, når den er assosiert med en UAS-GFP, er i stand til å drive sterke GFP uttrykk spesielt i SCs. Derfor brukte vi denne linjen som grunnlag for en FACS-protokoll for å isolere disse cellene fra både vill type og IAB-6cocuD1 AGS). Som IAB-6CocuD1 mutant SCs display en annen cellulær morfologi, viser vi at denne protokollen kan brukes til å isolere celler for fastsettelse av deres transcriptome fra denne sjeldne celletypen under svært forskjellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila linjer brukt og samling av hanner
- For denne protokollen, bruk menn uttrykker GFP i SCs og ikke de viktigste cellene. Her brukes en AbdB-GAL4- driver (beskrevet i referanse18), SAMAN med UAS-GFP (på Kromosom 2). Andre egnede drivere kan også brukes. For isolering av SCs under ulike muterte forhold, krysser du mutasjonen i linjer som inneholder SC-spesifikke GFP-linjen.
- Samle to grupper på rundt 25 friske, jomfru hanner for hver genotype og alder dem ved 25 ° c for 3-4 dager i hetteglass med fersk Drosophila mat.
Merk: Som alder, parring status, ernæring og sosialt miljø hver påvirker reproduktiv biologi, må strenge protokoller følges for å kontrollere for disse parametrene. Virgin menn er alderen for 3-4 dager etter puppestadiet eclosion ved 25 ° c med en 12 h/12 h lys/mørk syklus, på standard korn måltid-agar-gjær mat, i grupper på 20-25 menn per hetteglass.
2. løsninger og materiell forberedelse
-
Klargjør følgende løsninger.
- Forbered serum supplert medium (SSM): Schneider ' s Drosophila medium suppleres med 10% varme deaktivert fosterets storfe serum og 1% penicillin-Streptomycin.
- Forbered alikvoter av 1x Trypsin enzym (f.eks. TrypLE Express enzym) og oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered alikvoter av Papain [50 U/mL] (oppbevares ved-20 ° c og tint bare én gang).
- Forbered 1x fosfat buffer saltvann (PBS, lagret ved romtemperatur).
-
Forbered flere flamme avrundede Pipet Tupper for den fysiske dissosiasjon av tilbehørs kjertlene.
Merk: bruk lav oppbevaring tips for håndtering av tilbehør kjertler som de pleier å følge ubehandlet plast. Prosessen med flamme avrunding reduserer spiss åpningen og glatter kantene på tuppen. Dette sikrer en effektiv dissosiasjon etter peptidasespalting fordøyelsen uten klipping cellen membraner.- Skjær 1 200 μL spiss med et skarpt blad og pass den forsiktig over en flamme for å avrunde spissen slik at åpningen er bredere, men jevn for håndtering under trinn 3,7.
- Begrens åpningen av flere 1 000 μL-spisser ved å sende tuppen i nærheten av en flamme i mindre enn ett sekund. Roter tuppen litt for å unngå smelting eller tilstopping. Sorter tipsene som er laget fra smalere til bredere. Dette kan gjøres ved timing hastigheten på aspirasjon. Prøv å distansere en liten skala prøve av AGs for å teste effektiviteten til de smaleste tipsene.
Merk: Disse tipsene er avgjørende for mekanisk agitasjon (trinn 5,2 og 5,3). Kvalitet flamme-avrundet Pipet drikkepenger tillate for fullstendig dissosiasjon stund bevarer cellen levedyktighet. Som sådan er disse tipsene vaskes grundig med vann på slutten av prosedyren for gjenbruk. Dette gjør det mulig for dag til dag reproduserbar dissosiasjon.
3. Disseksjon av tilbehørs kjertler
- Sett 20 til 25 mannlige Drosophila i et glass parabolen på isen.
- Analysere 1 hann i SSM. Ta av seg reproduktive luftveiene og fjern tilbehøret kjertel par fra alle andre vev bortsett fra ejaculatory duct.
Merk: Fjern testiklene fordi den utgitte sperm kan opprette klumper og forstyrre dissosiasjon prosessen. Fjern ejaculatory pære, noe som gjør håndteringen vanskelig når det flyter. - Med tang, overføre tilbehør kjertler til en glassplate fylt med SSM ved romtemperatur. Gjenta trinn 3.2-3.3 20 ganger for å få en gruppe på 20 par kjertler i SSM.
Merk: Disse trinnene vil bli oppnådd i 15 til 20 min. AGs bør se frisk, og peristaltisk bevegelser av muskelen lag rundt kjertler bør være synlig. GFP kan overvåkes ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. - Overfør tilbehørs kjertlene til 1x PBS for en 1-2 minutters vask ved romtemperatur.
Merk: For bedre dissosiasjon, er det viktig å skylle kjertler med PBS. Varigheten av dette trinnet, men bør være begrenset som cellene viser tegn til stress i PBS; dissosiert sekundære celler i PBS raskt hovne opp og dø. - Fortynne 20 μL Papain [50 U/mL] i 180 μL av 1x Trypsin enzym for å oppnå den dissosiasjon løsningen (for å skalere opp eller ned beholde 9 μL av Trypsin enzym og 1 μL av Papain for hver hann). Med tang, overføre tilbehør kjertler til denne løsningen.
- Isoler tuppen av tilbehørs kjertlene (som inneholder sekundære celler) fra den proksimale delen. Bruk fine tang til å klype fast midt i en kjertel flik og skjær med den skarpe spissen av en andre tang. Fjern den proksimale delen av tilbehørs kjertlene og ejaculatory kanalen for å forbedre dissosiasjon og redusere celle sorterings tiden.
Merk: Dissekere den som kan fjernes fra 20 par kjertler vil ta 15 til 20 min og fordøyelse av peptidases vil dermed starte ved romtemperatur. - Etter at alle kjertel-spisser er dissekert, kan du overføre dem til en 1,5 mL tube ved hjelp av en spesiell 200 μL Pipet tupp klargjort på trinn 2.2.1. Det bør være bred, avrundet og våt før håndtering kjertler.
Merk: For å Pipet tilbehør kjertel vev, bør tipsene alltid være pre-vått med riktig løsning (Trypsin enzym eller SSM, holde en tube av hver for dette formålet). Skyll forsiktig tuppene mellom prøvene for å unngå forurensning.
4. vev fordøyelse
- Plasser microtube i en 37 ° c shaker for 60 min., rocking ved 1 000 rpm.
Merk: Både agitasjon og fordøyelse tid er avgjørende for vellykket dissosiasjon. Kortere eller svakt fordøyelse vil gi dårlig dissosiasjon, sannsynligvis fordi den ytre muskelen laget og indre viskøs banebrytende væske beskytte tilbehør kjertel celler fra peptidases. - Tilsett 1 mL SSM ved romtemperatur for å stoppe fordøyelsen og gå umiddelbart til trinn 5.
5. mekaniske dissosiasjon av cellene
- Ved hjelp av en bred avrundet 1 000 μL spiss, pre-vått med SSM, Overfør prøven til en 24-brønn plate. Monitor GFP fluorescens under mikroskopet: de fleste kjertel tips skal se intakt og noen SC skal være løsrevet.
- Ved hjelp av en avrundet smal Pipet tupp generert ved Step 2.2.2, Pipet opp og ned 3 til 5 ganger for å forstyrre tilbehøret kjertel vev.
Merk: Monitor fluorescens å sørge for at store vev patcher har blitt brutt opp. Gjenta trinn 5,2 Hvis dette ikke er tilfellet. - Ved hjelp av en svært smal avrundet Pipet spissen (generert ved Step 2.2.2), Pipet opp og ned 1-2 ganger.
Merk: Bare enkeltceller skal være synlige etter trinn 5,3. Det anbefales å bruke 24-brønn plater fordi de gjør det enkelt å overvåke prosessen. Når et par prøver ble behandlet og ga tilfredsstillende resultat (sunne sekundære celler perfekt dissosiert), pipettering trinnene vil bli utført i microtube. - Vent minst 15 min for å la cellene bosette seg på bunnen av brønnen og fjerne overflødig SSM å redusere sorterings tiden.
Merk: Å la celler bosette viste bedre enn alternative metoder som sentrifugering, og tillater en siste visuell inspeksjon av celler like før FACS. - Pipet cellene i en ren 1,5 mL rør og basseng identiske prøver (to grupper på 20 menn for hver tilstand). Skyll brønner med SSM å gjenopprette siste celler, og Pipet dem inn i røret (bruk et lite volum).
- I 1,5 mL mikrorør tilsett 300 μL av Cellelyse Rings løsning og 1 μL av proteinase K [50 μg/μL] (løsninger som finnes i RNA rense settet, se trinn 7). Forbered to rør for hver prøve (en for MCs og en for SCs).
6. FACS (fluorescens-aktivert Cell sortering)
- Legg levedyktighet markør til hver prøve som skal sorteres noen minutter før sortering (0,3 mM Draq7).
Forsiktig: Draq7 bør håndteres med forsiktighet. -
Sortere en homogen populasjon av levende sekundære celler (GFP-positive, Draq7-negative celler). I en annen microtube sorterer du en populasjon av hoved celler (mindre, GFP-negative, Draq7-negative celler). Bruk følgende FACS gating strategi:
Merk: sett celle sorterings trykket ved 25 psi og pass celler gjennom et 100 μm munnstykke. Sorterings hastigheten er rundt 2 000 celler/s.- Ekskluder rusk og velg total celler basert på FSC-SSC (figur 2E) for å utelukke rusk.
- Ekskluder døde celler. Opphisse Draq7 med en 640 NM laser og samle slippes ut fluorescens med en 795/70 band-pass filter. Gate Draq7-positive celler ut (figur 2F).
- Fjern doublets ved hjelp av en dobbel gating på SSC-H vs SSC-W og FSC-A vs FSC-H (figur 2H).
Merk: Ekskluder celle doublets strengt ved hjelp av doble gating, for å redusere hoved celle forurensning. - Sorter ~ 550 GFP-positive celler til en 1,5 mL microtube med lyseringsbuffer og proteinase K. Denne populasjonen anses sekundære celler (SC, figur 2G). Opphisse GFP på 488 NM og samle slippes fluorescens med en 526/52 band-pass filter.
- Sorter ~ 1 000 GFP-negative celler, homogen og liten i størrelse, til en 1,5 mL microtube med lyseringsbuffer og proteinase K. Denne populasjonen regnes som hoved celler (MC, figur 2G).
- Vortex alle prøvene.
Merk: Fra 40 hanner (~ 40 x 80 SC = 3 200 sekundære celler), 600 til 800 Live singlet sekundære celler er innhentet (rundt 20-25% henting). Stopp sortering rundt 550 SC og 1 000 MC å normalisere prøvene.
7. RNA-ekstraksjon
Merk: Vi brukte episenteret MasterPure RNA rensing kit for RNA-ekstraksjon, med følgende tilpasninger. Andre kits kan brukes så lenge avkastningen er høy nok til å forberede et bibliotek for sekvensering fra ~ 500 celler (2 ng RNAs ble brukt her).
- Heat prøver ved 65 ° c i 15 min og Vortex hver 5 min for å fullføre cellelyse.
- Plasser prøver på isen i 5 min. følg produsentens anbefalinger for nukleinsyre syrer Storm (deler "nedbør av total nukleinsyre syrer" og "fjerning av forurensende DNA fra total nukleinsyre acid preparater").
- Suspendere RNA pellet i 10 μL av RNase-Free TE buffer.
- Legg til RNase-hemmer (valgfritt).
- Lagre prøver ved-80 ° c.
8. kvalitetskontroller av RNA kvantitet, kvalitet og spesifisitet
- Beregn RNA-kvalitet og-konsentrasjon. På grunn av den lille volum og konsentrasjon, bruk RNA 6000 Pico chips her. God kvalitet RNA er definert som ikke-degradert, synlig som en lav Baseline med skarpe topper som tilsvarer rRNAs.
-
RT-qPCR til å kontrollere identiteten til sorterte celler
- Utfør omvendt transkripsjon med 2 ng av totalt RNAs bruke tilfeldige hexamers som primere. Utfør RT på sekundær celle RNA og hoved celle RNA.
Merk: cDNAs kan fortynnes, aliquoted og oppbevares frosset for senere bruk. - Utfør sanntid kvantitativ PCR bruker passende primer parene å kvantifisere housekeeping gener (Alpha-Tubulin, 18s rRNA), sekundær celle spesifikke gener (MSA, Rab19, Abd-B) og viktigste celle spesifikke genet (sex peptid).
- Utfør omvendt transkripsjon med 2 ng av totalt RNAs bruke tilfeldige hexamers som primere. Utfør RT på sekundær celle RNA og hoved celle RNA.
9. sekvensering (cDNA bibliotek forberedelse, sekvensering og data analyse)
- Bruk 2 ng av totalt RNAs å syntetisere cDNAs med polydT primere. Bruk smartere teknologi for å forsterke dem for forsterkning.
- Bruk et Nextera XT-sett til å klargjøre biblioteket.
- Sequence bruker multiplekset, 100 nukleotider enkelt leser sekvensering (selv om 50 nukleotider leser er hensiktsmessig for de fleste formål) å gi rundt 30 000 000 leser for hver prøve.
10. data analyse
- Kjør FastQC.
- Bruk stjernen aligner å kart det leser på UCSC dm6 Drosophila henvisning Genova og utvikle. Bam fil-størrelse. Bruk Integrative Genomics Viewer (IGV) til å visualisere leser på Genova leseren.
- Bruk HTSeq til å utføre gen tellinger.
- Bruk metoden trimmet Mean of M-verdier (TMM) til å normalisere genet teller22. Bruk edgeR å utføre statistisk analyse av differensial uttrykk, MA tomter og PCA.
- For genuttrykk analyse og statistikk, bruk generell lineær modell, kvasi-sannsynlighet F-test med falsk deteksjon rate (FDR) og Benjamini & Hochberg korreksjon (BH).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres her gjør det mulig for en eksperimentator å isolere sekundære celler fra Drosophila mannlige tilbehør kjertler og å trekke ut sin RNA i løpet av en enkelt dag (figur 1).
Vi bruker Abd-B-GAL4 konstruere18 til Label sekundære celler (SC), men ikke hoved celler (MC) med GFP (figur 2A). Et mål med denne prosedyren er å få den ville typen transcriptome av SCs (vill type er skrevet med invertert komma siden de er innhentet fra transgene fluer uttrykke GFP og GAL4). Et annet mål er å få SC RNA gjennom en rask og enkel prosedyre som gjør det mulig å studere deres genuttrykk under ulike forhold. Derfor utførte vi denne prosedyren med vill type og "IAB-6cocuD1" mutanter som bærer en 1,1 kb sletting fjerne Enhancer av ABD-B ansvarlig for SC uttrykk. Denne slettingen fjerner også arrangøren av MSA, en viktig transkripsjon for sekundære celler utvikling, morfologi og funksjon18,20 (figur 2B, C). Denne protokollen ble gjentatt tre ganger med 2 genotyper hver gang for å oppnå biologisk triplicates (heretter referert til som WT-1,-2,-3 for Wild-typen og D1-1,-2 og-3 for IAB-6-cocuD1).
Denne protokollen tillater MC og SC dissosiasjon fra Drosophila tilbehør kjertler i et par timer (figur 2D). Begge celle populasjoner sorteres deretter i to forskjellige rør for å isolere MCs og SCs. Den gating strategien for FACS er vist i figur 2E-2g. Draq7 gjør det mulig å estimere celle levedyktigheten rundt 70% for hele prøven (figur 2F). Singleter representerer over 90% av SC befolkningen, og over 80% av MC-befolkningen, som anslått av FSC-A vs FSC-H og SSC-H vs SSC-W. (se figur 2H). Dette reflekterer en effektiv dissosiasjon. Rundt 10% av sortering hendelser ble avbrutt fordi en annen celle eller rusk var til stede i samme FACS dråpe. Fra 40 menn, vi vanligvis samle 550 SCs og 1 000 MCs og deretter avbryte sortering. Fra 1 utvalg (av 6), kunne vi ikke nå 550 sekundære celler. Den WT-1 prøven ble dermed Hentet fra bare 427 SC men gitt RNA av lignende kvalitet og kvantitet som andre.
Celler sorteres i lyseringsbuffer (inneholder proteinase K). Så snart alle prøvene er klare, RNAs er Hentet fra hver celleprøve for å ha RNA pellets på slutten av dagen. Kvalitet og kvantitet av RNAs er estimert ved hjelp av en Bioanalyzer med en passende chip for å håndtere lave konsentrasjoner og små volumer. Fordi estimerte konsentrasjoner var variabel mellom prøvene (fra over 1 300 PG/μL ned til 344 PG/μL, se Figur 3A), justerte vi utgangsmaterialet for både RT-qPCR og cDNA bibliotek syntese til rundt 2 NG (målt konsentrasjoner er ikke svært nøyaktige). Vi kvantifisert uttrykk for konkrete gener ved sanntid qPCR på vill type MC og SC ekstrakter for å kontrollere identiteten til cellen populasjoner vi sortert. Figur 3 B viser genuttrykk som relativ quantifications normalisert til Alpha-tubulin Expression. Housekeeping gener som 18s rRNA og Alpha-tubulin oppdages i alle prøvene, som forventet. Tvert imot, SC genet Rab19 oppdages bare fra SC ekstrakter, og MC-genet sex peptid oppdages bare fra MC. Vi registrerer at Rab19 uttrykk i IAB-6cocuD1 mutant SC er lav i forhold til vill type SC, noe som tyder på at uttrykket av dette genet er påvirket av tap av Abd-B og MSA (konsekvent, den store Rab19-merkede vakuoler går tapt i IAB-6cocuD1 mutant21). Den sekundære celle-spesifikke transkripsjon MSA oppdages bare fra vill type SC og ikke fra MC, eller fra IAB-6cocuD1 SCS, som var ventet siden MSA promoter er slettet i denne mutant. Til sammen viser QCs vist i Figur 3 at RNAs innhentet gjennom denne protokollen ikke blir degradert, og at begge celle POPULASJONER (SC og MC) er vellykket sortert fra tilbehørs kjertler, både i vill-type og mutant forhold. Bare sekundære celler ' RNAs var sekvensert her, men Merk at denne prosedyren muliggjør samtidig transcriptome profilering av både SCs og MCs.
RNA-sekvensering ble realisert ved hjelp av standard prosedyrer. Her vil vi bare diskutere kvalitetskontroll analysene som er relevante for formålet med denne metoden. Når sekvenser er innhentet, leser er kartlagt til referansen Drosophila Genova, tilskrives gener, og normalisert. PCA (Principal Component Analysis) ble utført på 6 prøvene (3 vill type og 3 IAB-6cocuD1 replikerer). Så mye av variasjonen i dataene som mulig er gjort rede for i PC1, og så mye av den gjenværende variasjonen er beregnet for i PC2. Som vist i Figur 4A, replikerer The Wild type klynge tett sammen, og langt fra IAB-6cocuD1 prøver. Dette viser at WT prøvene er mer lik hverandre enn de er fra mutant seg. Dette illustrerer metoden reproduserbarhet og dens evne til å oppdage unormal genetisk program fra muterte sekundære celler. Mens D1-2 og D1-3 prøver klynge sammen, vi oppmerksom på at D1-1 prøven er ganske avvikende. Siden alle QCs for denne gjenskape er gode og sammenlignbare med alle andre replikerer, kan vi utelukke en prøveforberedelse problem (29 000 000 leser totalt, > 76% av disse align unikt til referansen Genova. Blant disse er > 77% tilskrives et gen, > 90% er mRNAs, og < 3% er rRNA). Dette forskjellene kan gjenspeile at genuttrykket i SC er ustabilt i IAB-6-cocuD, selv om testing av denne hypotesen ville kreve flere replikeres.
Visualisering leser justert til bestemte gener på Genova gir en visuell estimering av datakvaliteten. Figur 4 viser et utvalg av gener, med leser fra 1 representative replikere for hver genotype. Ikke overraskende, housekeeping gener som Act5C uttrykkes i begge genotyper (Figur 4B), samt SC-spesifikke gener Rab19 og DVE (Figur 4C, D). Mangelen på intronic leser bekrefter at polydT selektivt primet omvendt transkripsjon fra modne skjøtes mRNAs for cDNA biblioteket forberedelse. Spesielt kan vi se viktige og vesentlige variasjoner i uttrykket av konkrete gener mellom vill og cocuD1 . Dette er et forbilde på Figur 4E av MSA -genet som har et sterkt uttrykk i vill type som går tapt i IAB-6-cocuD1. MSA er presentert som et bevis på prinsippet om at denne metoden gjør det mulig å identifisere gener som er mis-regulert i muterte forhold. Dette vil bidra til å forstå fenotyper observert i dette mutant, og kan gi ny innsikt i normale sekundære celler funksjoner.
Figur 1: oversikt over protokollen. Viktige trinn i protokollen vises, med tidslinjen på høyre side. Denne fremgangsmåte innrømmer ettall igangsetting med bo Drosophila om formiddagen å ha dissosiert delaktig kjortelen celler av Noon, slag seg basert på GFP gjengivelsen, og bli deres RNAs utdraget av utgangen av arbeidsdagen. RNA-sekvenser og dataanalyser vil vanligvis ta noen uker. Dette tallet er endret fra referanse27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: isolere og sortering GFP-uttrykker sekundære celler. (A) konfokalmikroskopi bilde av ABD-B:GAL4 UAS-GFP tilbehør kjertel uttrykker GFP i sekundære celler (SC), men ikke i hoved celler (MC). Kjerner er farget med DAPI (blå). Prikkete hvit linje avgrenser AG fliker. ED er ejaculatory kanal. Hvite striper i øvre venstre hjørne er 50 μm skalaer. (B,C) Forstørret visning av tilbehørs delen med SC uttrykker GFP, i Wild type (B) og IAB-6cocuD1 (C) bakgrunn. (D) dissosiert celler ved lav forstørrelse under GFP kikkert. (E-H) FACS gating strategi for å rense SC og MC. røde prikker på alle paneler vist SCs som definert i panel (G). Først rusk er utelukket (E, Step 6.2.1) samt draq-7 positive døde celler (F, Step 6.2.2). GFP positive celler er valgt (SC) i tillegg til en homogen befolkning på GFP negative celler (MC) (G, trinn 6.2.4 og 6.2.5). Doublets er ekskludert fra både MC og SC befolkning (trinn 6.2.3, bare SSC-H vs SSC-W gating for SC er vist på 2h som eksempel). Dette tallet er endret fra referanse27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: QC på RNAs: kvalitet, kvantitet, og celle type spesifisitet. (A) kontroll av RNA-kvalitet og konsentrasjons estimering på PicoChip. De 25 NT Peak er kontrollen for kvantifisering. Lav Baseline indikerer lav degradering og de 2 store toppene er ribosomal RNAs. De tre prøvene som brukes til RT-qPCR vises, deres kvalitet er representative for alle RNA-prøver som brukes i denne studien, og deres estimerte konsentrasjoner reflekterer variasjonen i total RNA vi oppnådde mellom prøvene. (B) RT-qPCR demonstrere spesifisitet av sortering av sekundære celler (SC) og hoved celler (MC). Gene Expression kvantifisering er gjort ved hjelp av q = 2(40-cq) formel. Hver tre eksemplarer av hvert gen i hver tilstand er normalisert til gjennomsnittlig mengde Alpha-Tubulin RNA for å kompensere for total RNA-variasjon. Feilfelt viser standardavvik. WT betyr vill type og D1 refererer til IAB-6cocuD1 mutant. Dette tallet er endret fra referanse27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: QC på RNA sekvensering data. (A) hovedkomponenter analyse (PCA) på WT-1,-2,-3 (grønne prikker) og D1-1,-2,-3 (blå PRIKKER) RNA sekvensering datasett. (B-E) Sekvensering leser kartlagt til Drosophila referanse Genova bruker IGV programvare. Bare ett representativt utvalg av hver genotype vises for klarhet sake (WT-1 og D1-2), og bare noen få spesifikke Loci vises. Gene navn er skrevet på toppen av hvert panel, > og < symboler refererer til deres orientering. Tall i parentes representerer for hvert spor skalaen for antall leser per DNA base pair. Denne skalaen er den samme for begge forholdene for et gitt gen, men varierer mellom gener for bedre visualisering. Blå stolper nederst på hvert panel viser gener ' introns (tynn linje), exoner (bred linje) og ORF (rektangler med > >). Merk at Rab19 og Arl5 overlapper hverandre, konvergent gener (C). Dette tallet er endret fra referanse27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primere brukt for RT-qPCR i denne studien: | ||
| Mål genet | Forover primer | Omvendt primer |
| Alpha-Tubulin | TTTTCCTTGTCGCGTGTGAA | CCAGCCTGACCAACATGGAT |
| 18S rRNA | CTGAGAAACGGCTACCACATC | ACCAGACTTGCCCTCCAAT |
| Rab19 | CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC | TTGGAAAAGGAAGACCGCTTG |
| Kjønn peptid | GGAATGGCCGTGGAATAGGA | TAACATCTTCCACCCCAGGC |
| Msa | CTCATCTGCGTCTTCGCGTG | CAGCTCCGTTTGTAATCTCTCGAGC |
Tabell 1: grunning sekvens
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder for celle dissosiasjon fra Drosophila vev som imaginal plater er allerede beskrevet23. Våre forsøk på å bare bruke disse prosedyrene på tilbehør kjertler mislyktes, oppmuntre oss til å utvikle denne nye protokollen. Protease fordøyelsen og mekaniske trituration var kritiske skritt vi feilsøkt for suksessen til prosedyren, og vi plasserte dermed mange notater i seksjonene 2 til 5 for å hjelpe forskere med å oppnå tilfredsstillende resultater. For dissosiasjon å være vellykket, må peptidases nå tilbehøret kjertel celler, som er beskyttet av tyktflytende sædvæsken i lumen og muskelen lag rundt kjertel. Dissekere av kjertlene var dermed kritisk (trinn 3,6). Også fordøye for 60 min minst med kraftig risting (trinn 4,1) var nødvendig. Skånsom dissosiasjon med Trypsin oppløsning (f. eks TrypLE) bevart kjertel integritet og celle levedyktighet til mekaniske dissosiasjon. Tillegg av enten Papain eller kollagenase i forbindelse med Trypsin løsning forbedret dissosiasjon (perfekt dissosiasjon ble oppnådd med færre pipettering, noe som resulterer i bedre celle overlevelse). Men ingen av disse enzymene var tilstrekkelig til å distansere cellene på egenhånd. Pipettering ved hjelp av avrundede smale tips generert delvis 2.2.2 er et viktig trinn for denne metoden. Derfor bør denne trituration (trinn 5.2-5.3) optimaliseres i småskala eksperimenter for å velge den beste kombinasjonen av tips (se merknad i trinn 5,3).
Benytter denne protokollen, ettall ville være i stand til isolere 500 å 800 bo sekundær celler fra 40 hanndyr. Dette representerer ~ 20% (± 5%) utvinning vurderer 3 200 SC som utgangspunkt materiale (40 hanner x 80 SC). 20% effektivitet var høy nok for RNA sekvensering siden vi kunne behandle flere prøver på en dag. Dette kan imidlertid forbedres ved flere metoder, blant annet: arbeide i større grupper; gjør trituration i fordøyelsen røret og hoppe trinn 5,4 for å redusere overføringer; triturating veldig forsiktig (noen dissosiert GFP + celler dør kort tid etter trinn 5,3); forkorte perioden mellom dissosiasjon og FACS; redusere fordøyelsen tid ved hjelp av Trypsin løsning ved høyere konsentrasjon; bruker mindre strenge parametre for singlet utvalg (trinn 6.2.3) og avbrutt sortering. En begrensning av denne protokollen er at det tar flere timer å isolere celler; Derfor er det ikke egnet til å studere svært forbigående gen endringer. Med denne protokollen kan 4 x 20 menn behandles av en enkelt person (med opplæring) i en morgen, slik at RNA-ekstraksjon fra SC på to ulike forhold i 1 dag (figur 1). Spesielt, mer forskere kan delta i tilbehøret kjertler samling (trinn 3.1-3.3) for å behandle flere prøver på samme dag. Trinn 3,4 og framover vil imidlertid fortrinnsvis utføres av samme person for å maksimere reproduserbarhet.
Sekundære celler utfører viktige funksjoner for mannlig fekunditet12,20,24, men det fullstendige bildet av genene de uttrykker for å oppfylle denne rollen, mangler fortsatt. Her beskriver vi hvordan du skaffer transcriptome av disse cellene fra et relativt lite antall fluer, slik at sammenligning av genuttrykk i SC i ulike forhold. Her ble en mutant som påvirker SC-funksjonen og morfologi brukt, og viktige endringer i transcriptome er synlige. Denne metoden kan dermed bidra til å identifisere nye SC gener nødvendig for deres funksjon. Til vår kunnskap, den eneste alternative metoden for å få SC transcriptome ble utført i laboratoriet vårt ved manuell plukking av SCs. god kvalitet RNA sekvensering data ble innhentet, men prosedyren var for arbeidsintensiv skal utføres i flere forhold. Vi vil sammenligne våre SC RNAseq datasett og analysere deres biologiske mening om SC biologi i en distinkt papir (i forberedelse).
I fremtiden vil denne teknikken ikke bare kaste lys på vill type SC transcriptome, men også gjøre det mulig å studere virkningen av miljø eller gen endring på tilbehøret kjertel celler transcriptome. SC nummer, morfologi og vacuolar innhold har vist å være avhengig av mannlig diett, paringsstatus og alder21,25,26. Vi har fortsatt en begrenset forståelse av den genetiske veier involvert og sammenligne SC transcriptomes i ulike forhold ville være innsiktsfull. Denne raske og relativt enkle protokollen vil muliggjøre slike studier. Viktigere, denne metoden gjør det mulig å isolere hoved celler fra de samme individene, og kan dermed brukes som det er å avgjøre om genetiske og miljømessige parametre påvirker både tilbehør kjertel celletyper samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløring.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til medlemmene av Knut Thorbjørn laboratoriet, til iGE3 Genomics plattform, til Flow flowcytometri kjerne anlegg ved Universitetet i Genève, og til Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye som satte protokollen for FACS. Vi takker Luca Stickley for hans hjelp med å visualisere de leser på IGV. Vi takker oss for milde tillatelse til å gjenbruke tall, og redaktørene for å spørre oss om å være kreativ med å skrive.
Denne forskningen ble finansiert av staten Genève (CI, RKM, FK), den sveitsiske National Fund for Research (www.snf.ch) (FK og RKM) og donasjoner fra Claraz Foundation (FK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
